RNA干擾 HDAC1對人宮頸癌SiHa細胞遷移及侵襲影響

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(中國人民武裝警察部隊后勤學(xué)院附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科，天津 300162)

惡性腫瘤的發(fā)生是一個多基因改變的復(fù)雜過程，涉及抑癌基因的失活及癌基因的激活，癌基因及抑癌基因表達變化既有遺傳學(xué)機制，也有表觀遺傳學(xué)機制。研究顯示，組蛋白乙?；悄[瘤相關(guān)基因最常見的表觀遺傳學(xué)調(diào)控形式之一[1]。組蛋白乙?；氖Ш猓貏e是乙?；慕档停捎绊懠毎脑鲋澈偷蛲?，導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。組蛋白乙?；?HAT)和組蛋白去乙?；?HDAC)共同調(diào)節(jié)組蛋白乙?；?。其中HDAC有四大類18個亞型，目前研究多集中在HDAC1。本研究旨在觀察RNA干擾(RNAi)技術(shù)抑制HDAC1基因表達對宮頸癌SiHa細胞遷移和侵襲的影響，并且探討其可能的作用機制?，F(xiàn)將結(jié)果報告如下。

1 材料與方法

1.1材料

人宮頸鱗癌來源的SiHa細胞系購于武漢典型生物保藏中心，本科實驗室儲存；RPMI 1640培養(yǎng)液購自Gibco公司，Trizol和Lipofectamine 2000購自Invitrogen公司，SYBR Green Real-time PCR Master Mix購自TaKaRa 公司，HDAC1、乙酰化組蛋白H4(Ac-H4)和β-actin單克隆抗體購自Santa Cruz公司，Transwell小室購自Corning公司，Matrigel基質(zhì)膠購于BD公司，小干擾RNA(siRNA)鏈及寡核苷酸引物由上海生工生物工程有限公司合成。

1.2實驗方法

1.2.1細胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染 SiHa細胞置于含胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液中，在37 ℃、體積分數(shù)0.05 CO2、飽和濕度條件下培養(yǎng)。HDAC1基因siRNA序列：正義鏈5′-GCCGGUCAUGUCCAAAGUAT-T-3′，反義鏈5′-UACUUUGGACAUGACCGGCT-T-3′；陰性對照siRNA序列：正義鏈5′-UUCUC-CGAACGUGUCACGUTT-3′，反義鏈5′-ACGUG-ACACGUUCGGAGAATT-3′。細胞按每孔106個接種于6孔板，貼壁生長24 h后轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染前1 h吸凈含血清的培養(yǎng)液，換成不含血清的培養(yǎng)液，具體轉(zhuǎn)染步驟參照Invitrogen公司操作手冊。轉(zhuǎn)染6 h后更換成含胎牛血清的完全培養(yǎng)液，轉(zhuǎn)染48 h后收集細胞進行實驗。實驗分為正常對照組(無干預(yù)措施)、陰性對照組(轉(zhuǎn)染陰性對照siRNA)和siRNA干擾組(轉(zhuǎn)染HDAC1基因siRNA)。

1.2.2熒光定量 PCR Trizol一步法抽提細胞總RNA，紫外線分光光度儀測定A260/A280值，以檢測RNA樣品的純度和濃度。以Randam Primer為引物合成cDNA，42 ℃ 15 min，70 ℃ 5 min，產(chǎn)物-20 ℃保存。采用7700全定量PCR儀，以GAPDH為內(nèi)參照進行PCR。各基因引物序列見表1。反應(yīng)條件：95 ℃ 1 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 15 s，72 ℃ 45 s，共40個循環(huán)。計算目的基因相對表達量(RQ值)，實驗重復(fù)3次,取平均值。

表1 定量PCR基因引物序列

1.2.3Western blot檢測 收集細胞，加入蛋白裂解液，冰上裂解10 min，棄沉淀。應(yīng)用BCA試劑盒進行蛋白定量，按照試劑說明書操作。取20 μg總蛋白進行聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)移蛋白至硝酸纖維素膜上，采用50 g/L脫脂奶封閉，加封閉液稀釋的一抗(1∶500)，4 ℃孵育過夜，洗膜后與辣根過氧化物酶標記的二抗(1∶2 000)室溫下孵育1 h，洗膜3次，ECL發(fā)光壓片成像，以β-actin為內(nèi)參照，條帶用Quantity One軟件轉(zhuǎn)化為灰度值，以目的條帶/β-actin條帶灰度值比值表示目的蛋白相對表達量。實驗重復(fù)3次,取平均值。

