色譜和電泳技術(shù) 在乳清蛋白分離檢測中的應(yīng)用

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(乳業(yè)生物技術(shù)國家重點實驗室,光明乳業(yè)股份有限公司光明乳業(yè)研究院,上海 200436)

乳清蛋白是牛奶中重要的一類蛋白,其主要來源于干酪生產(chǎn)過程中排出的乳清。據(jù)統(tǒng)計,每生產(chǎn)1t的奶酪對應(yīng)產(chǎn)生的乳清量即達(dá)9t,且新鮮乳清中含有約原料乳中一半的營養(yǎng)成分(主要是乳清蛋白和乳糖)。乳清蛋白中主要含有可溶性蛋白,包括β-乳球蛋白(β-Lg)、α-乳白蛋白(α-La)、免疫球蛋白(Ig)、牛血清白蛋白(BSA)等[1]。大量研究[2-6]已經(jīng)表明:乳清中各類蛋白均具有一定的生物活性和功能(表1),所以建立各類乳清蛋白的檢測和分離方法對于乳清的開發(fā)和利用起到關(guān)鍵作用。現(xiàn)階段,無論是在乳清蛋白的檢測還是分離方法上,色譜和電泳技術(shù)的應(yīng)用非常廣泛。其中,檢測的技術(shù)主要包括:高效液相色譜、毛細(xì)管電泳和聚丙烯酰胺凝膠電泳等方法;分離的技術(shù)主要包括:離子交換色譜、凝膠色譜和疏水作用色譜等方法。本文總結(jié)上述色譜和電泳技術(shù)在乳清蛋白中檢測和分離方面的應(yīng)用,為乳清工業(yè)化利用提供參考。

1 色譜和電泳技術(shù)

色譜法又稱為層析法,其原理是利用不同物質(zhì)在不同相態(tài)的選擇性分配,以流動相對固定相中的混合物進(jìn)行洗脫,混合物中不同物質(zhì)由于物化性質(zhì)的差異以不同的速度沿固定相移動,最終達(dá)到分離的效果。根據(jù)物質(zhì)的分離機(jī)制,主要分為吸附色譜、分配色譜、離子交換色譜、凝膠色譜和親和色譜等類別?，F(xiàn)階段,色譜技術(shù)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于化工、醫(yī)藥、食品、環(huán)境等領(lǐng)域的檢測和分離。

電泳法的基本原理是帶電顆粒在外加電場的作用下,向相反電極移動,遷移過程中依據(jù)帶電粒子的分子量和電性差異將物質(zhì)彼此分離出來。1937年瑞典學(xué)者蒂塞利烏斯設(shè)計出了移動界面電泳儀,從馬血清白蛋白中分離出三種球蛋白,并由此創(chuàng)建了電泳技術(shù)。根據(jù)工作原理的不同可以分為:移界電泳、區(qū)帶電泳、等速電泳、等電聚焦電泳、毛細(xì)管電泳等。其中區(qū)帶電泳和毛細(xì)管電泳技術(shù)在現(xiàn)代生物大分子的分析和檢測中引用非常廣泛,如測定核酸的瓊脂糖凝膠電泳,分析蛋白質(zhì)的聚丙烯酰胺凝膠電泳和SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳,以及和高效液相色譜技術(shù)具有同樣應(yīng)用前景的毛細(xì)管電泳技術(shù)。

表1 幾種乳清蛋白的化學(xué)性質(zhì)和生理功能Table 1 Chemical properties and physiological functions of whey protein

2 色譜和電泳技術(shù)在乳清蛋白檢測中的應(yīng)用

2.1 高效液相色譜技術(shù)

高效液相色譜(high performance liquid chromatography,HPLC)技術(shù)是在氣相色譜技術(shù)及理論的成熟發(fā)展之上演變的以液體為流動相并配有高壓輸液系統(tǒng)、分離色譜柱和檢測系統(tǒng)的分析技術(shù)?，F(xiàn)階段,主要采用的是反相高效液相色譜技術(shù),其特點是:固定相為非極性材料,流動相為極性物質(zhì),流動相的極性大于固定相,該技術(shù)普遍用于非極性和弱極性物質(zhì)的分離。

