花椒麻味素劑量 對(duì)SD雌性大鼠腸道健康的影響

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(西南大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院,重慶 400715)

花椒別名為川椒、紅椒、蜀椒、大紅袍。它具有溫中散寒、殺蟲、祛濕、止痛等功能?；ń分械闹饕瘜W(xué)成分有揮發(fā)油、生物堿、酰氨、木脂素、香豆素、黃酮類物質(zhì)、脂肪酸[1-2]等,其它成分還有二萜、甾醇、烴類和黃酮甙類[3]等?；ń仿槲端厥腔ń分兄匾幕钚猿煞?是花椒呈麻味的主要成分,花椒麻味素在花椒中大多以鏈狀不飽和脂肪酸酰胺的形式存在,在其他物質(zhì)中則以帶芳環(huán)的酰胺形式存在[4],所以又稱花椒酰胺。花椒的麻味成分不僅具有麻醉、興奮、抑菌、祛風(fēng)除濕、殺蟲和鎮(zhèn)痛等功效,同時(shí)還具有抗血小板凝集、松弛胃體的環(huán)形肌和回腸縱向肌等有益健康的功能[5]。

腸道健康與人體健康關(guān)系密切,腸道健康又與腸道微生物緊密聯(lián)系。正常人體大腸中含有約1013～1014個(gè)微生物,它們對(duì)維持腸道正常的生理功能具有重要作用。腸道微生物每天消耗約60～80g進(jìn)入大腸的多糖、低聚糖、蛋白質(zhì)、肽和糖蛋白等未消化殘?jiān)?。糖類底物在腸道中發(fā)酵會(huì)產(chǎn)生短鏈脂肪酸(SCFAs)和氣體(CO2,CH4,H2),SCFAs主要是乙酸、丙酸、丁酸,其次還有異丁酸[6]。含氮底物化合物發(fā)酵則產(chǎn)生游離氨、苯酚等有害產(chǎn)物。

目前國(guó)內(nèi)外對(duì)花椒麻味素的研究集中于花椒的麻醉效果,而花椒麻味素對(duì)腸道健康的研究較少。本實(shí)驗(yàn)室前期研究了花椒精對(duì)腸道健康的影響,結(jié)果表明花椒精能促進(jìn)腸道發(fā)酵,有益腸道健康。因?yàn)榛ń肪泻?2.18%的花椒麻味素,所以本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步研究了花椒麻味素對(duì)腸道健康的影響情況。預(yù)測(cè)在食品,醫(yī)藥等方面會(huì)被廣泛應(yīng)用。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

SD雌性大鼠 動(dòng)物許可證號(hào):SCXK(渝)20070008,體重90～110g,40只,百森生物技術(shù)公司;花椒麻味素 實(shí)驗(yàn)室提取,純度為95.7%;基礎(chǔ)飼料 百森生物技術(shù)公司;巴豆酸(色譜級(jí)) 日本東京天成工業(yè)株式會(huì)社;氫氧化鈉、苯酚、次氯酸鈉、鎢酸鈉、硫酸 分析純,成都市科龍化工試劑廠;乙酸(色譜級(jí)) 英國(guó)Johnson Matthey公司;丙酸(色譜級(jí))、丁酸(色譜級(jí))、異丁酸(色譜級(jí)) 梯希愛(ài)(上海)化成工業(yè)發(fā)展有限公司;亞硝基鐵氰化鈉(分析純) 天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所。

GC-2010高效氣相色譜儀 日本島津公司;pH計(jì)H18424 意大利HANNA公司;Spectrumlab 22可見(jiàn)光分光光度計(jì) 上海棱光技術(shù)有限公司;千分之一天平HZT-300-A 福州華志科學(xué)儀器公司。

1.2 動(dòng)物飼養(yǎng)與樣品采集

將購(gòu)買的4周齡SD雌性大鼠40只放入不銹鋼鼠籠中,每籠飼養(yǎng)1只大鼠,室溫保持在(25±1)℃,12h明暗輪換(9:00～21:00)。喂食基礎(chǔ)飼料(表1)一周使大鼠適應(yīng)喂養(yǎng)環(huán)境后,按大鼠體重隨機(jī)將大鼠分為空白組(LOD)、高脂組即高脂空白組(HF-LOD)、高脂并灌胃4mg/kg(HF-CD)、高脂并灌胃8mg/kg(HF-MD)、高脂并灌胃12mg/kg(HF-HD)花椒麻味素的大豆油溶液等共5組各8只。高脂組每天喂食高脂飼料并且每天15:00對(duì)高脂組灌喂花椒麻味素,花椒麻味素需溶于大豆油中配成溶液。灌胃劑量均為每100g體重0.1mL。所有實(shí)驗(yàn)大鼠實(shí)驗(yàn)期間自由攝食和飲水,每3d稱量一次大鼠體重,同時(shí)需調(diào)整灌喂量,每天記錄大鼠采食量。喂養(yǎng)4周后解剖,測(cè)定各批盲腸內(nèi)容物重量、盲腸壁面積、游離氨、pH和短鏈脂肪酸(short-chain fatty acid,SCFAS)和微生物。

