TLR2和TLR4在乳癌組織表達(dá)及臨床意義

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(青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院，山東 青島 266021 1 生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室； 2 微生物學(xué)教研室； 3 附屬醫(yī)院乳腺外科； 4 2010級(jí)七年制臨床醫(yī)學(xué)專業(yè))

乳癌是全球性的女性常見惡性腫瘤之一,嚴(yán)重威脅著婦女的健康，在中國許多大中城市，乳癌已躍居女性惡性腫瘤的第一位[1]。該腫瘤隱匿期長，早期發(fā)現(xiàn)及早治療非常重要。近年來在乳癌的發(fā)病機(jī)制研究方面取得了一定進(jìn)展，但對(duì)其早期診斷和臨床治療并沒有實(shí)質(zhì)性突破。Toll 樣受體(TLRs)是新近發(fā)現(xiàn)的參與非特異性免疫(天然免疫)的一類重要蛋白質(zhì)分子，也是連接非特異性免疫和特異性免疫的橋梁。TLRs可以營造炎癥微環(huán)境導(dǎo)致腫瘤形成，并在腫瘤形成基礎(chǔ)上促進(jìn)腫瘤進(jìn)展。研究結(jié)果顯示，TLRs不僅在免疫系統(tǒng)細(xì)胞表達(dá)，也廣泛表達(dá)于腫瘤細(xì)胞[2-3]。在腫瘤發(fā)生發(fā)展中 TLRs 信號(hào)有重要作用。TLR2 和TLR4 在乳癌組織表達(dá)及其在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用尚未明了，本研究通過檢測乳癌組織中TLR2 和TLR4 的表達(dá)，探討其與乳癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)系，并探討其臨床意義。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來源

隨機(jī)收集青島市中心醫(yī)院和青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院2010年7月—2012年3月收治，經(jīng)病理組織學(xué)確診的乳癌病人的新鮮癌組織及相應(yīng)癌旁組織(距腫瘤邊緣≥5 cm)213例。所有病人均為女性，年齡32～80歲，中位年齡54.3歲。病理類型：浸潤性非特殊型癌209例(其中浸潤性導(dǎo)管癌198例，浸潤性小葉癌4例，髓樣癌5例，基底細(xì)胞樣癌2例)，浸潤性特殊型癌4例(均為乳頭狀癌)。應(yīng)用國際抗癌聯(lián)盟的TNM分期法分期：T1期98例，T2期115例；N0期122例，N1期45例，N2期33例，N3期13例；M0期213例。所有病人術(shù)前均未接受過新輔助化療、內(nèi)分泌治療及放射治療，并除外雙側(cè)原發(fā)乳癌和合并其他惡性腫瘤病人。

1.2 主要試劑

HotstarTaq DNA聚合酶由大連TaKaRa公司提

供；逆轉(zhuǎn)錄(RT)試劑盒購自立陶宛MBI Fermentas公司擴(kuò)增；引物由南京金思瑞生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成；QuantiFast SYBR Green PCR Kit購自德國QIAGEN公司。

1.3 RNA提取與純化

采用TRIzol一步法提取組織總RNA，具體步驟按照說明書進(jìn)行操作。滅活所提取的RNA樣品中混雜的DNA并純化RNA樣品。

1.4 TLR2和TLR4 mRNA檢測

1.4.1RT-PCR ①引物設(shè)計(jì)：TLR2和TLR4及內(nèi)參照基因GAPDH引物序列見表1。②cDNA的合成：采用RT試劑盒進(jìn)行cDNA合成，具體操作步驟按說明書進(jìn)行。RT完成后，cDNA樣本于-80 ℃保存?zhèn)溆?。③PCR擴(kuò)增：用上述合成的cDNA作模板進(jìn)行TLR2和TLR4擴(kuò)增，內(nèi)參照GAPDH擴(kuò)增的上下游引物各0.4 μmol/L(1.0 μL)，其他反應(yīng)體系與條件同前。并用ddH2O作為空白對(duì)照。

1.4.2PCR擴(kuò)增產(chǎn)物檢測 將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物于含有0.5 mg/L溴化乙錠的15 g/L瓊脂糖凝膠中電泳，凝膠成像系統(tǒng)記錄并分析電泳結(jié)果。

表1 TLRs和GAPDH RT-PCR引物

1.4.3Real-time PCR檢測 以上述合成的cDNA為模板，按照QuantiFast SYBR Green PCR Kit試劑盒說明進(jìn)行Real-time PCR反應(yīng)，從上述213例乳癌組織及其癌旁組織中隨機(jī)抽取30例對(duì)TLR2和TLR4基因的mRNA表達(dá)量進(jìn)行定量分析比較。以GAPDH基因作為內(nèi)參照，每份RNA樣品均進(jìn)行3次重復(fù)檢測，取其平均Ct值用于分析。擴(kuò)增引物由南京金斯瑞生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司設(shè)計(jì)合成，引物序列及產(chǎn)物大小同1.4.1。根據(jù)所得Ct值，應(yīng)用2-△△Ct法計(jì)算乳癌組織及其相應(yīng)癌旁組織中TLR2和TLR4相對(duì)表達(dá)量，每次實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié) 果

