肺癌組織CXCR2和CREB的表達(dá)及意義

，

(1 青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院呼吸內(nèi)科教研室,山東 青島 266021； 2 中國(guó)人民解放軍第401醫(yī)院呼吸內(nèi)科)

肺癌是全世界癌癥死亡的首要原因，嚴(yán)重威脅人類的健康，而靶向治療為肺癌病人的治療帶來(lái)了希望[1]?？鼓[瘤血管生成藥物在腫瘤的治療中發(fā)揮重要作用[2]。CXC趨化因子受體2(CXCR2)是一種促血管生成的重要因子，cAMP反應(yīng)原件結(jié)合蛋白(CREB)為細(xì)胞核內(nèi)重要的轉(zhuǎn)錄因子和反應(yīng)原件結(jié)合蛋白。國(guó)外已有研究結(jié)果表明，抑制肺癌組織中CREB蛋白的表達(dá)后，誘導(dǎo)血管生成的CXC趨化因子及其受體CXCR2的基因表達(dá)明顯減少[3]。而國(guó)內(nèi)對(duì)肺癌組織中CXCR2和CREB的表達(dá)及其關(guān)系的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究應(yīng)用免疫組化方法，檢測(cè)CXCR2和CREB在肺癌組織中的表達(dá)，探討二者與肺癌發(fā)生、發(fā)展的關(guān)系。

1 資料和方法

1.1 一般資料

2010年1月—2011年1月，收集中國(guó)人民解放軍第401醫(yī)院胸外科肺癌手術(shù)后石蠟標(biāo)本49例，所有病人臨床資料完整，術(shù)前均未行化療和放療，術(shù)后均經(jīng)病理檢查明確診斷。其中男36例，女13例；年齡33～75歲，中位年齡61歲；吸煙者28例，非吸煙者21例；鱗癌22例，腺癌27例；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者34例，無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者15例；中心型25例，周?chē)?4例；高分化5例，中分化14例，低分化30例。根據(jù)1997年國(guó)際抗癌聯(lián)盟(UICC)肺癌分期標(biāo)準(zhǔn)，Ⅰ+Ⅱ期26例，Ⅲ+Ⅳ期23例。另選擇遠(yuǎn)離肺癌包塊且無(wú)癌細(xì)胞浸潤(rùn)的癌旁正常肺組織(距腫瘤邊緣5 cm以上)20例作為對(duì)照。所有標(biāo)本均行4 μm連續(xù)切片。

1.2 CXCR2和CREB表達(dá)檢測(cè)

采用免疫組織化學(xué)Elivision法。使用已知的CXCR2和CREB陽(yáng)性切片作為陽(yáng)性對(duì)照，PBS液代替一抗作為陰性對(duì)照。首先切片脫蠟至水，體積 分?jǐn)?shù)0.03過(guò)氧化氫封閉10 min滅活內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，微波修復(fù)抗原，滴加一抗(兔抗人CXCR2多克隆抗體稀釋比1∶100、兔抗人CREB多克隆抗體稀釋比1∶200)，于4 ℃濕盒過(guò)夜，滴加二抗，37 ℃孵育30 min，然后加DAB顯色，蘇木精對(duì)比染色，脫水、封片，顯微鏡下觀察。

1.3 結(jié)果判斷

CXCR2陽(yáng)性表達(dá)主要表現(xiàn)為胞膜和(或)胞漿中出現(xiàn)黃色、棕黃色或棕褐色顆粒沉淀；CREB陽(yáng)性表達(dá)主要位于細(xì)胞核，少量位于胞漿中，呈黃色、棕黃色或棕褐色顆粒狀。參考文獻(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)[4]，根據(jù)染色強(qiáng)度陰性、弱陽(yáng)性、中陽(yáng)性、強(qiáng)陽(yáng)性分別計(jì)為0、1、2、3分；400倍光鏡下，每張切片隨機(jī)選擇10個(gè)高倍視野計(jì)數(shù)陽(yáng)性細(xì)胞，以每100個(gè)細(xì)胞中含陽(yáng)性細(xì)胞個(gè)數(shù)作為陽(yáng)性細(xì)胞率，陽(yáng)性細(xì)胞率<10%計(jì)為0分，10%～25%計(jì)為1分，26%～50%計(jì)為2分，51%～75%為3分，>75%為4分。以陽(yáng)性細(xì)胞率計(jì)分與染色強(qiáng)度計(jì)分之積作為免疫組化染色的評(píng)分，<4分為陰性(-)，4～5分為弱陽(yáng)性(+)，≥6分為陽(yáng)性()，分析時(shí)將(-)定義為陰性表達(dá)，(+)和()定義為陽(yáng)性表達(dá)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，數(shù)據(jù)間比較采用χ2檢驗(yàn)，應(yīng)用Spearman方法進(jìn)行相關(guān)分析，P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 肺癌組織與癌旁正常組織中CXCR2和CREB的表達(dá)比較

