白介素-17 在自身免疫性肝炎中的作用及其機(jī)制研究*

余海靜 黃加權(quán) 劉 陽(yáng) 余世敏 張建軍△

1.湖北省中山醫(yī)院肝病科(湖北 武漢，430033) 2.華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院感染科 3.華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院耳鼻咽喉科

AIH 是一種慢性炎癥性肝臟疾病。主要特點(diǎn)為:女性易患，界面性肝炎，轉(zhuǎn)氨酶升高，循環(huán)中存在自身抗體，高γ-球蛋白血癥，具有免疫易感背景，常伴有肝外自身免疫綜合征，盡管用免疫抑制劑進(jìn)行治療仍會(huì)進(jìn)展成肝硬化，甚至導(dǎo)致肝衰竭［1］。AIH 是難治性肝炎，目前存在病因不明、診斷標(biāo)準(zhǔn)復(fù)雜、容易復(fù)發(fā)和預(yù)后不良等問(wèn)題，并且治療上長(zhǎng)期使用糖皮質(zhì)激素或者免疫抑制劑都需要經(jīng)過(guò)縝密思考、權(quán)衡利弊，并注意隨訪觀察，給臨床工作帶來(lái)諸多不便。AIH 的發(fā)病機(jī)制尚不清楚，有研究表明與遺傳和環(huán)境因素有關(guān)，針對(duì)于宿主肝臟抗原的免疫反應(yīng)也被認(rèn)為是肝臟損傷的主要機(jī)制［1］。T 淋巴細(xì)胞在AIH 的免疫機(jī)制中發(fā)揮了重要的作用［2］。目前，AIH 的發(fā)病機(jī)制正成為全世界科學(xué)家日益關(guān)注的課題。

近年來(lái)，一種新型的輔助T 細(xì)胞亞型Th17 細(xì)胞被發(fā)現(xiàn)，Th17 細(xì)胞主要分泌IL-17A、IL-17F、IL-21、IL-22 和IL-6，它通過(guò)分泌IL-17 和IL-22 等細(xì)胞因子參與機(jī)體的抗感染機(jī)制［3，4］。新近有研究表明Th17 細(xì)胞在變態(tài)反應(yīng)性疾病及某些自身免疫性疾病中起重要作用［5～7］。另一方面，Th17 細(xì)胞潛在的促炎癥作用導(dǎo)致了肝損傷。在人和小鼠的肝臟炎癥損傷中均可見到IL-17 的表達(dá)。IL-17 是Th17 細(xì)胞分泌的主要細(xì)胞因子，也是其執(zhí)行主要生物功能的主要細(xì)胞因子。其對(duì)中性粒細(xì)胞有強(qiáng)大趨化作用，在介導(dǎo)炎癥反應(yīng)、自身免疫性疾病、腫瘤、移植排斥反應(yīng)等過(guò)程中發(fā)揮重要作用。鑒于此，我們開展了對(duì)IL-17 在AIH 中作用機(jī)制研究。

