IL-10-592位點基因多態(tài)性與兒童EV71腦炎易感性關(guān)系

，，

(青島大學附屬醫(yī)院兒內(nèi)科，山東 青島 266003)

腸道病毒71型(EV71)屬小RNA病毒科[1]，主要引起手足口病，大多數(shù)病情輕微，具有自限性。EV71與腸道病毒家族其他成員相比，具有明顯的嗜神經(jīng)性，易引起無菌性腦膜腦炎、腦干腦炎、腦炎等中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病，嚴重者可致肺水腫、肺出血危及病兒生命[2-3]。自1969年首次報道以來，在世界范圍內(nèi)已引起多次爆發(fā)和流行[4]，嚴重威脅兒童健康。目前對于EV71致感染的機制，尤其中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染的遺傳易感因素尚未明確。白細胞介素10(IL-10)可抑制炎癥遞質(zhì)的產(chǎn)生，具有強有力的免疫及炎癥抑制功能，在多種病毒感染的發(fā)生發(fā)展中起著重要的作用[5-6]。研究顯示，IL-10基因啟動子區(qū)-592C/A(IL-10-592C/A)位點為轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點，通過影響IL-10的轉(zhuǎn)錄水平進而影響IL-10的表達及生物活性[7]。本課題通過對IL-10-592C/A位點的基因多態(tài)性進行分析，以進一步了解EV71腦炎的遺傳易感因素。

1 資料與方法

1.1 一般資料

2011年6月—2012年3月，青島大學醫(yī)學院附屬醫(yī)院和青島市婦女兒童醫(yī)院住院的EV71感染病兒共103例，男63例，女40例；年齡為1.3～7.5歲；其中輕癥病兒75例，重癥[8]病兒28例。診斷均符合中華人民共和國衛(wèi)生部制定的《手足口病診療指南(第2010版)》的標準，且重癥病兒RT-PCR檢測急性期糞便及腦脊液EV71病毒核酸陽性[9]。正常對照組135例，男83例，女52例；年齡2.7～8.3歲；為同期于兒童保健科體檢且臨床無感染癥狀的兒童，血常規(guī)及生化指標檢查均在正常參考范圍內(nèi)。

1.2 實驗方法

1.2.1DNA提取 入院時采集病兒靜脈血2 mL，EDTA抗凝，-20 ℃暫存?zhèn)溆?。采用Omega公司 (美國)全血DNA提取試劑盒，提取抗凝全血基因組DNA，嚴格按照試劑盒說明書進行操作。

1.2.2Hardy-Weinberg平衡定律檢測 根據(jù)Hardy-Weinberg平衡定律對EV71感染組與對照組IL-10-592C/A位點基因進行檢驗，P>0.05，提示兩組人群符合Hardy-Weinberg遺傳平衡。

1.2.3IL-10-592C/A位點基因多態(tài)性檢測 IL-10-592C/A位點引物由上海天昊生物科技公司設(shè)計完成。取DNA樣本1 μL，加入10 g/L的瓊脂糖后進行電泳，對其樣本進行質(zhì)量檢查以及濃度估計，然后將樣本稀釋到工作濃度10 μg/L。取iMLDRTM多重SNP分型試劑盒中的多重PCR引物混合物1 μL、2×PCR Master mix 5 μL、樣本DNA 1 μL、ddH2O 3 μL混勻，進行PCR擴增反應，并純化。將試劑盒中的10×連接緩沖液2 μL、高溫連接酶0.2 μL、連接引物混合液1 μL與純化后多重PCR產(chǎn)物3 μL、ddH2O 3.8 μL混勻。然后94 ℃ 1 min,56 ℃ 4 min，共 35 個循環(huán)；最后4 ℃下保存。取0.5 μL稀釋后的連接產(chǎn)物，與0.5 μL Liz 500 Size Standard熒光內(nèi)標及9 μL高度去離子甲酰胺混勻混勻，95 ℃變性5 min后上測序儀(ABI3130XL)進行測序。收集的原始數(shù)據(jù)用GeneMapper 4.0(美國Applied Biosystems公司)進行分析,采用連接產(chǎn)物的熒光標記特點及長度區(qū)分等位基因及不同位點(由上海天昊生物科技公司完成)。

1.3 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 17.0軟件包進行統(tǒng)計分析。兩組間基因型和等位基因頻數(shù)分布比較采用χ2檢驗，以P<0.05為差異有顯著性。

2 結(jié) 果

EV71感染病兒與對照兒童均存在IL-10基因多態(tài)性，IL-10-592C/A位點基因型分布均以CC型最為常見，等位基因型以C型多見，AA基因型分布頻率低，將AA基因型與AC基因型合并進行分析。EV71感染組IL-10-592C/A位點基因型分布為CC型74例、AC+AA型29例，等位基因分布為C型148例、A型58例；對照組該位點基因型分布CC型為97例、AC+AA型為38例，等位基因分布為C型226例、A型44例。輕癥組CC型60例、AC+AA型15例，等位基因分布為C型120例、A型30例；重癥組CC型14例、AC+AA型14例，等位基因分布為C型28例、A型28例。EV71感染病兒IL-10-592C/A位點基因型CC、AC+AA分布與對照組比較差異無顯著性(P>0.05)，但EV71感染重癥組病兒基因型AC+AA的分布與輕癥組病兒比較差異有顯著性(χ2=9.071，P<0.05)；EV71感染組A等位基因分布頻率與對照組比較差異無顯著性(P>0.05)。但重癥組A等位基因頻率分布與輕癥組比較差異有顯著性(χ2=18.143，P<0.05)。

