硒對人神經(jīng)母細胞瘤細胞β-淀粉樣蛋白表達影響

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(1 青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院特需保健科，山東 青島 266003； 2 大連醫(yī)科大學(xué)； 3 青島市市立醫(yī)院)

阿爾茨海默病(AD) 是以進行性認知功能障礙和行為損害為特征的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性病變。其主要的組織病理學(xué)特點是β-淀粉樣蛋白(Aβ) 在神經(jīng)細胞外聚集沉淀形成老年斑以及tau 蛋白過度磷酸化造成微管損傷和神經(jīng)纖維纏結(jié)。4-羥基壬烯酸(HNE)是氧化應(yīng)激的一個重要指標，它的大量積累是神經(jīng)退行性疾病(如AD、帕金森病)的一項病理特征[1]。硒是人體必需的微量元素之一。缺硒時腦硒含量所維持的時間遠遠長于其他任何器官，腦也是最后一個出現(xiàn)缺硒現(xiàn)象的器官[2-3]。研究結(jié)果顯示，硒缺乏與AD密切相關(guān)，AD病人硒的攝入與正常人相比明顯偏低，且血清、紅細胞和指甲中硒含量也明顯降低[4]。本研究應(yīng)用不同濃度的亞硒酸鈉對人神經(jīng)母細胞瘤細胞進行處理，旨在探討硒對Aβ產(chǎn)生的影響?，F(xiàn)將結(jié)果報告如下。

1 材料與方法

1.1 細胞培養(yǎng)

人神經(jīng)母細胞瘤細胞(SH-SY5Y)和穩(wěn)定表達淀粉樣前體蛋白(APP)的人神經(jīng)母細胞瘤細胞(SH-SY5Y/swAPP)購于上海細胞庫。將兩種細胞置于含體積分數(shù)0.06的CO2、37 ℃孵箱中培養(yǎng)6～8 d。

1.2 酶活性的測定

將SH-SY5Y細胞首先用不同濃度的亞硒酸鈉(0、50、100和200 nmol/L)處理24 h，接著再用10 μmol/L的HNE處理24 h后收獲細胞。采用直接熒光法，用連有報告分子EDANS和DABCYL具有酶特異性的肽段檢測α-、β-、γ-分泌酶活性，操作按說明書步驟進行。試劑盒購自R&D System公司。

1.3 Aβ的檢測

將SH-SY5Y或者SH-SY5Y/swAPP細胞先用不同濃度亞硒酸鈉處理24 h，接著用10 μmol/L HNE處理24 h，然后在4 ℃下以14 000 r/min離心10 min，取100 μL樣品用于酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)。用human β-amyloid 1-40/1-42 ELISA試劑盒(購自美國Bio Source公司)檢測SH-SY5Y/swAPP細胞中的Aβ-40和Aβ-42。用雙抗體夾心ELISA試劑盒(美國IBL公司)檢測SH-SY5Y細胞中的分泌型β-淀粉樣蛋白(sAPPβ)。操作按說明書步驟進行。

1.4 淀粉蛋白前β位分解酶1(BACE1)蛋白檢測

將SH-SY5Y細胞先用不同濃度的亞硒酸鈉處理24 h，然后用10 μmol/L的HNE處理6 h。采用Western Blotting 方法，用ECL蛋白質(zhì)印跡檢測系統(tǒng)檢測BACE1蛋白，按說明書進行操作。

1.5 BACE1 mRNA的檢測

用RNA提取試劑盒(美國Invitrogen公司)提取SH-SY5Y細胞中RNA，按照說明書合成cDNA(試劑盒購自美國Promega公司)，采用Real-time PCR(試劑盒購自Takara公司)進行DNA的擴增。用于BACE1擴增的引物序列如下：正向5′-GCCAAGAAAGATGTTTGAAGCT-3′，反向5′-GCCAGAAACCATCAGGGAACT-3′。用于β-肌動蛋白擴增引物序列為：5′-AGGCCAACCGCGAGAA-G-3′，5′-ACGCCTGGATAGCAACGTACAT-3′。具體操作按說明書進行。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 亞硒酸鈉對HNE處理后細胞中α-、β-、γ-分泌酶活性的影響

亞硒酸鈉可以降低β-、γ-分泌酶活性，表現(xiàn)出劑量依賴性(F=31、16，P<0.05)，但亞硒酸鈉對α-分泌酶活性沒有影響(P>0.05)。見表1。

2.2 亞硒酸鈉對HNE介導(dǎo)Aβ表達的影響

經(jīng)亞硒酸鈉預(yù)處理，由HNE介導(dǎo)的sAPPβ表達明顯降低(F=56，P<0.01)；亞硒酸鈉預(yù)處理也能夠明顯降低由HNE介導(dǎo)的Aβ-40和Aβ-42的表達(t=13、12,P<0.01)。見表2。

2.3 亞硒酸鈉對HNE處理后BACE1表達的影響

HNE介導(dǎo)的BACE1蛋白和mRNA表達受到了亞硒酸鈉的影響而顯著下調(diào)(F=9 161、213，P<0.01)。見表3。

亞硒酸鈉濃度(c/nmol·L-1)α-分泌酶β-分泌酶γ-分泌酶 0100.0±6.4100.0±3.4100.0±11.750104.0±6.896.6±5.288.3±6.7100112.0±4.886.2±6.683.3±9.0200113.3±8.182.8±6.976.7±10.0