1.3 檢測(cè)指標(biāo)與方法

1.3.1 SCFAS測(cè)定 將預(yù)處理的盲腸內(nèi)容物樣品在4000r/min轉(zhuǎn)速下離心15min,吸取上清液轉(zhuǎn)移至預(yù)處理10mL離心管中,10000r/min轉(zhuǎn)速下繼續(xù)離心15min,1mL一次性注射器吸取上清液1mL,0.25μm濾膜過(guò)濾至2mL進(jìn)樣小瓶中待測(cè)[7]。

表1 基礎(chǔ)飼料配方Table 1 Composition of the basic diet

氣相色譜條件:進(jìn)樣量1μL;進(jìn)樣口溫度220℃;柱流量0.95mL/min,柱溫90℃、平衡時(shí)間0.5min,5℃/min升溫至150℃,保留時(shí)間7min;檢測(cè)器溫度230℃;氫氣流量40mL/min,空氣流量400mL/min,尾吹流量40mL/min[8]。

1.3.2 pH測(cè)定 電位法。

稱取一定質(zhì)量的新鮮糞便/盲腸內(nèi)容物于10mL去離子水預(yù)處理離心管中,加入10倍(V∶m)去離子水,旋渦混合儀上混勻后靜置,測(cè)上清液pH。

1.3.3 盲腸內(nèi)容物及腸壁重量 稱重法。

1.3.4 游離氨含量測(cè)定 比色法。

無(wú)氨水制備[9]:在1000mL蒸餾水中加入0.10mL硫酸(ρ=1.84g/mL),并在全玻璃蒸餾器中重蒸餾,棄去前50mL蒸出液,然后將蒸出液收集在帶有玻璃塞的玻璃瓶中。

將預(yù)處理的盲腸內(nèi)容物樣品4000r/min下離心5min,吸取上清液1mL,依次加入1mL含有0.001mol/L亞硝基鐵氰化鈉的0.5mol/L苯酚溶液和1mL含有0.03mol/L次氯酸鈉的0.625mol/L氫氧化鈉溶液,60℃保溫5min,625nm波長(zhǎng)下測(cè)吸光度[10]。

1.3.5 盲腸壁面積測(cè)定 首先用冰冷生理鹽水洗凈盲腸,充分展開后固定在A4紙上,勾出其輪廓,待紙干燥后將盲腸壁輪廓復(fù)寫在厚的打印紙上,然后將紙上的盲腸輪廓圖剪下。用精密度為0.0001g的電子秤準(zhǔn)確稱量輪廓圖紙質(zhì)量(m2)和1cm2的打印紙質(zhì)量(m1),然后按以下公式計(jì)算盲腸表面積(cm2)。

1.3.6 盲腸內(nèi)容物菌群測(cè)定 取新鮮的盲腸內(nèi)容物0.2g左右,加入10倍(V/m)無(wú)菌生理鹽水,旋渦混合儀振蕩混勻,制得10-1稀釋度盲腸內(nèi)容物。依次10倍稀釋至10-8稀釋度,選擇10-1、10-2、10-3三個(gè)稀釋度,用于大腸桿菌和腸球菌的培養(yǎng)計(jì)數(shù);選擇10-4、10-5、10-6三個(gè)稀釋度,用于雙歧桿菌和乳酸桿菌的培養(yǎng)計(jì)數(shù),選擇10-2、10-3、10-4三個(gè)稀釋度,用于厭氧菌的培養(yǎng)計(jì)數(shù),接種量為200μL。

表3 花椒麻味素對(duì)SD雌性大鼠盲腸壁濕重與盲腸總重之比、盲腸面積、游離氨和pH的影響Table 3 Effects of dietary sanshool on wall wet weight Wet weight and total weight of the wall,wall area,free ammonia and pH in female Sprague-Dawley rats

表4 花椒麻味素對(duì)SD雌性大鼠盲腸內(nèi)容物中短鏈脂肪酸的影響Table 4 Effects of dietary sanshool on SCFAS in female Sprague-Dawley rats

雙歧桿菌于BLL培養(yǎng)基37℃、48h厭氧培養(yǎng)。乳桿菌于MRS培養(yǎng)基37℃、48h培養(yǎng)。腸桿菌于伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基37℃、24h培養(yǎng)。腸球菌于疊氮鈉-結(jié)晶紫-七味苷培養(yǎng)基37℃、48h培養(yǎng)。厭氧菌于靛基質(zhì)培養(yǎng)基37℃、48h培養(yǎng)。結(jié)果均以lg(CFU/g)表示。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

