酶解酸棗仁蛋白制備抗氧化肽的研究

(徐州工程學院食品(生物)工程學院，江蘇徐州 221000)

酸棗仁為鼠李科植物酸棗(Zizyphusjujubavar.sapinosa)的干燥成熟種子，為衛(wèi)生部認定的藥食同源的物品之一。酸棗仁營養(yǎng)成分豐富，富含脂肪酸、蛋白、碳水化合物等營養(yǎng)素，其中蛋白含量約占36%，蛋白中含人體所需的17種氨基酸[1]。目前國內外對酸棗仁的研究主要集中于生物堿[2-3]、皂苷[4]和黃酮[5]等化學成分及藥理功能上，對于酸棗仁蛋白的研究極少，而有關利用酸棗仁蛋白酶解制備抗氧化肽工藝的研究未見報道。通過蛋白質的可控酶解技術制備抗氧化肽，是蛋白質類物質中最有前途的抗氧化物質[6]。利用酶解技術生產抗氧化肽的研究已引起了人們的廣泛關注，有關大豆[7]、玉米[8]、小麥[9]等蛋白來源的抗氧化肽已有較多報道。蛋白酶解產物的抗氧化活性受到酶解pH、溫度、底物濃度、酶與底物濃度比、時間等因素的影響，因此需要對酶解條件進行優(yōu)化。本課題以酸棗仁為原料，對Alcalase蛋白酶酶解酸棗仁蛋白制備抗氧化肽的工藝進行研究，旨在為高活性酸棗仁抗氧化肽的開發(fā)利用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

酸棗仁 安徽亳州藥材市場；Alcalase蛋白酶 丹麥NovoNordisk公司惠贈；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH) Sigma公司；其它試劑為分析純。

723G分光光度計 上海精密科學儀器有限公司；PHS-2C精密酸度計 上海精科雷磁儀器廠；FA2104N電子分析天平 上海精密科學儀器有限公司；HH-4恒溫水浴鍋 河南智成科技發(fā)展有限公司；FFC-23型萬能粉碎機 江陰萬通藥化機械設備廠；TGL-16-B高速臺式離心機 上海安亭科學儀器廠;R201L旋轉蒸發(fā)器 上海申生科技有限公司；TGL-20M高速冷凍離心機 長沙湘儀離心機儀器有限公司；L-8900全自動氨基酸分析儀 日本日立公司。

1.2 酸棗仁蛋白的制備

將粉碎好的酸棗仁粉置于3倍體積(m/V)的石油醚中，于38℃恒溫水浴攪拌30min，室溫3000r/min離心10min去除溶劑。重復3次，基本除去酸棗仁粉中的油脂，過40目篩，得到均一的脫脂酸棗仁粉。稱取100g脫脂酸棗仁粉，以一定比例的蒸餾水溶解(液料比24∶1)，調節(jié)pH11，在57℃下攪拌浸提46min。離心(3000r/min、20min)得上清液，調節(jié)pH至酸棗仁蛋白的等電點pH4.0，于4℃靜置2h，得到蛋白沉淀。重新懸浮沉淀，調節(jié)pH至7.0，4℃透析48h脫鹽。脫鹽后的蛋白溶液冷凍干燥后得酸棗仁蛋白。

1.3 酸棗仁蛋白的酶解工藝

稱取適量酸棗仁蛋白溶于30mL去離子水中，用0.5mol/L的NaOH溶液調酶解pH，混勻。將所得溶液放置入恒溫水浴鍋中，緩慢攪拌的同時加入適量Alcalase 堿性蛋白酶，通過滴加0.5mol/L的NaOH溶液來維持pH不變。到所需反應時間后將酶解液置于沸水中滅酶10min，抽濾，濃縮，冷凍干燥得酸棗仁蛋白酶解產物，酶解產物溶于一定量蒸餾水后測量DPPH自由基清除率。

1.4 DPPH自由基清除率測定

參照Oyaizu[10]報道的方法，稱取適量酸棗仁蛋白酶解產物溶于1.5mL的去離子水中，振蕩使其充分溶解，再加入1.5mL含0.1mmol/L DPPH·的95%乙醇，混合、振蕩，在室溫下避光放置30min，然后在波長517nm處檢測吸光度。

清除率計算公式如下：

清除率(%)=[1-(Ai-Aj)/Ac]×100

式中：Ac-為對照組吸光值，1.5mL蒸餾水加1.5mL含0.1mmol/L DPPH·的95%乙醇；Ai-為樣品組吸光值，1.5mL樣品液加1.5mL含0.1mmol/L DPPH·的95%乙醇；Aj-為空白組吸光值，1.5mL樣品液加1.5mL 95%乙醇。