常用于乳清蛋白組分分析的HPLC色譜柱是C4、C8和C18色譜柱[7-9],流動相均采用0.1%的三氟乙酸水溶液和0.1%的三氟乙酸乙腈溶液進(jìn)行梯度洗脫,檢測波長為214～220nm之間。李慧[8]在利用HPLC法測定乳清蛋白中α-乳白蛋白和β-乳球蛋白時采用C8色譜柱,流動相:A相為0.1%的三氟乙酸水溶液,B相為0.1%的三氟乙酸乙腈溶液,洗脫程序為:0～10min B相從20%到50%,11～20min B相從50%到80%,21～22min B相從80%到20%,流速為0.8mL/min,檢測波長為215nm,柱溫30℃。結(jié)果表明:該方法的出峰快,峰型尖銳且對稱,最終α-乳白蛋白的出峰時間在14.6min左右,β-乳球蛋白的出峰時間在15.6min左右。但由于目前嬰幼兒配方奶粉中的α-乳白蛋白在噴霧干燥過程中部分結(jié)構(gòu)會發(fā)生改變,這就導(dǎo)致C18柱不能檢測出所有的α-乳白蛋白。蘇米亞[9]利用巰基乙醇作為還原劑對樣品進(jìn)行前處理,破壞蛋白質(zhì)中的二硫鍵形成展開的單體結(jié)構(gòu),使用鹽酸胍緩沖液作為溶解液和流動相,檢測波長為280nm,目標(biāo)物質(zhì)20min內(nèi)即出峰且分離效果較好,可用于嬰幼兒配方奶粉產(chǎn)品質(zhì)量的評價。

雖然高效液相色譜技術(shù)在乳清蛋白的分析過程中應(yīng)用最廣泛,但是通常用于HPLC色譜柱填料的直徑為5μm,這在分離目標(biāo)產(chǎn)物的時間上會花費較長時間[10]。近年來,超高效液相色譜技術(shù)(ultra high performance liquid chromatography,UHPLC)的應(yīng)用能夠彌補(bǔ)這一不足。UHPLC色譜柱填料的直徑降低為5～1.7μm,固定相的粒徑越小,理論塔板高度越小,柱效也就越高;同時,色譜填料的直徑降低會增大比表面積,從而使峰容量增加,可分辨出更多的物質(zhì)。除此之外,質(zhì)譜(mass spectrometric,MS)技術(shù)的特殊選擇性和對物質(zhì)結(jié)構(gòu)的進(jìn)一步解析也使得其在蛋白質(zhì)分析上起到重要的作用[11]。越來越多的研究也證實LC-MS的聯(lián)合應(yīng)用技術(shù)在蛋白質(zhì)分析領(lǐng)域是一項非常有力的工具。Yiping Ren[12]采用UHPLC-MS聯(lián)用技術(shù)同時測定了α-乳白蛋白和β-乳球蛋白的含量。流動相仍采用0.1%的三氟乙酸水溶液和0.1%的三氟乙酸乙腈溶液,分離柱為直徑1.7μm的C18色譜柱。該方法不僅縮短了檢測時間(6min內(nèi)檢測出來兩種蛋白)同時增加了最低檢測限度(最低檢測限達(dá)到0.15～0.19μg/mL)。

2.2 毛細(xì)管電泳技術(shù)

毛細(xì)管電泳(capillary electrophoresis,CE)技術(shù)是一種以毛細(xì)管為分離通道,以高壓直流電場為驅(qū)動力,根據(jù)被分析物質(zhì)的特性差異實現(xiàn)分離分析的技術(shù)。CE是繼高效液相色譜之后又一重大分析分離技術(shù)。該技術(shù)具有分離效率高、操作簡單、經(jīng)濟(jì)、微量分析等優(yōu)點。目前,CE技術(shù)已經(jīng)是生命科學(xué)等領(lǐng)域中一種常用的分析手段,廣泛應(yīng)用于蛋白質(zhì)、氨基酸、無機(jī)離子和有機(jī)化合物的分析中。