1.2.4劃痕實驗 取各組細胞接種于6孔板中，當細胞融合度達95%時，用小移液器滴頭劃痕，PBS洗3次。改用無血清的RPMI 1640培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24 h，鏡下觀察并記錄劃痕距離，通過測量多個點劃痕寬度，計算平均劃痕愈合率。劃痕愈合率=(0 h劃痕寬度-24 h劃痕寬度)/0 h劃痕寬度×100%。實驗重復(fù)3次,取平均值。

1.2.5Transwell侵襲實驗 收集各組細胞，Transwell小室底部膜的上室面包被一層Matrigel基質(zhì)膠，上室加入5×104個細胞，稀釋于200 μL 不含血清的RPMI 1640培養(yǎng)液中，下室加入600 μL 含血清的RPMI 1640培養(yǎng)液，置于37 ℃、體積分數(shù)0.05 CO2、飽和濕度條件下培養(yǎng)24 h。取出膜，用棉簽拭凈基質(zhì)膠及上室面細胞，甲醛固定，結(jié)晶紫染色后，鏡下計數(shù)穿過透到膜背面細胞數(shù)，隨機選擇3個不同視野計數(shù)，實驗重復(fù)3次,取平均值。

1.3統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié) 果

2.1HDAC1 siRNA對宮頸癌SiHa細胞HDAC1基因表達的影響

siRNA干擾組與正常對照組和陰性對照組相比，HDAC1蛋白和mRNA表達降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=549.99、19.02,P<0.05)；正常對照組與陰性對照組HDAC1蛋白和mRNA表達相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見圖1、表2。

2.2HDAC1 siRNA對宮頸癌SiHa細胞Ac-H4表達的影響

siRNA干擾組與正常對照組和陰性對照組相比，Ac-H4蛋白表達增加，差異有顯著性(F=17.41，P<0.05)；正常對照組與陰性對照組Ac-H4蛋白表達相比，差異無顯著性(P>0.05)。見圖1、表2。

A：正常對照組；B：陰性對照組；C：siRNA干擾組。

圖1SiHa細胞HDAC1和Ac-H4蛋白的Westernblot檢測

HDAC1 mRNAHDAC1Ac-H410.21±0.310.81±0.120.76±0.189.89±0.430.79±0.140.75±0.17siRNA4.99±0.320.42±0.150.32±0.16

2.3HDAC1 siRNA對宮頸癌SiHa細胞遷移能力的影響

siRNA干擾組與正常對照組和陰性對照組相比，細胞劃痕愈合率降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=47.00，P<0.05)；正常對照組與陰性對照組細胞劃痕愈合率相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見圖2、表3。

2.4HDAC1 siRNA對宮頸癌SiHa細胞侵襲能力的影響

siRNA干擾組與正常對照組和陰性對照組相比，穿透Transwell濾膜的細胞數(shù)量降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=181.43，P<0.05)；正常對照組與陰性對照組穿透Transwell濾膜的細胞數(shù)量相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見圖2、表3。

2.5HDAC1 siRNA對宮頸癌SiHa細胞核因子-κB(NF-κB)和尿激酶型纖溶酶原激活劑(uPA)基因mRNA表達的影響 與兩對照組相比，siRNA干擾組NF-κB和uPA基因mRNA表達降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=39.33、34.10，P<0.05)；兩對照組NF-κB和uPA基因mRNA表達相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表3。

(χ/%)()NF-κB mRNAuPA mRNA62.40±5.3182.44±6.196.72±0.755.67±0.7659.58±5.0080.22±4.526.82±0.715.85±0.73siRNA40.43±4.7340.67±4.854.12±0.743.24±0.65

A～C為宮頸癌細胞劃痕實驗，D～F為宮頸癌細胞侵襲實驗。A、D：正常對照組；B、E：陰性對照組；C、F：siRNA干擾組。

3 討 論

宮頸癌是女性常見的生殖道惡性腫瘤，其臨床特點是直接侵犯鄰近組織和盆腔淋巴結(jié)遠處轉(zhuǎn)移。宮頸癌局部浸潤是指腫瘤細胞沿組織間隙直接向?qū)m頸或?qū)m體外擴展，宮頸局部廣泛浸潤時，可形成冰凍骨盆。宮頸癌早期即可發(fā)生遠處淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移，有研究顯示，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者5年生存率可達82.3%，而有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者5年生存率只有50.8%，故淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是判斷宮頸癌預(yù)后的一個獨立因素[2]。因此，早期阻斷宮頸癌浸潤和轉(zhuǎn)移對宮頸癌的臨床治療具有重要意義。近年來在對宮頸癌發(fā)生及侵襲轉(zhuǎn)移的研究中，組蛋白乙?；{(diào)節(jié)作為表觀遺傳學(xué)中重要的基因表達調(diào)控方式之一赿來赿受到重視。