CXCR2和CREB在肺癌組織中陽(yáng)性表達(dá)率分別為69.4%(34/49)和57.1%(28/49)，二者在癌旁正常肺組織中的陽(yáng)性表達(dá)率分別為15.0%(3/20)和10.0%(2/20)，CXCR2和CREB在肺癌組織中的表達(dá)明顯高于其癌旁正常肺組織，差異均有顯著意義(χ2=14.778、10.998，P<0.05)。

2.2 肺癌組織CXCR2與CREB表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系(例)

肺癌組織CXCR2和CREB的陽(yáng)性表達(dá)均與腫瘤的分化程度(χ2=4.102、12.042，P<0.05)和腫瘤TNM分期有關(guān)(χ2=4.836、7.894，P<0.05)，與肺癌病人的年齡、性別和腫瘤大小、腫瘤位置及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均無(wú)關(guān)(P>0.05)。CREB在肺鱗癌組織表達(dá)明顯高于腺癌(χ2=13.920，P<0.05)，而CXCR2在肺鱗癌和腺癌組織中表達(dá)差異無(wú)顯著意義(P>0.05)。CREB在吸煙者中的表達(dá)明顯高于非吸煙者(χ2=8.507，P<0.05)，而CXCR2的表達(dá)與肺癌病人是否吸煙無(wú)明顯相關(guān)性(P>0.05)。見(jiàn)表1。

表1肺癌組織CREB和CXCR2表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系(例)

臨床病理特征nCREB陽(yáng)性表達(dá)χ2PCXCR2陽(yáng)性表達(dá)χ2P年齡(歲) ≤61271619 >6122120.1100.216150.0270.240性別 男362125 女1370.0790.24590.1130.273腫瘤大小(d/cm) ≤ 5291621 >520120.1130.219130.3060.211位置 中心型251518 周?chē)?4130.1700.209160.1640.224分化程度 高-中分化19516 低分化302312.0420.001104.1020.035TNM分期 Ⅰ+Ⅱ261014 Ⅲ+Ⅳ23187.8940.005204.8360.011淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移 陽(yáng)性342024 陰性1580.1280.229100.0750.250病理類型 鱗癌221914 腺癌27913.9200.000200.6220.180吸煙狀況 吸煙282122 非吸煙2178.5070.004122.5940.070

2.3 肺癌組織中CXCR2與CREB表達(dá)之間的相關(guān)性

相關(guān)分析顯示，肺癌組織中CXCR2與CREB表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.319，P<0.05)。

3 討 論

CXCR2屬于趨化因子受體的一種，可與白細(xì)胞介素-8、生長(zhǎng)調(diào)節(jié)癌基因、巨噬細(xì)胞炎性蛋白-2和中性粒細(xì)胞激活蛋白-2等因子相結(jié)合，是促血管生成趨化因子的共同受體，多表達(dá)于腫瘤細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞的表面。CXCR2與其配體結(jié)合后，通過(guò)下游細(xì)胞內(nèi)cAMP-蛋白激酶A(PKA)和Ras/Raf/MEK/JNK/p38等信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，以及轉(zhuǎn)錄因子NF-κB和CREB途徑，作用于酪氨酸激酶受體，引起血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖、趨化運(yùn)動(dòng)及抑制內(nèi)皮細(xì)胞凋亡等一系列促進(jìn)血管新生的效應(yīng)[5]。研究顯示，在多種惡性腫瘤包括胰腺癌[6]、人惡性黑色素瘤[7]和肺癌[8]都有CXCR2的激活，并認(rèn)為CXCR2可能通過(guò)轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控細(xì)胞增殖、細(xì)胞凋亡和血管生成相關(guān)基因的表達(dá)，參與惡性腫瘤的發(fā)生。

CREB是細(xì)胞核內(nèi)重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，由341個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成，相對(duì)分子質(zhì)量為43 000，由C端區(qū)域和N端區(qū)域構(gòu)成，C端與啟動(dòng)子結(jié)合，N端參與信號(hào)分子的調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄。CREB發(fā)生磷酸化而活化后，形成同源或異源二聚體，在輔助因子的幫助下，識(shí)別并結(jié)合目的基因啟動(dòng)子中的cAMP反應(yīng)元件(CRE)，促進(jìn)基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，參與腫瘤的增殖、分化和轉(zhuǎn)移[9]。林成招等[10]研究顯示，大豆異黃酮可以抑制大鼠乳癌細(xì)胞內(nèi)磷酸二酯酶的活性，活化cAMP/PKA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，增加癌細(xì)胞內(nèi)cAMP濃度，增強(qiáng)CREB表達(dá)。SUN等[3]用特異性阻斷劑抑制A549肺癌細(xì)胞株中CREB表達(dá)，降低其活性，可減少CXC趨化因子及其受體CXCR2在細(xì)胞中的基因表達(dá)水平，推測(cè)CREB很可能是CXCR2的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子。