1.5 單因素試驗

考察酶解溫度、底物濃度、酶與底物濃度比([E]/[S])、pH、酶解時間對DPPH·清除率的影響。

酶解溫度考察的水平分別為40、45、50、55、60℃，其他酶解條件底物濃度、[E]/[S]、pH、時間分別為3%、2%、8.0、30min。

底物濃度考察的水平分別為1%、2%、3%、4%、5%，其他酶解條件溫度、[E]/[S]、pH、時間分別為50℃、2%、8.0、30min。

[E]/[S]考察的水平分別為1%、2%、3%、4%、5%，其他酶解條件溫度、底物濃度、pH、時間分別為50℃、3%、8.0、30min。

酶解pH考察的水平分別為7、7.5、8、8.5、9，其他酶解條件溫度、底物濃度、[E]/[S]、時間分別為50℃、3%、2%、30min。

酶解時間考察的水平分別為20、30、40、50、60min，其他酶解條件為溫度、底物濃度、[E]/[S]、pH分別為50℃、3%、2%、8.0。

1.6 Box-Behnken試驗設計

在單因素試驗的基礎上，確定酶與底物濃度比4%，酶解時間40min。采取Box-Behnken中心組合試驗設計，以酶解溫度(x1)、pH(x2)和底物濃度(x3)為自變量，以DPPH自由基清除率為響應值，安排三因素三水平試驗，各個因素水平編碼值見表1。

表1 Box-Behnken試驗設計因素水平編碼表Table 1 Factors and levels of Box-Behnken experiments

1.7 酶解產物氨基酸組成的分析

酸水解法(6mol/L HCl于110℃水解24h)分析酶解產物的氨基酸組成[7]。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 酶解溫度對酸棗仁蛋白酶解物清除DPPH自由基的影響 酶解溫度對酸棗仁蛋白酶解物清除DPPH自由基的影響見圖1，清除率隨酶解溫度的增加先升高后降低，在酶解溫度為50℃時，酶活最高，酶解物得率較高，清除率相對較高，溫度大于50℃后，酶解產物清除DPPH自由基的能力下降，可能的原因是酶活受到抑制，酶解產物得率急劇下降，故選擇較優(yōu)酶解溫度為50℃。

圖1 酶解溫度對酸棗仁蛋白酶解物清除 DPPH自由基的影響 Fig.1 Effect of temperature on the DPPH scavenging rate of enzymatic hydrolysate of Zizyphi Spinosi Semen protein

2.1.2 底物濃度對酸棗仁蛋白酶解物清除DPPH自由基的影響 不同底物濃度下的清除率見圖2，清除率隨著底物濃度的增加而增加，而當底物濃度超過4%時，DPPH自由基清除率增幅緩慢，這是因為底物濃度已過量，考慮到生產成本，故確定底物濃度為4%。

圖2 底物濃度對酸棗仁蛋白酶解物清除 DPPH自由基的影響 Fig.2 Effect of substrate concentration on the DPPH scavenging rate of enzymatic hydrolysate of Zizyphi Spinosi Semen protein

2.1.3 酶與底物濃度比([E]/[S])對酸棗仁蛋白酶解物清除DPPH自由基的影響 酶與底物濃度比([E]/[S])對酸棗仁蛋白酶解物清除DPPH自由基的影響如圖3所示，清除率隨著[E]/[S]的增加而增加，[E]/[S]為4%和5%下的清除率基本保持一致。其原因是在底物過飽和時，增加酶量可以提高酶與底物的結合，從而加快酶促反應速率，當酶量增加到一定值后，酶分子趨向飽和，此時繼續(xù)增大酶量對反應速率貢獻不大[11]。故確定[E]/[S]為4%。

圖3 酶與底物濃度比([E]/[S]) 對酸棗仁蛋白酶解物清除DPPH自由基的影響 Fig.3 Effect of [E]/[S] on the DPPH scavenging rate of enzymatic hydrolysate of Zizyphi Spinosi Semen protein

2.1.4 pH對酸棗仁蛋白酶解物清除DPPH自由基的影響 圖4為pH對酸棗仁蛋白酶解物清除DPPH自由基的影響。清除率隨pH的增加呈現出先升高后降低的趨勢，當pH為8.0時，酶活最高，得到的酶解產物最高，清除率最高，故選較優(yōu)pH為8.0。

圖4 pH對酸棗仁蛋白酶解物清除DPPH自由基的影響 Fig.4 Effect of pH on the DPPH scavenging rate of enzymatic hydrolysate of Zizyphi Spinosi Semen protein