3 討 論

EV71致兒童中樞神經(jīng)系統(tǒng)損害可引起腦炎、無菌性腦膜腦炎、腦脊髓炎及急性遲緩性麻痹等多種與神經(jīng)系統(tǒng)相關(guān)的疾病[10]，致死率及致殘率較高。目前，EV71致中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染的機制尚未完全明確，不同個體感染EV71后其臨床表現(xiàn)、病情經(jīng)過及預后迥異，造成這種差異的原因除了病毒本身的因素外，還包括不同宿主基因組對于病毒的易感性及免疫狀態(tài)的差異。因此，從宿主基因角度探討EV71致中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染的機制，可以進一步明確EV71易感性的遺傳學標志。本研究對EV71感染病兒103例及健康兒童135例外周血白細胞中IL-10-592C/A位點的基因型檢測結(jié)果顯示，IL-10-592C/A位點AC+AA基因型及A等位基因為在EV71感染后發(fā)展為重癥腦炎的易感基因，結(jié)果提示A等位基因頻率增高與EV71感染及感染后致嚴重的中樞神經(jīng)系統(tǒng)并發(fā)癥相關(guān)，而該位點CC基因型攜帶者感染EV71后不易發(fā)展為重癥腦炎。

EV71腦炎是腦實質(zhì)的炎癥性疾病，機體的炎癥反應及免疫狀態(tài)的基因差異對疾病的發(fā)生發(fā)展及預后起著重要的作用，炎癥因子尤其是具有多效能的細胞因子IL-10在機體炎癥反應中起著重要作用。由于IL-10是細胞因子網(wǎng)絡的樞紐之一且具有抗炎因子作用，在EV71腦炎的感染及疾病的轉(zhuǎn)歸中發(fā)揮一定作用。研究顯示，IL-10-592C/A位點為STAT3轉(zhuǎn)錄激活子結(jié)合位點，此位點存在C→A的突變，它可能為一種功能性的突變，其變異可使IL-10的轉(zhuǎn)錄水平下調(diào)，mRNA轉(zhuǎn)錄活性降低[7]，導致IL-10合成減少，不能有效抑制EV71腦炎腦實質(zhì)的炎癥反應。故IL-10-592C/A位點基因型為AC+AA者與基因型為CC者比較，合成的IL-10濃度低且活性低，IL-10啟動子區(qū)-592C/A位點C→A的基因多態(tài)性可導致IL-10的表達水平或其活性的改變，血液中低濃度的IL-10不能起到有效地抑制炎癥反應的作用，導致白細胞活化增強，血管通透性更加明顯，致腦實質(zhì)的炎癥反應進一步加劇，引起腦實質(zhì)更明顯的炎癥性損害。

本文研究結(jié)果顯示，IL-10-592C/A位點基因型AC+AA攜帶者及A等位基因為EV71感染后發(fā)展為重癥的危險因素，而基因型CC及C等位基因為病兒不易致重癥的保護基因。但由于遺傳、機體免疫功能狀態(tài)及病毒毒力及環(huán)境因素共同作用于機體致EV71感染，要確切了解IL-10的基因多態(tài)性與EV71致中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染的機制，尚需更深入的研究。

[參考文獻]

[1]宋遠斌,陳志江,曾其毅,等. 腸道病毒71型感染致中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷機制的研究進展[J]. 實用兒科臨床雜志, 2012,27(22):1765-1767.

[2]WENG K F, CHEN L L, HUANG P N, et al. Neural pathogenesis of enterovirus 71 infection[J]. Microbes Infect, 2010,12(7):505-510.

[3]付丹,李成榮,何顏霞,等. 腸道病毒71型感染病兒免疫功能探討[J]. 中華兒科雜志, 2009,47(11):829-834.

[4]MCMINN P C. An overview of the evolution of enterovirus 71 and its clinical and public health significance[J]. FEMS Microbiol Rev, 2002,26(1):91-107.

[5]BIDWELL J, KEEN L, GALLAGHER G, et al. Cytokine gene polymorphism in human disease: on-line databases[J]. Genes Immun, 1999,1(1):3-19.

[6]BASSAT H E, ALI L A, ALM EL-DIN R A, et al. Serum level of interleukin-10 with its gene polymorphism can be predictors of response to treatment in Egyptian patients with chronic hepatitis C virus[J]. Egyptian Journal of Medical Human Genetics, 2013,14(3):227-233.

[7]LIANG L, ZHAO Y L, YUE J, et al. Interleukin-10 gene promoter polymorphisms and their protein production in pleural fluid in patients with tuberculosis[J]. FEMS Immunol Med Microbiol, 2011,62(1):84-90.

[8]陳宗波,付振榮,吳福玲,等. 柯薩奇B3病毒VP1序列變異與小兒中樞神經(jīng)系統(tǒng)損害關(guān)系的探討[J]. 中華兒科雜志, 2010,48(4):268-272.

[9]趙娜,陳宗波,錢娜,等. IFN-γ+874位點單核苷酸多態(tài)性和蛋白表達水平與腸道病毒71感染關(guān)系[J]. 齊魯醫(yī)學雜志, 2010,25(4):315-317,320.

[10]趙順英,李興旺,江載芳. 關(guān)注小兒重癥腸道病毒71型感染[J]. 中華兒科雜志, 2008,46(6):401-403.