實(shí)驗(yàn)結(jié)果以mean ± SD表示,各組間顯著性差異采用SPSS分析,p<0.05被認(rèn)為有顯著差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 花椒麻味素對(duì)SD雌性大鼠采食量、體重增加量及飼料效率的影響

由表2可以看出,高脂空白組與空白組相比,體重增加量增加了,采食量卻顯著降低(p<0.05),飼料效率顯著增加(p<0.05)。說(shuō)明高脂膳食能促進(jìn)SD大鼠體重增加,同時(shí)能明顯降低食欲從而減少飼料的攝入及能夠提高飼料效率;而高脂空白組與劑量組相比,體重增加量和飼料效率都顯著性增加,說(shuō)明飼料中的脂肪能降低SD大鼠的食欲,進(jìn)而減小了飼料的攝入。

表2 花椒麻味素對(duì)SD雌性大鼠采食量、 體重增加量及飼料效率的影響Table 2 Effects of dietary sanshool on body weight gain,food intake and feed efficiency in female Sprague-Dawley rats

2.2 花椒麻味素對(duì)SD雌性大鼠盲腸壁濕重與盲腸總重之比、盲腸面積、游離氨和pH的影響

由表3可知,高脂空白組與空白組相比,SD大鼠的盲腸面積顯著增加。說(shuō)明飼料中的脂肪能抑制盲腸組織的縱向生長(zhǎng),促進(jìn)盲腸的橫向生長(zhǎng);高脂空白組與劑量組相比,盲腸面積顯著增加,低、高劑量組的游離氨含量顯著增加,高劑量組的pH顯著降低。說(shuō)明花椒麻味素能抑制由脂肪引起的盲腸組織的橫向生長(zhǎng),低、高劑量的花椒麻味素能促進(jìn)細(xì)菌分泌脲酶,進(jìn)而分解尿總堿產(chǎn)生游離氨,中劑量的花椒麻味素則能促進(jìn)大腸中能夠利用游離氨合成蛋白質(zhì)的細(xì)菌的合成作用。盲腸內(nèi)pH的降低會(huì)促進(jìn)腸道細(xì)菌分泌的脲酶的活性,進(jìn)而促進(jìn)了尿總堿的分解產(chǎn)生游離氨。

2.3 花椒麻味素對(duì)SD雌性大鼠盲腸內(nèi)容物中短鏈脂肪酸的影響

由表4得知,高脂空白組與空白組相比,盲腸內(nèi)容物中各種短鏈脂肪酸的變化不大,說(shuō)明飼料中的脂肪對(duì)盲腸內(nèi)飼料的發(fā)酵影響不大;高脂空白組與劑量組相比,中劑量組的丙酸、異丁酸和總的短鏈脂肪酸都顯著性增加,說(shuō)明中劑量的花椒麻味素能促進(jìn)飼料在盲腸中的發(fā)酵進(jìn)而產(chǎn)生較多的短鏈脂肪酸。

2.4 花椒麻味素對(duì)SD雌性大鼠盲腸內(nèi)容物中微生物的影響

由表5可以看出,高脂空白組與空白組相比,盲腸中雙歧桿菌的數(shù)量顯著降低,說(shuō)明高脂膳食能抑制腸道有益菌的生長(zhǎng);高脂空白組與劑量組相比,中劑量組的腸球菌顯著降低、乳酸菌顯著增加及厭氧菌的數(shù)量顯著增加,中、高劑量組的大腸桿菌顯著降低了,各劑量組的雙歧桿菌顯著增加,說(shuō)明花椒麻味素能促進(jìn)腸道有益菌的生長(zhǎng),抑制腸道有害菌的生長(zhǎng),尤其是中劑量組的作用效果最明顯。

表5 花椒麻味素對(duì)SD雌性大鼠盲腸內(nèi)容物中微生物的影響Table 5 Effects of dietary sanshool on microorganism in female Sprague-Dawley rats

3 結(jié)論與討論

大鼠體重增加量間接反映飼料在胃腸道內(nèi)消化吸收的利用情況,在機(jī)體運(yùn)動(dòng)量與基本代謝量一致的情況下,灌喂花椒麻味素大鼠的體重增加量增加,說(shuō)明花椒麻味素能夠促進(jìn)飼料的消化利用率,使飼料充分轉(zhuǎn)化為能被機(jī)體消化吸收的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。從采食量來(lái)看,高脂空白組及劑量組的飼料攝入量明顯降低,說(shuō)明脂肪和花椒麻味素都能夠抑制食欲,減少攝食量。