近年來,研究人員關(guān)于毛細(xì)管電泳技術(shù)在乳制品中乳清蛋白(主要是α-乳白蛋白和β-乳球蛋白)的定量分析[13-17]作了深入研究。尹睿杰[13]利用pH為3的檸檬酸緩沖液為運行緩沖液,未涂層熔融石英毛細(xì)管為分離柱,分離電壓為28kV的條件對牛乳中α-乳白蛋白和β-乳球蛋白進(jìn)行了定量分析。結(jié)果顯示,兩種蛋白的檢出限分別為13.2、20.0μg/mL,線性范圍分別為30～2940、50～4960μg/mL。宋寶花[14]通過對硼酸鹽運行緩沖液的pH進(jìn)行優(yōu)化得出硼酸鹽緩沖體系的pH為9.1時最合適,但此條件下,α-乳白蛋白和β-乳球蛋白(A、B型)的分離效果不好,通過加入0.8g/L PEO(聚氧化乙烯)和25mmol/L HP-β-CD(羥丙基-β-環(huán)糊精)解決了蛋白在管壁的吸附問題,從而達(dá)到三種蛋白的有效分離。根據(jù)文獻(xiàn)報道,乳清蛋白在pH為5.8～7.0[18]的條件下結(jié)構(gòu)最為穩(wěn)定,而上述研究中運行緩沖溶液均采用了極端pH,這可能導(dǎo)致被測蛋白組分的變性。因此賴心田[17]開發(fā)了一種在中性pH條件下的CE檢測方法,該條件中運行緩沖液為60mmol/L的磷酸鹽緩沖體系(pH 6.5),毛細(xì)管柱為未涂層型,分離電壓為15kV,檢測波長為214nm,該方法在15min內(nèi)即將α-乳白蛋白和β-乳球蛋白(A、B型)這三種蛋白有效分離。

除了上述兩種可用于乳清蛋白定性、定量分析的色譜和電泳技術(shù)外,聚丙烯酰胺凝膠電泳(polyacrylamide gel electrophoresis,PAGE)特別是Native-PAGE和SDS-PAGE技術(shù)在蛋白質(zhì)的定性(分子量)和定量(根據(jù)條帶亮度初步判斷)分析上應(yīng)用極為廣泛。另外,結(jié)合電泳和色譜兩種技術(shù)的毛細(xì)管電色譜(capillary electrochromatography,CEC)技術(shù)近年在多肽和蛋白質(zhì)的分離和分析上表現(xiàn)出更佳的效果[19]。CEC是以電滲流為驅(qū)動力,同時在毛細(xì)管內(nèi)填充或在內(nèi)壁涂覆、鍵合或交聯(lián)色譜固定相的一種微柱液相色譜技術(shù)。但CEC技術(shù)在乳清蛋白的檢測分析上報道還很少,Rehder[20]利用DNA寡核苷酸形成的G-quartet結(jié)構(gòu)用于毛細(xì)管固定相分離牛乳中的三種酪蛋白、β-乳球蛋白和α-乳白蛋白。結(jié)果表明,形成四面形的G-quartet結(jié)構(gòu)對于上述蛋白的分離效果最好。

3 色譜和電泳技術(shù)在乳清蛋白分離中的應(yīng)用

3.1 離子交換色譜技術(shù)

離子交換色譜(ion exchange chromatography,IEC)是以離子交換劑為固定相,以含有特定離子的溶液為流動相,利用流動相中的離子和離子交換劑上可交換的離子之間發(fā)生交換作用,根據(jù)不同離子間的交換能力不同,待分離的各種離子在離子交換劑中遷移的速度也不同,從而將混合液中不同離子進(jìn)行分離的技術(shù)。所以,凡是在溶液中能夠被電離的物質(zhì)通?？梢酝ㄟ^離子交換色譜法進(jìn)行分離。離子交換劑按照其結(jié)合的離子基團(tuán)的不同又分為陽離子交換劑和陰離子交換劑,每種離子又可分為強(qiáng)弱兩型,根據(jù)被分離物質(zhì)的性質(zhì)不同選擇。該技術(shù)不僅適用于無機(jī)離子的分離,也可用于有機(jī)物的分離,例如氨基酸、核酸、蛋白質(zhì)等生物大分子,應(yīng)用范圍較廣。

