iNOS在EGCG促A549細(xì)胞凋亡中的作用

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(青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院組織胚胎學(xué)教研室，山東 青島 266021)

誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)正常生理情況下其活性不表達(dá)，而在病理情況下一些細(xì)胞因子可將其激活，如白介素-1、腫瘤壞死因子可以激活NF-κB、蛋白激酶等，進(jìn)一步誘導(dǎo)iNOS 表達(dá)而引起NO合成增加[1]。研究結(jié)果顯示，腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移過(guò)程主要是通過(guò)上調(diào)iNOS活性、引起NO合成增加來(lái)實(shí)現(xiàn)的[2-4]。綠茶內(nèi)含有茶多酚，其主要活性成分為表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯(EGCG)。研究證實(shí)，綠茶及其提取物具有預(yù)防及抗癌的作用。然而，EGCG是否對(duì)人肺腺癌A549細(xì)胞有抑制作用，其抑制作用是否與iNOS表達(dá)有關(guān)系尚未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道。因此，本實(shí)驗(yàn)主要研究EGCG對(duì)人肺腺癌細(xì)胞株A549細(xì)胞抑制作用及其與iNOS表達(dá)量的關(guān)系，為EGCG用于臨床肺癌的治療奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。 現(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

A549細(xì)胞由青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室提供，EGCG購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，一抗iNOS(兔抗人多克隆抗體)購(gòu)自美國(guó)Abcam公司，二抗購(gòu)自博奧森GS公司，RNA抽提試劑盒及RT-PCR試劑盒購(gòu)自大連Takara公司；iNOS和GADPH內(nèi)參引物由上海生工生物工程有限公司合成。

1.2 引物

根據(jù)NCBI基因序列及Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)iNOS、GAPDH 引物，引物序列見(jiàn)表1。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1A549細(xì)胞培養(yǎng)及細(xì)胞增殖活性測(cè)定 將人肺腺癌A549細(xì)胞置于含有體積分?jǐn)?shù)為0.01胎牛血清的DMEM-1640培養(yǎng)基中，置于37 ℃、含體積分?jǐn)?shù)0.05的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)、擴(kuò)增。取指數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，計(jì)數(shù)并取相同細(xì)胞密度接種于96孔板。隨機(jī)分為對(duì)照組和EGCG組，12 h后EGCG組分別加入不同濃度的EGCG，對(duì)照組加入等體積的無(wú)血清DMEM-1640培養(yǎng)液，每組設(shè)5個(gè)平行孔。24 h后用酶標(biāo)免疫測(cè)定儀測(cè)定波長(zhǎng)490 nm處吸光度(A)值，篩選EGCG最佳濃度，以用于下步實(shí)驗(yàn)。

表1 PCR的引物序列

1.3.2A549細(xì)胞凋亡檢測(cè) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，調(diào)細(xì)胞密度為5×108/L，等量接種于6孔板,隨機(jī)分為對(duì)照組(無(wú)血清DMEM-1640)與EGCG組(200 mg/L)，于37 ℃、含體積分?jǐn)?shù)0.05的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。收集所有細(xì)胞，洗滌、重懸、計(jì)數(shù)并避光孵育30 min；Guava Easy Cyte Mini流式細(xì)胞儀檢測(cè)10 000個(gè)細(xì)胞紅色熒光和橙色熒光信號(hào)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用流式四象限散點(diǎn)圖表示，每個(gè)樣品重復(fù)檢測(cè)3次。

