乙醇-硫酸銨雙水相體系提取檸檬渣中 檸檬苦素研究

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(1.內(nèi)江師范學(xué)院 化學(xué)化工學(xué)院，四川內(nèi)江 641112;2.四川省高等學(xué)校“果類廢棄物資源化”重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,四川內(nèi)江 641112)

檸檬是一種營(yíng)養(yǎng)豐富的柑橘屬植物,廣泛用于餐飲、烹調(diào)、美容、醫(yī)藥、輕紡、香精香料、食品加工、釀造、航空航天等行業(yè)[1-2]。中國(guó)是檸檬的主要產(chǎn)地之一,2011年全國(guó)檸檬產(chǎn)量達(dá)到30萬(wàn)噸以上[3]。巨大的檸檬產(chǎn)量促進(jìn)了檸檬生產(chǎn)加工產(chǎn)業(yè)的蓬勃發(fā)展,但也產(chǎn)生了大量的檸檬渣等廢棄物,不僅浪費(fèi)了資源,也對(duì)環(huán)境帶來(lái)了巨大的壓力。檸檬苦素是檸檬渣中的一種重要的有效成分,該化合物具有鎮(zhèn)痛抗炎、抗氧化、抗癌、抑制HIV和抑制真菌、防蟲殺蟲等活性[4-8]。將檸檬渣中提取的檸檬苦素應(yīng)用于食品、藥用等領(lǐng)域,既可實(shí)現(xiàn)其經(jīng)濟(jì)價(jià)值,又符合新時(shí)代環(huán)保的綠色化理念。

目前從天然產(chǎn)物中提取有效成分的方法主要有:水提取法[9-10]、有機(jī)溶劑提取法[10-12]、酶輔助提取法[13]、超聲波輔助萃取法[11,14-15]、微波輔助萃取法[11,16]、超臨界流體萃取法[17]等。水提取法操作簡(jiǎn)便,污染小,但提取效率較低;普通的有機(jī)溶劑提取法操作簡(jiǎn)便,但提取時(shí)間較長(zhǎng),有時(shí)還用到有毒試劑,污染環(huán)境和產(chǎn)品;酶輔助提取法條件溫和,提取效率較高,但影響因素較多,酶容易失活;超聲波輔助萃取法操作簡(jiǎn)便,條件溫和,時(shí)間短,成本低,得率較高,但超聲波對(duì)人體有較大危害,低劑量的超聲波是潛在的致癌和致畸形因素;微波輔助萃取法操作簡(jiǎn)便,耗時(shí)短,消耗溶劑少,萃取效率較高,但微波對(duì)人的危害較大;超臨界流體萃取法萃取效率高,能耗較少,溶劑消耗較少,但設(shè)備復(fù)雜,提取成本高。雙水相萃取法條件溫和,操作簡(jiǎn)便,提取效率較高,且?guī)缀醪皇褂糜卸救軇?還避免了超聲波、微波對(duì)人體帶來(lái)的傷害,是一種新型的綠色環(huán)保的液-液萃取技術(shù),很有發(fā)展前途[18]。本文以乙醇水溶液和硫酸銨按照一定比例組成的雙水相體系提取檸檬渣中的檸檬苦素,并通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)和正交實(shí)驗(yàn)考察了乙醇濃度、硫酸銨用量、料液比、提取溫度、提取時(shí)間對(duì)檸檬苦素得率的影響,確定用此雙水相體系提取檸檬渣中檸檬苦素的最佳工藝條件。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