1 材料與方法

1.1 臨床資料 12 例AIH 患者均為2008年8 月-2009年9月在華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院感染科住院及門診患者，其中女10 例，男2 例，女性占83.3%;平均年齡(45.3 ± 8.1)歲;ALT (67.6 ± 48.5)U/L;AST (97.0 ±47.0)U/L;TBil (59.4 ± 32.7)μmol/L;DBil (45.1 ±26.8)μmol/L;抗核抗體(ANA)為100%;抗肝腎微粒體抗體(LKM1)占80%;抗平滑肌抗體(SMA)占20%。所有患者的診斷均符合1999年國(guó)際AIH 小組修訂的AIH 診斷積分系統(tǒng)中的診斷標(biāo)準(zhǔn)［8］。健康對(duì)照者來(lái)自于同濟(jì)醫(yī)院感染科健康志愿者和體檢者。其中女10 例，男2 例，女性占83.3%;平均年齡(39.7 ±3.1)歲。ALT (23.4 ±5.0)U/L、AST (23.1 ±5.2)U/L、TBil (13.3 ±5.5)μmol/L、DBil(4.0 ±1.4)μmol/L，ANA 為5%，LKM1 和SMA 為0。所有標(biāo)本收集均在患者知情同意的情況下進(jìn)行，并簽署相關(guān)的《知情同意書》。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 6～8 周齡C57BL/6 雄性小鼠(購(gòu)于中科院上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心)，體重18～22 g 。實(shí)驗(yàn)期間小鼠于IVC(智能型獨(dú)立送回風(fēng)凈化籠具)條件下飼養(yǎng)。本動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究經(jīng)過(guò)華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 實(shí)時(shí)定量PCR 方法檢測(cè)PBMC 中IL-17 的表達(dá) ①PBMC 的分離及保存:收集健康對(duì)照組人員及AIH 患者(肘靜脈取)外周血2～4ml，肝素鈉抗凝;加入等體積PBS 混勻;在無(wú)菌15ml 離心管中加入與外周血等體積的人淋巴細(xì)胞分離液(購(gòu)自上海國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)，然后沿管壁緩慢將稀釋后的血液加到淋巴細(xì)胞分離液上(注意:勿打動(dòng)液面);室溫離心，2 000rpm ×20min;用毛細(xì)管吸取血漿與淋巴細(xì)胞分離液之間的PBMC 薄層(帶入上下層液體盡量少，以免混入其他細(xì)胞);加入(吸出液)5 倍體積的PBS，混勻。室溫離心，1 700rpm ×10min，棄上清液;加入2ml PBS，混勻，室溫離心1 000rpm ×5min，棄上清液;重復(fù)1 次，再加入適量PBS，吹勻，計(jì)數(shù)，然后將細(xì)胞濃度調(diào)至1 ×107/ml。②檢測(cè)IL-17 的表達(dá):1μg PBMC 中總RNA 使用高保真逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Fermentas)逆轉(zhuǎn)錄成20μl 的cDNA，然后取2μl 的cDNA 稀釋10 倍，使用SYBR Green I 摻入法進(jìn)行QRT-PCR，退火溫度均為60℃?；虻谋磉_(dá)水平用看家基因GAPDH 進(jìn)行矯正。mRNA 相對(duì)值計(jì)算公式:mRNA 相對(duì)值=IL-17 mRNA 測(cè)得值/相應(yīng)GAPDH mRNA 測(cè)得值。使用的引物序列及其產(chǎn)物片斷大小參見表1。

表1 引物序列及其產(chǎn)物片斷大小

1.3.2 動(dòng)物模型的建立 50 只小鼠隨機(jī)分為2 組:模型組和對(duì)照組，各25 只。同種系小鼠的肝臟經(jīng)過(guò)超聲破碎后超速離心，其上清液含肝抗原(S-100)。新鮮制備的0.5ml S-100肝抗原與等體積的弗氏完全佐劑(CFA)充分乳化后，分別在第1d 和第7d 經(jīng)腹腔注射入模型組小鼠體內(nèi)造模;而對(duì)照組小鼠則用生理鹽水與CFA 充分乳化后予以腹腔注射。在第二次免疫注射后的第14d 將兩組小鼠處死。摘眼球取血，檢測(cè)小鼠血清中ALT 變化。并采集其肝臟組織標(biāo)本。

1.3.3 模型組小鼠的中和試驗(yàn) 在造模成功后第10d，對(duì)8只模型組小鼠尾靜脈注射IL-17 中和抗體 (a-IL-17，clone 50104.11;R＆D Systems，Abingdon，UK)1 次;另8 只尾靜脈注射同型對(duì)照抗體小鼠IgG2a (clone R35-95;BD Biosciences Europe，Erembodegem，Belgium)1 次。注射液體量均為200μl。