真核生物核小體中的組蛋白乙?；怯蒆AT和HDAC共同調(diào)控。組蛋白的乙?；喟l(fā)生在組蛋白N端堿性氨基酸中特定賴氨酸殘基上，HAT將乙酰輔酶A的乙?；D(zhuǎn)移到賴氨酸的氨基端，中和組蛋白所帶的正電荷，從而減弱DNA和組蛋白的相互作用，使轉(zhuǎn)錄因子易與DNA結(jié)合而促進轉(zhuǎn)錄；HDAC則可以移去氨基端的乙?；?，增強DNA和組蛋白的相互作用，從而抑制轉(zhuǎn)錄。HDAC是一類具有能通過組蛋白轉(zhuǎn)錄后修飾來調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄或調(diào)節(jié)其他轉(zhuǎn)錄因子的酶，有Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ等4型，其中Ⅰ型包括HDAC1、2、3、8[3]。研究顯示，HDAC1在宮頸癌組織中高表達，并與高危型HPV感染關(guān)系密切[4-5]，HDAC1 siRNA在肺腺癌A549細胞、胰腺癌PaTu8988細胞、宮頸癌HeLa細胞中能抑制細胞生長[6-8]。本文用siRNA沉默宮頸癌SiHa細胞HDAC1，結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染HDAC1 siRNA的SiHa細胞HDAC1在mRNA和蛋白水平上明顯降低，說明我們體外構(gòu)建的HDAC1 siRNA能有效下調(diào)SiHa細胞HDAC1基因表達。HDAC1基因表達下調(diào)后，SiHa細胞遷移能力下降，侵襲能力也降低，說明HDAC1基因在宮頸癌侵襲轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用。

腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移是腫瘤細胞、宿主細胞及細胞外基質(zhì)之間相互作用的結(jié)果。參與腫瘤侵襲的分子機制很多，與宮頸癌侵襲轉(zhuǎn)移關(guān)系密切的主要包括整合素家族、uPA系統(tǒng)、金屬蛋白酶系統(tǒng)、血管內(nèi)皮生長因子及其特異性受體等相關(guān)基因[9]。細胞外基質(zhì)和基底膜降解是腫瘤細胞侵襲轉(zhuǎn)移的必要條件，uPA在此環(huán)節(jié)中扮演重要角色。uPA是腫瘤細胞本身分泌的一種絲氨酸蛋白水解酶，可激活前基質(zhì)金屬蛋白酶3，從而激活前基質(zhì)金屬蛋白酶9，并促進膠原纖維的降解[10]。NF-κB是細胞轉(zhuǎn)錄因子，活化的NF-κB信號通路可促進腫瘤細胞增殖、遷移，增加其對化療藥物的抵抗性。NF-κB可以調(diào)控凋亡相關(guān)基因、原癌基因、腫瘤相關(guān)黏附分子基因的表達，這些基因與腫瘤的發(fā)生、轉(zhuǎn)化、侵襲和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。其中uPA是依賴于NF-κB通路調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄過程的下游基因之一[11]。NF-κB和uPA基因在宮頸癌組織中高表達，與宮頸癌細胞侵襲和轉(zhuǎn)移關(guān)系密切[12]。本文的研究結(jié)果顯示，HDAC1基因表達下調(diào)后，SiHa細胞Ac-H4的表達增加，同時細胞NF-κB基因和uPA基因mRNA表達則降低。說明HDAC1 siRNA下調(diào)SiHa細胞HDAC1基因表達，增加組蛋白乙?；?，可抑制NF-κB和uPA基因表達。結(jié)果表明，NF-κB和uPA基因表達下降可能是HDAC1 siRNA抑制宮頸癌SiHa細胞遷移和侵襲的機制之一。

綜上所述，HDAC1基因在宮頸癌侵襲轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用，抑制HDAC1基因表達有望成為宮頸癌新的治療途徑。

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