2.1 TLR2與TLR4 mRNA的表達(dá)

2.1.1TLR2 mRNA的陽性表達(dá) 部分乳癌及其相應(yīng)癌旁組織TLR2 mRNA RT-PCR檢測的電泳結(jié)果見圖1，TLR2基因擴(kuò)增條帶長度為264 bp，內(nèi)參照基因GAPDH擴(kuò)增條帶長度為469 bp。乳癌組織及其相應(yīng)癌旁組織TLR2的陽性表達(dá)率分別為92.49%(197/213)和71.3%(152/213)，乳癌組織TLR2陽性表達(dá)率明顯高于其相應(yīng)癌旁組織，差異有顯著意義(χ2=32.10，P<0.01)。

2.1.2TLR4 mRNA的陽性表達(dá) 部分乳癌及其相應(yīng)癌旁組織TLR4 mRNA RT-PCR檢測的電泳結(jié)果見圖2，TLR4基因擴(kuò)增條帶長度為510 bp，內(nèi)參照基因GAPDH擴(kuò)增條帶長度為469 bp。乳癌組織及其相應(yīng)癌旁組織TLR4的陽性表達(dá)率分別為95.78%(204/213)和41.78%(89/213)，乳癌組織TLR4陽性表達(dá)率明顯高于其相應(yīng)癌旁組織，差異有顯著意義(χ2=144.57，P<0.01)。

A：乳癌組織；B：癌旁組織；M：DL2000 DNA Marker；①陰性質(zhì)控；②～乳癌組織及癌旁組織。

圖1RT-PCR檢測部分標(biāo)本TLR2mRNA表達(dá)

A：乳癌組織；B：癌旁組織；M：DL2000 DNA Marker；①陰性質(zhì)控；②～乳癌組織及癌旁組織。

圖2RT-PCR檢測部分標(biāo)本TLR4mRNA表達(dá)

2.2 乳癌組織TLRs表達(dá)與臨床病理因素關(guān)系

乳癌組織中TLR2和TLR4 mRNA表達(dá)與腫瘤的組織學(xué)分級(jí)以及雌激素受體(ER)陽性表達(dá)、孕激素受體(PR)陽性表達(dá)均有關(guān)(χ2=4.06～30.86，P<0.05)，而TLR2 mRNA表達(dá)與抑癌基因p53的表達(dá)也有關(guān)(χ2=5.71，P<0.05)。見表2。

表2 乳癌組織TLRs表達(dá)與臨床病理因素關(guān)系(例(χ/%))

2.3 Real-time PCR檢測TLRs mRNA表達(dá)水平

乳癌組織和癌旁組織中TLR2 mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為0.79±0.10、0.65±0.15，TLR4 mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為0.81±0.12、0.67±0.16。乳癌組織TLR2和TLR4 mRNA表達(dá)量顯著高于其相應(yīng)癌旁組織(t=4.26、3.89，P<0.05)。

3 討 論

TLRs廣泛分布于免疫細(xì)胞尤其非特異免疫細(xì)胞或細(xì)胞器膜的表面，是進(jìn)化過程中比較保守的一個(gè)受體家族，是感受病原體入侵的主要受體之一[4]。很多研究顯示，腫瘤發(fā)展與慢性炎癥密切相關(guān)，多種腫瘤的生物學(xué)行為與介導(dǎo)炎癥的TLRs密切相關(guān)。TLRs在不同的腫瘤細(xì)胞表達(dá)有差異，并且在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、耐藥和侵襲過程中發(fā)揮重要作用。目前已發(fā)現(xiàn)的TLRs家族至少包括12個(gè)成員，不同的TLRs其配體也有所不同。