1.3.3A549細(xì)胞內(nèi)iNOS蛋白的表達(dá)檢測(cè) ①免疫組化分析iNOS蛋白的表達(dá)：將密度為5×108/L的A549細(xì)胞等量接種于含有多聚賴(lài)氨酸包被的小玻片的6孔板中，隨機(jī)分為對(duì)照組與EGCG組，細(xì)胞處理同上。培養(yǎng)24 h后用冷的40 g/L的多聚甲醛溶液室溫固定10 min, PBS洗3次，每次3 min，具體步驟根據(jù)PV-9000二步法說(shuō)明書(shū)操作。以細(xì)胞內(nèi)呈現(xiàn)黃色或棕褐色顆粒為陽(yáng)性反應(yīng)，隨機(jī)計(jì)數(shù)200個(gè)細(xì)胞，Image-pro Plus軟件分析陽(yáng)性信號(hào)強(qiáng)度。②蛋白質(zhì)印跡定量分析iNOS蛋白的表達(dá)：同上密度的細(xì)胞接種于6孔板中，分組同上，24 h后收集A549細(xì)胞，加入RIPA蛋白裂解液，提取樣品蛋白，BAC法定量蛋白含量；制備SDS-PAGE膠，常規(guī)電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉，一抗(iNOS 1∶2 000)4 ℃孵育過(guò)夜，二抗(1∶2 500)室溫孵育2h，顯色劑(1∶1)顯色，Lane 1D凝膠分析軟件分析，設(shè)未處理的細(xì)胞作為對(duì)照組，GAPDH作為內(nèi)參照。

1.3.4A549細(xì)胞內(nèi)iNOS mRNA表達(dá)檢測(cè) 以Trizol法提取細(xì)胞總RNA，取1 μL反應(yīng)體系，根據(jù)Takara逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng),并參照Takara Real Time-PCR說(shuō)明書(shū)的步驟行PCR擴(kuò)增,具體步驟如下：目的基因與內(nèi)參均為95 ℃預(yù)變性30 s，然后95 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，共35個(gè)循環(huán)。制定標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)公式計(jì)算樣本的拷貝數(shù)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 EGCG對(duì)A549細(xì)胞增殖活性的影響

MTT法的檢測(cè)結(jié)果顯示，50、100、200 mg/L的EGCG對(duì)A549細(xì)胞均有抑制作用，其增殖活性分別為0.165±0.031、0.145±0.003、0.121±0.001，對(duì)照組為0.585±0.002，其中200 mg/L的EGCG組細(xì)胞增殖活性與其他組相比較差異有顯著意義(F=1 000.35，q=3.43～60.00,P<0.05)。200 mg/L的EGCG用于下一步實(shí)驗(yàn)。

2.2 EGCG對(duì)A549細(xì)胞凋亡的影響

EGCG組晚期A549細(xì)胞凋亡率與對(duì)照組比較，差異有顯著性(χ2=65.23,P<0.05)。見(jiàn)圖1。

圖1 EGCG對(duì)A549細(xì)胞早晚期凋亡的影響

2.3 EGCG對(duì)A549細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)和iNOS蛋白表達(dá)的影響

免疫細(xì)胞化學(xué)觀察結(jié)果顯示，與陰性對(duì)照(圖2A)相比，在無(wú)外界刺激時(shí)，A549細(xì)胞的胞質(zhì)和細(xì)胞核內(nèi)iNOS蛋白呈陽(yáng)性表達(dá)(圖2B)。EGCG孵育后可見(jiàn)許多A549細(xì)胞形態(tài)改變，核固縮，有的細(xì)胞染色質(zhì)高度濃縮，呈聚集于核中央部的致密核，有的細(xì)胞染色質(zhì)呈花瓣?duì)罨颦h(huán)狀(圖2C)；胞質(zhì)濃縮、細(xì)胞體積變小，脫落、聚集。EGCG可以降低貼壁生長(zhǎng)的A549細(xì)胞中iNOS蛋白的表達(dá)水平(圖2C)，而固縮變小的A549細(xì)胞中iNOS蛋白表達(dá)增強(qiáng)，核碎裂時(shí)iNOS蛋白表達(dá)降低或呈陰性；對(duì)照組胞質(zhì)與胞核iNOS蛋白的表達(dá)量分別為153.6±2.1、70.7±1.6，EGCG組胞質(zhì)與胞核iNOS蛋白的表達(dá)量分別為90.6±1.0、60.7±1.9。與對(duì)照組比較，EGCG組A549細(xì)胞胞質(zhì)與胞核iNOS蛋白的表達(dá)量明顯降低，差異均有顯著意義(t=8.7、18.2，P<0.05)。蛋白質(zhì)印跡定量分析顯示，對(duì)照組與EGCG組A549細(xì)胞iNOS蛋白的表達(dá)量分別為25.6±1.6、6.4±0.7，與對(duì)照組比較，EGCG組A549細(xì)胞中iNOS蛋白的表達(dá)量明顯降低，差異有顯著性(t=9.4,P<0.05)。見(jiàn)圖3。