在報道的眾多研究中,用于乳清蛋白分離的離子交換樹脂的性質(zhì)并沒有統(tǒng)一的選擇,這其中陰離子交換樹脂[21-25]的應(yīng)用比較多,陽離子交換樹脂也有部分報道[21,26]。用于平衡離子交換色譜柱和洗脫目標(biāo)物質(zhì)的緩沖液通常選用pH不同的磷酸鈉緩沖液(PBS緩沖液)和三羥甲基氨基甲烷緩沖液(Tris緩沖液),洗脫液中除了上述的緩沖液組分以外,通常加入梯度濃度的NaCl來增加洗脫液的離子強(qiáng)度,從而達(dá)到對目標(biāo)產(chǎn)物的洗脫。Xiuyun Ye[21]利用強(qiáng)陰離子交換樹脂QAE對乳清中的α-乳白蛋白和β-乳球蛋白進(jìn)行分離。α-乳白蛋白通過0.05mol/L的Tris-HCl溶液(pH 8.5)中NaCl的濃度從0～0.15mol/L進(jìn)行線性梯度洗脫得到,β-乳球蛋白B組分和A組分通過0.05mol/L的Tris-HCl溶液(pH 6.8)中NaCl的濃度從0.1～0.25mol/L進(jìn)行線性梯度洗脫得到。同時他又利用強(qiáng)陽離子交換樹脂SP從乳清中分離得到了乳過氧化物酶和乳鐵蛋白。最終從1L的乳清蛋白中分離得到了1260mg的α-乳白蛋白、1290mg的β-乳球蛋白B組分和2280mg的β-乳球蛋白A組分。Maria[22]同樣通過強(qiáng)陰離子交換樹脂Mono Q 5/50 GL從濃縮乳清蛋白WPC80中分離出α-乳白蛋白和Ig的混合物、BSA、β-乳球蛋白A和B組分。在洗脫過程中,Maria同樣采用的是Tris-HCl溶液,不同之處在于其濃度和pH分別為20mmol/L和6.3,通過控制NaCl的濃度從0～0.5mol/L進(jìn)行梯度洗脫得到。

上述兩種方法均是采用陰離子交換樹脂作為分離介質(zhì),而Jose[26]通過弱陽離子交換樹脂也同樣從牛乳清中分離出了β-乳球蛋白。與上述預(yù)處理方法不同的是,Jose先利用50%的硫酸銨沉淀調(diào)酸處理過的乳清(磷酸調(diào)pH到3.0),上清去除,得到的沉淀再用pH 3.0的PBS溶液溶解。溶解液再用70%的硫酸銨溶液沉淀,沉淀去除,此時得到的上清溶液中β-乳球蛋白的純度已經(jīng)達(dá)到80%(SDS-PAGE分析)。最后一步經(jīng)過弱陽離子交換樹脂純化,洗脫的過程只選用了pH為4.9的磷酸鹽緩沖液,最終得到純度達(dá)95%以上的β-乳球蛋白(SDS-PAGE分析)。

3.2 凝膠色譜技術(shù)

凝膠色譜(gel chromatography,GC)的分離原理:被分離的混合物在通過具有多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的凝膠顆粒時,比凝膠孔徑大的分子不能進(jìn)入凝膠而從凝膠顆粒之間的空隙間流動,所以被最先洗脫出來,而比凝膠孔徑小的分子能不同程度地自由出入凝膠內(nèi)外空隙,因而遷移的路徑變長且速率變慢,最后被洗脫出來,因此,凝膠色譜又被稱為分子排阻色譜(size exclusion chromatography,SEC)。根據(jù)被分離的對象是水溶性化合物還是有機(jī)溶劑可溶物,凝膠色譜又可分為凝膠過濾色譜(gel filtration chromatography,GFC)和凝膠滲透色譜(gel permeation chromatography,GPC)。GFC一般用于分離可溶性的大分子,如多糖、蛋白類化合物,凝膠材料多是葡聚糖系列凝膠;GPC一般用于有機(jī)溶劑中可溶高聚物的分離,常用的凝膠材料多為交聯(lián)聚苯乙烯凝膠。因此凝膠色譜技術(shù)的應(yīng)用范圍廣,特別是在生物大分子領(lǐng)域,如蛋白質(zhì)、肽、核酸等領(lǐng)域。