1.3.4 觀察小鼠肝臟病理學(xué)變化 用4%多聚甲醛固定肝臟并石蠟包埋、切片。切片行蘇木精-伊紅染色。肝臟損傷程度分級(jí)如下:0 級(jí)，正常;1 級(jí)，少量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)和散在點(diǎn)狀肝細(xì)胞壞死;2 級(jí)，中度肝臟損傷伴有炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)和肝細(xì)胞局灶壞死;3 級(jí)，門靜脈及小葉間有廣泛的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)和大范圍肝細(xì)胞壞死。每個(gè)標(biāo)本選擇5 張切片進(jìn)行觀察分析，采用HM IAS-1000 高清晰度醫(yī)學(xué)圖文分析系統(tǒng)(武漢千屏醫(yī)學(xué)影像技術(shù)公司)進(jìn)行定量組織病理學(xué)分析，肝臟內(nèi)中性粒細(xì)胞數(shù)目以每平方毫米中性粒細(xì)胞個(gè)數(shù)表示(個(gè)/ mm2)(補(bǔ)充中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)方法)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。數(shù)據(jù)運(yùn)用t 檢驗(yàn)和方差分析，以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PBMC 中IL-17 的表達(dá) AIH 患者PBMC 中IL-17 的表達(dá)與健康對(duì)照者相比，其IL-17 mRNA 水平明顯升高(高于健康對(duì)照者上限10 倍以上，P ＜0.01)(如圖1 所示)。

2.2 小鼠血清中ALT 變化 分別檢測(cè)注射IL-17 中和抗體和同型對(duì)照抗體后的小鼠肝功能ALT。與同型對(duì)照抗體小鼠相比，注射IL-17 中和抗體小鼠血清ALT 水平明顯下降(如圖2所示)。

圖1 兩組人員PBMC 中IL-17 的表達(dá)情況

圖2 兩組小鼠血清ALT 檢測(cè)結(jié)果

2.3 小鼠肝臟病理組織學(xué)變化 造模成功后，分別用IL-17中和抗體及其同型對(duì)照抗體處理。取其肝臟組織標(biāo)本，觀察肝臟損傷程度，采用IL-17 中和抗體處理后的小鼠肝組織炎癥反應(yīng)主要分布在中央靜脈、肝血竇、小葉間動(dòng)脈和肝門靜脈周圍。炎癥細(xì)胞(主要為淋巴細(xì)胞以及少量的中性粒細(xì)胞)大量浸潤(rùn)，廣泛分布于中央靜脈周圍的肝血竇內(nèi)。而同型對(duì)照抗體處理的小鼠肝小葉結(jié)構(gòu)明顯破壞，出現(xiàn)肝細(xì)胞點(diǎn)狀壞死甚至碎片狀壞死(見插頁(yè)圖3a 所示)。而IL-17 中和抗體處理的小鼠，肝臟組織結(jié)構(gòu)基本保持完整，未見到明顯的變性及壞死，其肝臟炎癥變化程度明顯降低。(見插頁(yè)圖3b 所示)。

3 討論

本研究中，我們觀察到IL-17 在AIH 患者及模型小鼠發(fā)病中的重要作用。與健康對(duì)照者相比，AIH 患者PBMC 中IL-17 的水平顯著性升高。在AIH 小鼠模型中，我們用IL-17 中和抗體進(jìn)行干預(yù)后，可以看到小鼠肝功能(ALT)水平明顯下降，并且肝臟損傷程度明顯減輕。

最新報(bào)道顯示，在多種肝臟疾病中IL-17 表達(dá)量均顯著升高，并促進(jìn)肝臟多種細(xì)胞分泌細(xì)胞因子從而加劇肝損傷。新的研究表明分泌IL-17 的淋巴細(xì)胞亞型可能為CD4+T 淋巴細(xì)胞、CD8+T 淋巴細(xì)胞、NKT 細(xì)胞以及調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞(Treg 細(xì)胞)［9］。我們前期的研究發(fā)現(xiàn)，AIH 模型小鼠肝臟中IL-17 表達(dá)陽(yáng)性的細(xì)胞主要來(lái)源于匯管區(qū)浸潤(rùn)的炎性細(xì)胞，并且主要是淋巴細(xì)胞［10］。