本研究結(jié)果顯示，肺癌組織中CXCR2和CREB的表達(dá)增高，少數(shù)癌旁正常肺組織中亦可檢測(cè)到CXCR2和CREB的表達(dá)，但其表達(dá)量明顯低于肺癌組織，與吳勇等[11]報(bào)道的結(jié)果一致。該現(xiàn)象是否為肺癌早期肺內(nèi)轉(zhuǎn)移的跡象和征兆尚不清楚，定期追蹤檢測(cè)可能會(huì)進(jìn)一步明確二者在肺癌早期診斷和轉(zhuǎn)移中的意義。本文研究結(jié)果還顯示，肺癌組織中CXCR2和CREB的表達(dá)均與腫瘤的TNM分期和分化程度有關(guān)，Ⅲ+Ⅳ期肺癌組織中二者的表達(dá)明顯高于Ⅰ+Ⅱ期，低分化肺癌組織中二者的表達(dá)明顯高于高-中分化，提示CXCR2和CREB在肺癌組織中的陽(yáng)性表達(dá)水平越高，肺癌的惡性程度越高。本研究還顯示，CREB在吸煙病人肺癌組織中的表達(dá)明顯高于非吸煙者，在肺鱗癌組織中的表達(dá)明顯高于腺癌。吸煙是目前公認(rèn)的肺癌主要致病因素，而且與肺鱗癌的發(fā)生密切相關(guān)，推測(cè)吸煙可能上調(diào)CREB蛋白表達(dá)，參與肺癌尤其是肺鱗癌的發(fā)生，與SEO等[12]的結(jié)果一致。本研究結(jié)果顯示，CXCR2和CREB在肺癌組織中表達(dá)呈顯著正相關(guān)，提示肺癌組織中CREB的活化可能促進(jìn)了CXCR2的蛋白表達(dá)，二者協(xié)同作用共同促進(jìn)肺癌的發(fā)生。

綜上所述， CXCR2和CREB陽(yáng)性表達(dá)與肺癌發(fā)生有關(guān)，對(duì)肺癌的發(fā)展起重要作用，二者有望成為肺癌治療的靶位點(diǎn)。

[參考文獻(xiàn)]

[1]嚴(yán)小杰. 晚期非小細(xì)胞肺癌的藥物治療策略[J]. 齊魯醫(yī)學(xué)雜志, 2014,29(2):181-182.

[2]CAO Y. Angiogenesis: what can it offer for future medicine[J]? Exp Cell Res, 2010,316(8):1304-1308.

[3]SUN H, CHUNG W C, RYU S H, et al. Cyclic AMP-responsive element binding protein-and nuclear factor-kappaB-regulated CXC chemokine gene expression in lung carcinogenesis[J]. Cancer Prev Res (Phila), 2008,1(5):316-328.

[4]WANG L, WEI D, HUANG S, et al. Transcription factor Sp1 expression is a significant predictor of survival in human gastric cancer[J]. Clin Cancer Res, 2003,9(17):6371-6380.

[5]張麗娜,馮玉梅. CXC趨化因子與腫瘤血管新生[J]. 醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)雜志, 2007,4(1):74-77.

[6]HUSSAIN F, WANG J, AHMED R, et al. The expression of IL-8 and IL-8 receptors in pancreatic adenocarcinomas and pancreatic neuroendocrine tumours[J]. Cytokine, 2010,49(2):134-140.

[7]SINGH S, VARNEY M, SINGH R K. Host CXCR2-depen-dent regulation of melanoma growth, angiogenesis, and experimental lung metastasis[J]. Cancer Res, 2009,69(2):411-415.

[8]KEANE M P, BELPERIO J A, XUE Y Y, et al. Depletion of CXCR2 inhibits tumor growth and angiogenesis in a murine model of lung cancer[J]. J Immunol, 2004,172(5):2853-2860.

[9]MONTMINY M R, BILEZIKJIAN L M. Binding of a nuclear protein to the cyclic-AMP response element of the somatostatin gene[J]. Nature, 1987,328(6126):175-178.

[10]林成招,馬海田,鄒思湘,等. 大豆異黃酮對(duì)大鼠乳腺癌細(xì)胞內(nèi)cAMP/PKA信號(hào)途徑的影響[J]. 生理學(xué)報(bào), 2005,57(4):517-522.

[11]吳勇,薛孟華,劉偉. 非小細(xì)胞肺癌CREB表達(dá)的臨床意義[J]. 中華胸心血管外科雜志, 2010,26(6):403-404.

[12]SEO H S, LIU D D, BEKELE B N, et al. Cyclic AMP response element-binding protein overexpression: a feature associated with negative prognosis in never smokers with non-small cell lung cancer[J]. Cancer Res, 2008,68(15):6065-6073.