表2 亞硒酸鈉對HNE介導(dǎo)的sAPPβ、Aβ-40、Aβ-42表達的影響

亞硒酸鈉濃度(c/nmol·L-1)BACE1蛋白HNE(-)HNE(+)BACE1 mRNAHNE(-)HNE(+) 0100.0±0.8131.4±1.5100.0±0.1287.0±7.350101.4±1.777.1±1.6108.7±21.2113.0±2.310097.1±2.284.3±1.991.3±17.3147.8±19.2200111.4±1.540.0±0.9104.3±16.5160.9±34.6

3 討 論

AD的臨床改變主要與大腦皮質(zhì)及邊緣神經(jīng)系統(tǒng)的退行性改變有關(guān)，如海馬和新皮質(zhì)的彌散性神 經(jīng)元缺失、細胞內(nèi)神經(jīng)纖維纏結(jié)及細胞外淀粉斑沉積和神經(jīng)元末梢變性[5]。Aβ在神經(jīng)細胞外聚集沉淀是AD的重要病理特征之一；tau 蛋白過度磷酸化所造成的微管損傷及神經(jīng)纖維纏結(jié)是AD的另一重要病理特征。流行病學(xué)研究還顯示，低教育程度、膳食因素、女性雌激素水平降低、高糖血癥、高膽固醇血癥、高同型半胱氨酸血癥、血管因素、心理社會因素等均與AD相關(guān)。

BACE1是產(chǎn)生Aβ的限速酶，其活性水平?jīng)Q定APP的代謝途徑。BACE1是一類天冬氨酰蛋白酶，其基因定位于人染色體11q23.2，全長共2 526個堿基對，包含9個外顯子。Aβ是老年斑的主要組成成分，它的過量產(chǎn)生及聚集是導(dǎo)致AD發(fā)病的主要原因。Aβ由Ⅰ型跨膜的APP經(jīng)分泌酶水解代謝產(chǎn)生。分泌酶按作用位點可分為α-、β-和γ-等3種，Aβ由β-和γ-分泌酶依次水解APP而產(chǎn)生，具有毒性[6]；α-和γ-分泌酶依次水解APP，產(chǎn)生的可溶性sAPPα肽和P3肽段則具有神經(jīng)營養(yǎng)等作用。若APP的α-和β-代謝失去平衡，產(chǎn)生過多的Aβ，就容易誘發(fā)AD。目前，可以減少Aβ產(chǎn)生的藥物的研究不多。周麗蘋等[7]的研究表明，人參皂苷Rg1可以阻斷Aβ25-35所致小鼠海馬神經(jīng)元損傷，具有神經(jīng)保護作用。

脂質(zhì)過氧化水平的升高是AD發(fā)生的早期改變，其主要產(chǎn)物HNE對神經(jīng)元具有毒性作用[8-9]。HNE的神經(jīng)毒性可以直接攻擊蛋白質(zhì)，引起酶活性減弱、基因突變以及細胞代謝紊亂，最終導(dǎo)致細胞死亡[10]。同時，HNE也可通過對膜脂質(zhì)過氧化介導(dǎo)的DNA繼發(fā)性損傷或DNA的直接損傷引起神經(jīng)細胞凋亡[11]。HNE和Aβ的產(chǎn)生具有相互促進的關(guān)系，Aβ 本身能誘導(dǎo)神經(jīng)細胞膜脂質(zhì)過氧化和產(chǎn)生HNE，反過來，培養(yǎng)的神經(jīng)細胞暴露于HNE，其BACE1 表達增高，從而裂解APP 生成Aβ[12-13]。

硒是人體所必需的微量元素之一。以往調(diào)查顯示，長期處于低硒水平地區(qū)的人群與低認知功能相關(guān)聯(lián)[14]。然而，硒與AD關(guān)系的研究結(jié)果仍存在分歧，部分研究顯示，硒缺乏與AD的發(fā)病密切相關(guān)，補充含硒混合物可以改善認知功能[4,15]；另有研究顯示，AD病人與健康對照的腦脊液和血清中硒水平?jīng)]有明顯差異，AD病人海馬區(qū)或腦杏仁核區(qū)硒水平顯著升高，硒水平與AD病人腦脊液中的Aβ-42水平無關(guān)[16-18]。多數(shù)實驗結(jié)果表明，硒和硒蛋白與Aβ產(chǎn)生和脂質(zhì)過氧化密切相關(guān)，硒缺乏的直接后果是硒蛋白的產(chǎn)生減少，抗氧化應(yīng)激能力降低，進而使細胞發(fā)生氧化應(yīng)激并促進AD的形成[19]。tau蛋白過度磷酸化是AD發(fā)病的機制之一，PP2A為絲氨酸和蘇氨酸特異性磷酸酯酶，它在保持和調(diào)節(jié)tau蛋白磷酸化平衡中發(fā)揮關(guān)鍵作用[20]。PP2A活性與人腦中tau蛋白的磷酸化水平呈負相關(guān)，含硒化合物能提高PP2A活性，通過降低tau蛋白的過度磷酸化而減少神經(jīng)纖維纏結(jié)[21]。

本研究結(jié)果顯示，亞硒酸鈉能夠顯著降低由HNE誘導(dǎo)的β-和γ-分泌酶的活性，從而減少由分泌酶途徑產(chǎn)生的Aβ，但亞硒酸鈉對α-分泌酶的活性沒有影響；并且亞硒酸鈉也可直接減少由HNE誘導(dǎo)的sAPPβ和Aβ的產(chǎn)生；此外，亞硒酸鈉也可抑制由HNE誘導(dǎo)的BACE1的表達，進一步減少Aβ的產(chǎn)生。本文結(jié)果為應(yīng)用硒化合物限制Aβ的產(chǎn)生從而治療AD提供了理論基礎(chǔ)。

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