高脂空白組與空白組相比,盲腸壁濕重占總重比值降低,盲腸面積卻顯著增加。說(shuō)明脂肪抑制盲腸組織的縱向生長(zhǎng),促進(jìn)盲腸組織的橫向生長(zhǎng)。高脂空白組和劑量組相比,盲腸面積顯著減小,說(shuō)明花椒麻味素能抑制盲腸組織就脂肪引起的橫向生長(zhǎng)。

游離氨主要是小腸中谷氨酰胺代謝產(chǎn)生[11],大腸微生物代謝也可以產(chǎn)生[12-14]。腸道內(nèi)游離氨主要是由細(xì)菌分泌的脲酶分解尿總堿產(chǎn)生的,一部分游離氨在大腸中被用于細(xì)菌蛋白質(zhì)的合成[15]。有研究表明,腸道菌群嚴(yán)重失調(diào)(雙歧桿菌下降,大腸桿菌、梭菌大量繁殖),尿總堿合成受阻,會(huì)產(chǎn)生更多的氨[16]。高脂空白組與劑量組相比,低、高劑量組的游離氨含量顯著增加,高劑量組的pH顯著降低,說(shuō)明低、高劑量的花椒麻味素能促進(jìn)細(xì)菌分泌脲酶,進(jìn)而分解尿總堿產(chǎn)生游離氨,中劑量的花椒麻味素則能促進(jìn)大腸中能夠利用游離氨合成蛋白質(zhì)的細(xì)菌的合成作用。盲腸內(nèi)pH的降低會(huì)促進(jìn)腸道細(xì)菌分泌的脲酶的活性,進(jìn)而促進(jìn)了尿總堿的分解產(chǎn)生游離氨。

飼料中的抗消化淀粉在腸道經(jīng)厭氧菌發(fā)酵能產(chǎn)生短鏈脂肪酸,主要是乙酸、丙酸、丁酸,其次還有異丁酸[17-18]。SCFAs是大腸通常的生理功能性物質(zhì),具有調(diào)節(jié)腸肌活力、刺激電解液和流體的增加、增加血流及修復(fù)DNA損傷等[19-22]。SCFAs不僅為結(jié)腸粘膜提供了主要的能量供應(yīng),而且還可以維護(hù)腸道上皮細(xì)胞的完整性和杯狀細(xì)胞的分泌功能。對(duì)粘膜免疫細(xì)胞有維護(hù)作用,還可以減少促炎因子的生成,有利于粘膜炎癥的修復(fù)。乙酸有增強(qiáng)結(jié)腸血供給和氧攝取的作用,丙酸對(duì)葡萄糖的異生有一定作用[23],丁酸是腸壁細(xì)胞首選的氧化底物,也能抑制腸癌細(xì)胞增生和增強(qiáng)脫噬作用[24-25]。SCFAS還可以降低盲腸中pH,進(jìn)而促進(jìn)腸健康[26]。高脂空白組與劑量組相比,中劑量組的丙酸、異丁酸和總的短鏈脂肪酸都顯著性增加,說(shuō)明中劑量的花椒麻味素能促進(jìn)飼料在盲腸中的發(fā)酵進(jìn)而產(chǎn)生較多的短鏈脂肪酸。

作為腸道中重要的生理菌群,雙歧桿菌能大量合成動(dòng)物所需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和維生總堿,對(duì)多種腸道病原微生物產(chǎn)生拮抗,調(diào)節(jié)腸道菌群,增強(qiáng)機(jī)體免疫力,還能抗腫瘤,抗衰老,抗感染,以及提高人體對(duì)放射線的耐受力。低劑量的花椒麻味素就能夠促進(jìn)盲腸中雙歧桿菌的生長(zhǎng),說(shuō)明食用花椒麻味素能促進(jìn)腸道健康。高脂空白組與空白組相比,盲腸中雙歧桿菌的數(shù)量顯著降低,說(shuō)明高脂膳食能抑制腸道有益菌的生長(zhǎng);高脂空白組與劑量組相比,中劑量組的腸球菌顯著降低、乳酸菌顯著增加及厭氧菌的數(shù)量顯著增加,中、高劑量組的大腸桿菌顯著降低了,各劑量組的雙歧桿菌顯著增加,說(shuō)明花椒麻味素能促進(jìn)腸道有益菌的生長(zhǎng),抑制腸道有害菌的生長(zhǎng)。

通過(guò)本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以知道,短期食用花椒麻味素對(duì)機(jī)體腸道健康是有益的。但因本實(shí)驗(yàn)時(shí)間有限,未能深入研究長(zhǎng)期食用花椒麻味素對(duì)腸道健康的影響及影響腸道健康的機(jī)理,還需進(jìn)一步研究。

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