與離子交換色譜、高效液相色譜相比,凝膠色譜的流動相通常采用組分簡單且pH中性的水溶液,對生物大分子如蛋白質(zhì)比較溫和。Yoshida[27]利用Sephacryl S-200柱從200mL乳清中先后分離到了408mg的β-乳球蛋白二聚體和98mg的α-乳白蛋白。Shalan[28]利用不同的凝膠填料(Sephacryl S-300和Fractogel TSK HW-55)從牛乳清中分離得到牛免疫球蛋白。但上述兩個研究都是針對乳清中個別目標(biāo)蛋白得到的分離方法且方法比較繁瑣。Mong Liang[29]開發(fā)了一種較為方便的分離方法,從自制的乳清中分離到了五種組分,按照流出先后順序分別為免疫球蛋白、牛血清白蛋白、β-乳球蛋白、α-乳白蛋白和糖巨肽。該方法所選用的凝膠色譜柱為Sephadex G-200,洗脫液是pH 7.2的Tris-HCl溶液。但由于β-乳球蛋白的量比較大,同時與α-乳白蛋白的分子量相近,導(dǎo)致α-乳白蛋白收集流出液中含有一定量的β-乳球蛋白,分離效果不好。Bayram[30]在利用Sephadex G-200凝膠色譜柱分離乳清蛋白時也發(fā)現(xiàn):直接分離乳清得到的第二部分流出液中同樣也是β-乳球蛋白和α-乳白蛋白的混合液。通過對第二部分流出液進(jìn)行胃蛋白酶處理后,利用SDS-PAGE檢測發(fā)現(xiàn)胃蛋白酶處理后只剩下β-乳球蛋白。另外,先對乳清進(jìn)行胰蛋白酶處理,然后再通過Sephadex G-200凝膠色譜柱分離得到的第二部分流出液中只含有α-乳白蛋白。由此可以得出結(jié)論:β-乳球蛋白能夠耐受胃蛋白酶的水解作用,而α-乳白蛋白能夠耐受胰蛋白酶的水解作用。

除了常用于乳清蛋白分離的離子交換色譜和凝膠色譜技術(shù)以外,置換色譜[31](displacement chromatography,DC)技術(shù)和疏水作用色譜[32](hydrophobic interaction chromatography,HIC)技術(shù)也有報道可以用于乳清蛋白組分的分離純化。Roberto[31]對比不同條件下環(huán)形置換色譜對β-乳球蛋白、α-乳白蛋白和大豆胰蛋白酶抑制劑(STI)的分離效果。實驗過程采用的色譜柱為環(huán)形Macro-Prep Q 25柱,緩沖載體溶劑為20mmol/L、pH7.2的Tris-HCl溶液,所用置換劑為乙二醛亞硫酸氫鈉(GBS)。結(jié)果表明:緩沖載體溶劑流速在0.1mL/min條件下分離效果比更高流速要好;GBS濃度對分離效果影響也較大,低濃度(100mmol/L)GBS也明顯優(yōu)于高濃度(140mmol/L或180mmol/L)條件。經(jīng)過上述條件的優(yōu)化,最終實現(xiàn)環(huán)形置換色譜對目標(biāo)蛋白的分離。Zhang[32]通過不同疏水配體和洗脫液中硫酸銨濃度兩個條件來優(yōu)化疏水作用色譜,對人重組α-乳白蛋白(rHLA)和牛α-乳白蛋白(BLA)進(jìn)行分離純化。結(jié)果證實:苯基型疏水配體對目標(biāo)物質(zhì)吸附能力最弱,丁基和辛基疏水配體吸附能力相當(dāng),這個結(jié)論和Noppe[33]的研究結(jié)果相矛盾,推測可能原因是Noppe通過EDTA除去α-乳白蛋白中的鈣離子。進(jìn)一步研究表明:丁基疏水配體在硫酸銨濃度為0.8mol/L時兩種α-乳白蛋白分離效果最好,rHLA回收率達(dá)85.2%,純度達(dá)97.2%。雖然DC技術(shù)在分離目標(biāo)物質(zhì)上有較多優(yōu)勢(如上樣量大,被分離組分之間界限清晰,所用溶劑量少等),但是置換劑和固定相的選擇較為嚴(yán)格,成本較一般色譜技術(shù)高。HIC技術(shù)由于需要使用高離子濃度的鹽溶液,對活性蛋白會有一定的影響且成本較高。因此這兩項色譜技術(shù)的應(yīng)用價值比IEC和GC技術(shù)要小。