2.1.5 酶解時間對酸棗仁蛋白酶解物清除DPPH自由基的影響 圖5為酶解時間對清除率的影響，清除率隨酶解時間的增加逐漸升高，酶解時間在20～40min之間，清除率顯著增加，當超過40min后，底物幾乎完全被酶解，清除率趨于平緩，故確定酶解時間為40min。

圖5 酶解時間對酸棗仁蛋白酶解物清除 DPPH自由基的影響 Fig.5 Effect of time on the DPPH scavenging rate of enzymatic hydrolysate of Zizyphi Spinosi Semen protein

2.2 Box-Behnken試驗設計

在單因素試驗的基礎上，確定[E]/[S]為4%，酶解時間為40min，選取酶解溫度、pH、底物濃度三個因素安排Box-Behnken試驗設計，結果如表2所示。

表2 試驗設計及結果Table 2 Design and results of experiments

2.2.1 回歸模型的建立與檢驗 對表2試驗數據用多元回歸擬合后，得到清除率(Y)與酶解溫度(x1)、pH(x2)和底物濃度(x3)的回歸方程：

Y=-3175.392+34.293x1+596.521x2-7.402x3-1.317x1x2+0.452x1x3+0.435x2x3-0.252x12-32.916x22-4.047x32

對該回歸方程進行方差分析，結果見表3。

表3 回歸模型方差分析Table 3 Analysis of variance with regression model

對表3回歸模型系數的顯著性分析可見，一次項中，x2、x3極顯著(p<0.01)，x1達到顯著水平(p<0.05)；平方項的回歸系數均極顯著，說明各因素與清除率之間存在明顯的二次關系；二次項中x1x2的回歸系數均達到極顯著水平(p<0.01)，x1x3的達到顯著水平(p<0.05)，表明酶解溫度和pH、酶解溫度和底物濃度之間的交互作用對酶解產物的清除率有顯著影響。

2.2.2 兩因素間的交互效應分析 固定一個因素在零水平上，研究另兩個因素間的交互效應。

固定底物濃度于零水平時，繪出酶解溫度和pH的交互效應的響應面，如圖6a清除率隨酶解溫度和pH的變化會產生較大變化，隨著酶解溫度和pH的增加，清除率明顯呈現出先增后減的趨勢。若要獲得較高的清除率，酶解溫度應該在50.0～52.5℃之間，pH應該在8.0～8.3之間。在不同的酶解溫度水平下，隨著pH的增大，清除率變化的程度不同；在不同的pH水平下，隨著酶解溫度的增加，清除率變化的程度亦不同。

圖6b為酶解溫度和底物濃度的交互效應的響應面。若要獲得較高的清除率，酶解溫度應該在50.0～52.5℃之間，底物濃度應該在4.5%～5.0%之間，底物濃度對清除率的影響較酶解溫度更為敏感。

圖6 試驗因素交互作用對酸棗仁蛋白酶解物清除 DPPH自由基的影響 Fig.6 Interactive effect of three factors on the DPPH scavenging rate of enzymatic hydrolysate of Zizyphi Spinosi Semen protein

2.2.3 最佳條件優(yōu)化及驗證結果 通過所得回歸模型對提取工藝進行優(yōu)化，得出最佳提取工藝條件為酶解溫度51.2℃、酶解pH8.1、底物濃度4.7%，在此條件下清除率的最大理論值為91.59%。對此優(yōu)化條件進行驗證，實測清除率為91.54%，與預測值基本一致，表明該回歸模型具有較好的預測性能，可用于指導生產實踐。

2.3 酶解產物氨基酸組成分析

酸棗仁蛋白酶解產物的氨基酸組成見表4，由表4可知，酶解產物共含有17種氨基酸，其中富含脯氨酸、甘氨酸和谷氨酸，蛋氨酸含量較低，脯氨酸和甘氨酸殘基能表現出較好的抗氧化性[12]。此外，總疏水基氨基酸的含量高達48.440%，而總疏水基氨基酸的含量與抗氧化能力呈正相關性[13]。

表4 酶解產物氨基酸組成Table 4 Amino acid composition analysis of enzymatic hydrolysate

3 結論

以DPPH自由基清除率作為指標評價了酸棗仁蛋白酶解物的抗氧化活性，在單因素試驗的基礎上，確定[E]/[S]為4%，酶解時間為40min后，通過Box-Behnken試驗設計建立了DPPH自由基清除率與酶解溫度、酶解pH和底物濃度的二次多項式模型，最佳制備工藝參數為酶解溫度51.2℃、酶解pH8.1、底物濃度4.7%，在此條件下清除率的最大理論值為91.59%。此模型在試驗范圍內能較準確地預測酸棗仁蛋白酶解物對DPPH自由基的清除率。酸棗仁蛋白酶解產物富含脯氨酸、甘氨酸和谷氨酸。

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