2.4 EGCG對(duì)A549細(xì)胞iNOS mRNA表達(dá)影響

正常組與EGCG組A549細(xì)胞iNOS mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為0.565±0.002、0.232±0.003，與對(duì)照組比較，EGCG組iNOS的mRNA相對(duì)表達(dá)量明顯下調(diào)，差異有顯著性(t=5.7,P<0.05)。

圖3 蛋白質(zhì)印跡定量分析A549細(xì)胞中iNOS蛋白的表達(dá)量

3 討 論

NOS是體內(nèi)催化L-精氨酸生成NO的關(guān)鍵酶。目前已知的NOS分為4種類(lèi)型：iNOS、神經(jīng)型NOS(nNOS)、內(nèi)皮型NOS(eNOS)，其中iNOS常在炎癥反應(yīng)、免疫反應(yīng)及老化過(guò)程中被激活，激活后可在皮膚組織內(nèi)產(chǎn)生高水平的NO。NO是一種活性氣體小分子，可通過(guò)不同途徑介導(dǎo)組織損傷、細(xì)胞凋亡等病理過(guò)程[5]。有研究結(jié)果顯示，iNOS可導(dǎo)致心肌細(xì)胞損傷，其機(jī)制可能包括以下幾個(gè)方面：NO反應(yīng)生成超氧自由基，可誘導(dǎo)DNA損傷；NO可抑制線(xiàn)粒體呼吸，阻斷細(xì)胞內(nèi)能量合成及DNA的復(fù)制；NO能直接誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡；NO作為氧自由基，調(diào)節(jié)p53基因，同時(shí)降低Bcl-2和上調(diào)Bax水平，促使Bcl-2/Bax比例失調(diào)，使之堆積并阻止細(xì)胞進(jìn)入DNA合成期[6]。

茶多酚是從綠茶中提取出的多酚類(lèi)化合物，兒茶素是茶多酚的主要成分。EGCG是茶多酚中含量最高，活性最強(qiáng)的單體[7-8]，具有抗氧化、抗炎和抗腫瘤作用。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在濃度為50～200 mg/L范圍內(nèi)，EGCG可明顯抑制人肺腺癌細(xì)胞A549的增殖，其濃度在200 mg/L時(shí)抑制作用更強(qiáng)。流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞結(jié)果顯示，EGCG可使處于早期和晚期凋亡的A549細(xì)胞百分率增加，晚期凋亡率增加更明顯，提示EGCG導(dǎo)致A549細(xì)胞不可逆性凋亡。免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測(cè)結(jié)果顯示，A549細(xì)胞出現(xiàn)核固縮、胞質(zhì)濃縮、細(xì)胞體積變小等凋亡細(xì)胞的形態(tài)學(xué)特征；同時(shí)蛋白質(zhì)印跡定量分析和RealTime-PCR方法檢測(cè)結(jié)果一致，EGCG可抑制iNOS蛋白與mRNA的相對(duì)表達(dá)量。由此推測(cè)，EGCG可能通過(guò)抑制A549細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，下調(diào)iNOS蛋白與mRNA的相對(duì)表達(dá)量發(fā)揮抑癌作用。

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