從相關(guān)文獻(xiàn)報道來看,用于乳清蛋白分離的方法主要集中在色譜領(lǐng)域的技術(shù),電泳技術(shù)由于放大過程設(shè)備難以實現(xiàn),所以應(yīng)用多集中于分析檢測方面。但是,少量目標(biāo)乳清蛋白的分離同樣可以通過電泳技術(shù)實現(xiàn),如聚丙烯凝膠電泳目標(biāo)條帶的割膠回收,毛細(xì)管電泳特定時間段流出液的收集等。雖然在大規(guī)模應(yīng)用生產(chǎn)過程中色譜技術(shù)明顯占優(yōu)勢,但電泳技術(shù)在少量樣品制備上仍具有回收率高、純度高等優(yōu)勢。

4 展望

乳清蛋白是牛奶中一類具有多種生理活性的蛋白。雖然國外關(guān)于乳清蛋白的分離和檢測技術(shù)已經(jīng)發(fā)展了半個多世紀(jì),但我國乳清再利用技術(shù)特別是乳清中重要蛋白的分離技術(shù)仍不成熟,這也是導(dǎo)致國內(nèi)原制干酪至今沒有形成規(guī)?；a(chǎn)的主要受制因素?，F(xiàn)階段國內(nèi)的研究內(nèi)容多集中在乳清蛋白分析方法的建立,而關(guān)于乳清蛋白的分離技術(shù)的研究報道很少。我國未來乳制品消費模式中,奶酪產(chǎn)品是最具發(fā)展?jié)摿Φ姆较?特別是開發(fā)符合國人口味的中國特色奶酪,這必然會涉及到乳清再利用技術(shù)特別是工業(yè)化規(guī)模的分離技術(shù)。本文通過總結(jié)國外成熟的乳清蛋白分離和分析技術(shù),為國內(nèi)未來乳清處理提供借鑒。國外通常用于乳清蛋白分離的是色譜技術(shù),包括離子交換色譜和凝膠色譜技術(shù),雖然凝膠色譜技術(shù)操作過程快速簡單,但對于分子量相近的β-乳球蛋白和α-乳白蛋白的分離效果較差,而離子交換色譜對這兩種蛋白分離的效果比較好,所以通過這兩種技術(shù)的結(jié)合可以有效分離乳清蛋白各組分。此外,色譜技術(shù)還可以和先進(jìn)的膜分離技術(shù)相結(jié)合,以保證分離過程的簡單性和溫和性,是未來乳清蛋白甚至是各類生物大分子分離的重點方向。乳清蛋白的分析方法通常采用的是高效液相色譜和毛細(xì)管電泳技術(shù),隨著材料科學(xué)的不斷進(jìn)步,已經(jīng)發(fā)展出結(jié)合這兩者技術(shù)的新方法,即毛細(xì)管電色譜技術(shù)。雖然該技術(shù)在乳清蛋白檢測上還不成熟,但憑借其優(yōu)異的分離特性,未來在乳清蛋白的分析檢測中具有重要的應(yīng)用前景。

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