盡管目前有研究表明在一些肝臟疾病中，IL-17 的表達(dá)是明顯增高的，但其在AIH 發(fā)病中的作用還鮮有報(bào)道。事實(shí)上，目前僅有一篇研究顯示在原發(fā)性膽汁性肝硬化小鼠中IL-17 是升高的。然而，相關(guān)的研究并沒(méi)有涉及到IL-17 在該疾病中的具體作用機(jī)制。我們的前期研究已經(jīng)證實(shí)了IL-17 在抗原誘導(dǎo)的肝臟炎癥細(xì)胞的募集中起了關(guān)鍵作用。并且，本研究顯示IL-17 中和抗體能減輕肝臟損傷。表明了IL-17 導(dǎo)致了AIH 的發(fā)生。迄今為止，關(guān)于IL-17 阻斷的具體機(jī)制仍有待于進(jìn)一步探討。在其他慢性炎癥性疾病中，已有研究證實(shí)IL-17 能吸引中性粒細(xì)胞，并且抑制嗜酸性粒細(xì)胞的浸潤(rùn)，且使樹突狀細(xì)胞失活。然而，在該模型中IL-17 導(dǎo)致了AIH 的發(fā)生的作用機(jī)制尚需進(jìn)一步深入研究。

總之，IL-17 在AIH 的肝臟損傷中起了重要的作用。AIH小鼠模型中，IL-17 中和抗體能顯著性減輕小鼠肝臟組織中炎癥反應(yīng)。但其具體的作用機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。而這為AIH 的治療提供了潛在的治療方法，也即提供了更為廣闊的思路。

［1］Vergani D，Longhi m S，Bogdanos D P，et al.Autoimmune hepatitis［J］.Semin Immunopatho，2009，31 (3):421 -435.

［2］Lchiki Y，Aoki C A，Bowlus C L，et al.T cell immunity in autoimmune hepatitis ［J］.Autoimmunity Reviews，2005，4 (5):315 -321.

［3］WilSon N J，Boniface K，Chan J R，et al.Development cytokine profile and function of human interleukin 17-producing helper T cells ［J］.Nat.Immunol，2007，89 (9):950 -957.

［4］Nakae S，Komiyama Y，Nambu A，et al.Antigen-specific T cell sensitization is impaired in IL-17-deficient mice，causing suppression of allergic cellular and humoral responses ［J］.Immunity，2002，17(3):375 -387.

［5］Hashimoto T，Akiymam K，Kobayashi N，et al.Comparison of IL-17 production by helper T cells among atopic and nonatopic asthmatics and control subjects ［J］.Int Arch Allergy Immunol，2005，137 (Suppl 1):51 -54.

［6］Molet S，Hamid Q，Davoine F，et al.IL-17 is increased in asthmatic airways and induces human bronchial broblasts to produce cytokines［J］.J Allergy Clin Immunol，2001，108 (3):430 -438.

［7］Wakashin H，Hirose K，Maezawa Y，et al.IL-23 and Th17 Cells enhance Th2 cell-mediated eosinophilic airway inflammation in mice ［J］.Am J Respir Crit Care Med，2008，178 (10):1023 -1032.

［8］Alvarez F，Berg Pa，Bianhchi Fb，et al.Internation Autoimmnue Hepatitis Group Report review of criteria for diagnosis of auto mmune hepatitis ［J］.Hepatology，1999，31 (5):929 -938.

［9］Lemmers A，Moreno C，Gustot T，et al.The Interleukin-17 pathway is involved in human alcoholic liver disease ［J］.Hepatology，2009，49(2):646 -657.

［10］余海靜，黃加權(quán)，艾國(guó)，等.IL-17 在小鼠自身免疫性肝炎中的表達(dá)及其意義［J］.華中科技大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版)，2010，39(3):311 -313.