TLR2識(shí)別譜較廣，可識(shí)別大部分已發(fā)現(xiàn)的病原體相關(guān)分子模式(PAMP)結(jié)構(gòu)，其不僅是機(jī)體介導(dǎo)天然免疫反應(yīng)的重要分子，而且在組織修復(fù)的過程中也發(fā)揮著重要作用。研究認(rèn)為，在腫瘤發(fā)生前，TLR2信號(hào)途徑的持續(xù)激活是慢性炎癥持續(xù)存在進(jìn)而發(fā)展為惡性腫瘤的重要原因[5]。近年來研究顯示，TLR2在很多腫瘤細(xì)胞系和腫瘤組織中表達(dá)上調(diào)，尤其是上皮來源的腫瘤。但乳癌組織中TLR2的表達(dá)情況尚不清楚。本研究結(jié)果顯示，乳癌組織TLR2的表達(dá)明顯上調(diào)，其在N3期(淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移)的表達(dá)比N0期有較明顯的增高趨勢，說明TLR2在一定程度上促進(jìn)了癌細(xì)胞的增殖，參與乳癌的轉(zhuǎn)移，提示TLR2可能通過激活TLRs信號(hào)通路參與乳癌的惡性進(jìn)程，進(jìn)而影響病人預(yù)后；而腫瘤的組織學(xué)分級(jí)越高，TLR2的表達(dá)率越高，提示TLR2有可能成為腫瘤分化不良的重要標(biāo)志。YANG等[6]對(duì)黑色素瘤研究顯示，腫瘤細(xì)胞釋放的HSP60持續(xù)激活TLR2通路，進(jìn)而激活信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子，導(dǎo)致免疫抑制細(xì)胞因子和趨化因子釋放，促進(jìn)黑色素瘤細(xì)胞的增殖和浸潤，而針對(duì)TLR2的治療能顯著降低肺部的轉(zhuǎn)移，增加荷瘤鼠的存活。我們推測，乳癌與其他腫瘤一樣，在腫瘤微環(huán)境內(nèi)可能也存在著TLR2內(nèi)源性配體，激活乳癌細(xì)胞TLR2信號(hào)通路，從而引起局部炎癥樣反應(yīng)，并通過上述類似的機(jī)制促進(jìn)癌細(xì)胞的增殖、凋亡抵抗等。因此，TLR2有望成為乳癌預(yù)后判斷指標(biāo)和新的治療靶點(diǎn)。

TLR4普遍表達(dá)于多種腫瘤細(xì)胞，腫瘤的發(fā)展與TLR4參與激活的信號(hào)通路有密切關(guān)系。近年研究顯示，TLR4在很多腫瘤細(xì)胞系和腫瘤組織中表達(dá)上調(diào)。它表達(dá)于多種腫瘤細(xì)胞中，如人頭頸鱗狀細(xì)胞癌[7]、結(jié)直腸癌[8]、胃癌[9]、卵巢癌[10]、宮頸癌[11]、肺癌[12]、前列腺癌、黑色素瘤[13]、乳癌[14]、胰腺癌等。TLR4在乳癌組織中的表達(dá)尚少見報(bào)道。本研究結(jié)果顯示，乳癌組織TLR4表達(dá)明顯上調(diào)，其表達(dá)與腫瘤的組織學(xué)分級(jí)、T分期和ER、PR的狀態(tài)均有關(guān)。腫瘤的組織學(xué)分級(jí)越高，TLR4的表達(dá)率越高，TLR4可能參與了腫瘤的惡性進(jìn)程，有可能成為腫瘤分化不良的重要標(biāo)志，提示TLR4可能通過激活TLRs信號(hào)通路參與乳癌的惡性進(jìn)程，進(jìn)而影響病人預(yù)后。T2期TLR4的表達(dá)顯著高于T1期，說明TLR4可能促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖，影響腫瘤的發(fā)展進(jìn)程；ER陽性組TLR4的表達(dá)顯著高于ER陰性組；與PR陰性組比較，PR陽性組中TLR4的表達(dá)也有顯著增高。乳癌是一種雌激素依賴性腫瘤，研究表明，ER、PR與乳癌的組織分化和預(yù)后有密切聯(lián)系，ER、PR陽性往往預(yù)示著病人預(yù)后較好，而本研究中ER、PR陽性乳癌組織中TLR2和TLR4的表達(dá)明顯升高，與預(yù)期結(jié)果不符，這可能與我們收集的乳癌標(biāo)本中ER、PR陰性例數(shù)太少有關(guān)，在后期的研究中需擴(kuò)大標(biāo)本例數(shù)做進(jìn)一步研究。TLRs是近年來腫瘤免疫學(xué)的研究熱點(diǎn)。其促進(jìn)腫瘤發(fā)生、侵襲轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)、免疫逃逸的分子機(jī)制尚待進(jìn)一步深入研究。TLRs在乳癌發(fā)生發(fā)展中作用的研究尚少見報(bào)道，國內(nèi)幾乎未見相關(guān)研究報(bào)道。

總之，本研究TLR2和TLR4在乳癌組織的表達(dá)結(jié)果提示，TLRs在乳癌的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用，可能通過激活TLRs信號(hào)通路參與乳癌的進(jìn)程。TLR2和TLR4有望成為乳癌的預(yù)后判斷指標(biāo)和新的治療靶點(diǎn)。對(duì)TLRs信號(hào)通路的分子機(jī)制進(jìn)行深入研究，將為腫瘤生物治療提供新的策略，從而提高病人生存期和改善預(yù)后。

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