檸檬苦素標(biāo)準(zhǔn)品 優(yōu)級(jí)純;乙醇、對(duì)二甲氨基苯甲醛、硫酸、三氯化鐵、硫酸銨 均為分析純;檸檬 四川安岳。

HK-04A型手提式高速粉碎機(jī) 廣州旭朗機(jī)械設(shè)備有限責(zé)任公司;DF-101S型集熱式恒溫加熱磁力攪拌器 鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司;SHB-B95型循環(huán)水式多用真空泵 鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司;T-6新世紀(jì)型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司;BT-323S電子分析天平 北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 顯色劑的配制 顯色劑A:按照資料所述[19],準(zhǔn)確稱取125mg 對(duì)二甲氨基苯甲醛于100mL硫酸乙醇(V硫酸∶V乙醇=65∶35)混合液中溶解,放置備用。顯色劑B:準(zhǔn)確稱取三氯化鐵9.0g,用蒸餾水溶解并定容至100mL,放置備用。使用時(shí)往100mL顯色劑A中加入0.05mL顯色劑B,混勻。

1.2.2 檸檬苦素的提取與測(cè)定 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制:準(zhǔn)確稱取10.00mg檸檬苦素標(biāo)準(zhǔn)品于50mL容量瓶中,加入無(wú)水乙醇,待溶解后,定容,得標(biāo)準(zhǔn)溶液,濃度為0.20mg/mL。

測(cè)定波長(zhǎng)的選擇:準(zhǔn)確量取1.00mL檸檬苦素標(biāo)準(zhǔn)溶液于10mL比色管中,加入5.00mL顯色劑混合溶液,搖勻,用無(wú)水乙醇定容,搖勻,顯色30min后,在300～600nm之間進(jìn)行掃描,發(fā)現(xiàn)在500nm處出現(xiàn)強(qiáng)吸收峰,因此選擇500nm作為測(cè)定波長(zhǎng)。

標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制:分別精確量取檸檬苦素標(biāo)準(zhǔn)溶液0.50、1.00、1.50、2.00、2.50mL于5支帶刻度試管中,用無(wú)水乙醇稀釋至10mL,分別加入5.00mL顯色劑,搖勻,顯色30min,在500nm處測(cè)定其吸光度。以吸光度為縱坐標(biāo),濃度為橫坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,求出直線回歸方程。

檸檬苦素的提取與測(cè)定:取檸檬渣粉末3.0000g于250mL圓底燒瓶中,按照設(shè)定的固液比加入一定濃度的乙醇溶液和一定量的硫酸銨,在一定溫度下,提取一定時(shí)間,抽濾,用分液漏斗將兩相分開(kāi),取上層清液,減壓濃縮,用無(wú)水乙醇溶解,轉(zhuǎn)移至25mL容量瓶中,定容。

準(zhǔn)確移取提取液0.50mL于25mL比色管中,用無(wú)水乙醇稀釋至15mL,加入5mL顯色劑混合溶液,顯色30min后,在500nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程,得到提取液濃度。檸檬苦素得率按照下式計(jì)算:

Et(%)=(C×V×n)/W×100

式中,Et為得率(%),C為測(cè)得的提取液濃度(g/mL),V為提取液體積(mL),n為稀釋倍數(shù),W為原料的質(zhì)量(g)。

1.2.3 乙醇濃度對(duì)提取效果的影響 在溫度為40℃,硫酸銨用量9g,乙醇用量30mL,提取時(shí)間1h的條件下,研究了乙醇體積濃度(20%、30%、40%、50%)對(duì)檸檬苦素提取效果的影響。

1.2.4 正交實(shí)驗(yàn) 檸檬苦素的得率除受到乙醇濃度的影響外,還受制于很多其他因素。參考文獻(xiàn)方法[18],在乙醇體積濃度30%恒定的情況下,以提取溫度、時(shí)間、料液比(m檸檬:V乙醇)、硫酸銨用量為考察因素,每個(gè)因素選取4個(gè)水平,使用L16(44)正交表來(lái)安排實(shí)驗(yàn),每組實(shí)驗(yàn)條件做了3次平行實(shí)驗(yàn)。

2 結(jié)果與討論

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線

檸檬苦素標(biāo)準(zhǔn)曲線如1所示:

從圖1可知,其檸檬苦素標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性回歸方程為A=7.20C-0.0025,R2=0.9962。

圖1 檸檬苦素標(biāo)準(zhǔn)曲線 Fig.1 The standard curve of limonin

2.2 乙醇濃度對(duì)提取效果的影響

可供選擇的雙水相體系較多,本實(shí)驗(yàn)選擇乙醇-硫酸銨雙水相體系,所用試劑無(wú)毒,條件溫和,其中乙醇濃度是提取效果的一個(gè)重要影響因素[18],如圖2所示。

圖2 乙醇體積濃度對(duì)檸檬苦素得率的影響 Fig.2 Effect of the ethanol concentration on the extraction of the limonin

從圖2可知,在硫酸銨用量一定的情況下,隨著乙醇濃度增加,檸檬苦素得率逐漸增加,當(dāng)乙醇體積濃度達(dá)到30%時(shí),達(dá)到最大,此后乙醇濃度繼續(xù)增大,檸檬苦素得率沒(méi)有明顯變化。其主要原因可能是,檸檬苦素在乙醇中的溶解度比水中大得多,隨著乙醇濃度增加,雙水相體系分相能力增加,乙醇在上層的濃度也逐漸增加,檸檬苦素的溶解度增加,當(dāng)乙醇體積濃度達(dá)到30%時(shí),檸檬苦素的浸出率趨于飽和,繼續(xù)增加乙醇濃度不會(huì)給檸檬苦素得率帶來(lái)明顯的變化。從節(jié)約資源的角度考慮,確定最佳的乙醇體積濃度為30%。

2.3 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析

正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)、實(shí)驗(yàn)結(jié)果及極差分析結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 L16(44)正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 1 L16(44)orthogonal experimental design and results

由表1極差R值可知,影響檸檬渣中檸檬苦素得率的因素主次次序?yàn)?B>A>C>D,即料液比>硫酸銨用量>提取溫度>提取時(shí)間。

從對(duì)正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果直觀分析的角度看,條件A1B3C3D3時(shí),檸檬苦素得率最高;但根據(jù)表1極差分析可知,檸檬渣中提取檸檬苦素的最佳工藝條件應(yīng)為A1B4C3D1,即硫酸銨用量9g,檸檬渣和乙醇的料液比1∶25,提取溫度60℃,提取時(shí)間1h。由于此最佳組合不在正交實(shí)驗(yàn)表中,為驗(yàn)證此條件,對(duì)此組合再做了3個(gè)驗(yàn)證性平行實(shí)驗(yàn),檸檬苦素的得率分別為0.276%,0.278%,0.283%,平均值0.279%,高于A1B3C3D3時(shí)的得率,即正交實(shí)驗(yàn)中的最大值,表明A1B4C3D1確實(shí)為檸檬渣中提取檸檬苦素的最優(yōu)工藝參數(shù)組合。

3 結(jié)論

本文通過(guò)設(shè)計(jì)單因素實(shí)驗(yàn)和正交實(shí)驗(yàn),得出了乙醇-硫酸銨雙水相體系中影響檸檬苦素得率指標(biāo)的因素大小順序?yàn)?料液比>硫酸銨用量>提取溫度>提取時(shí)間;提取檸檬渣中檸檬苦素的最佳工藝條件為:乙醇體積濃度30%,硫酸銨用量9g,檸檬渣和乙醇的料液比1∶25,提取溫度60℃,提取時(shí)間1h。進(jìn)而通過(guò)實(shí)驗(yàn)在最佳工藝條件下提取檸檬渣中檸檬苦素,不但得率較高,而且實(shí)驗(yàn)重現(xiàn)性好,說(shuō)明正交實(shí)驗(yàn)得出的結(jié)論是正確的。該研究結(jié)果對(duì)于天然產(chǎn)物中有效成分的提取研究具有一定的參考價(jià)值。

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