東北地區(qū)耐鹽芽胞桿菌篩選統(tǒng)計及初步鑒定

杜傳英 李海濤 劉榮梅 謝濱姣 張金波 高繼國

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，哈爾濱 150030）

東北地區(qū)耐鹽芽胞桿菌篩選統(tǒng)計及初步鑒定

杜傳英 李海濤 劉榮梅 謝濱姣 張金波 高繼國

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，哈爾濱 150030）

采用溫度篩選與表面定向培養(yǎng)相結(jié)合的方法對東北地區(qū)土壤中可培養(yǎng)耐鹽芽胞桿菌進行分離和篩選，得到137株芽胞桿菌，其中耐鹽芽胞桿菌74株，占總芽胞桿菌數(shù)量的54%，最適鹽濃度均為1%，耐鹽能力在4%-14%之間。通過擴增耐鹽菌株的16S rRNA基因序列，對其進行分子鑒定和分類，獲得東北地區(qū)土壤中可培養(yǎng)的耐鹽芽胞桿菌的多樣性信息。通過同源性比對和耐鹽性差異，確定36株差異耐鹽芽胞桿菌，分屬于芽胞桿菌屬中的7個種。其中多數(shù)菌株為蘇云金芽胞桿菌（Bacillus thuringiensis）（14株，占總數(shù)38.9%，最高耐鹽性在4%-9%NaCl之間）。其次依次為蠟樣芽胞桿菌（Bacillus cereus）（7株，19.4%，4%-8%NaCl），枯草芽胞桿菌（Bacillus subtilis）（7株，19.4%，8%-11%NaCl），炭疽芽胞桿菌（Bacillus anthracis）（4株，11.1%，5%-7%NaCl），彎曲芽胞桿菌（Bacillus flexus）（2株，5.6%，9%-14%NaCl），球形芽胞桿菌（Bacillus sphaericus）（1株，2.8%，5%NaCl）和阿氏芽胞桿菌（Bacillus aryabhattai）（1株，2.8%，6%NaCl）。彎曲芽胞桿菌和枯草芽胞桿菌的耐鹽能力較好。從中選取3株代表菌株，明確了其培養(yǎng)特性、形態(tài)特征及生理生化特性，并對其分別進行了系統(tǒng)發(fā)育分析。

耐鹽 芽胞桿菌 分離 初步鑒定 16S rRNA

鹽堿地多數(shù)情況下較為平坦便于灌溉，同時又是世界性的低產(chǎn)土壤，因此長期以來都受到人們廣泛的關(guān)注［1］。東北地區(qū)素以肥沃的黑土地著稱，是我國重要的農(nóng)、林業(yè)和畜牧業(yè)生產(chǎn)基地。但隨著氣候的變化和土壤的不合理利用，東北地區(qū)鹽堿土面積達到了384萬hm2，占該地區(qū)總面積的3.1%，其

中耕種鹽堿地面積占該地區(qū)總耕地面積的6.8%，已成為我國鹽堿土四大分布區(qū)之一［2］，嚴(yán)重制約著該地區(qū)的農(nóng)林畜牧業(yè)和經(jīng)濟發(fā)展。

目前我國對于鹽堿地的改良措施主要以物理、水利、生物和化學(xué)四大體系為核心［3］。 其中生物改良主要應(yīng)用高效耐鹽微生物與植物的協(xié)同作用［4］，在恢復(fù)鹽堿地的同時還可以保護生態(tài)平衡，在改善鹽漬土質(zhì)方面發(fā)揮著重要的作用。由于多數(shù)植物和微生物肥料不具有抵抗高鹽的能力，而細(xì)菌與植物在耐鹽方面又有較大的相似性，也有些植物可以與耐鹽菌共生［5］。因此，構(gòu)建高效耐鹽細(xì)菌資源庫以及發(fā)掘耐鹽功能基因應(yīng)運而生。

芽胞桿菌為革蘭氏陽性菌，菌體桿狀，直或近直，（0.3-2.2）μm×（1.2-7.0）μm，多數(shù)運動，鞭毛典型側(cè)生，形成抗熱內(nèi)生孢子［6］。2004年，El-Komy等［7］發(fā)現(xiàn)多粘芽胞桿菌（Bacillus polymexa）E.M1231菌株能增加鹽脅迫下玉米鮮重和干物質(zhì)產(chǎn)量。2006年，尹漢文［8］發(fā)現(xiàn)在一定濃度氯化鈉脅迫下，枯草芽胞桿菌可以在一定程度內(nèi)提高黃瓜植株的耐鹽性。對于模式菌株枯草芽胞桿菌耐鹽性的研究也一直備受關(guān)注［9-11］。芽胞桿菌由于產(chǎn)生內(nèi)生孢子，可以有效的抵抗外界環(huán)境的壓力，維持自身生長不受影響，是抗逆性最強的生命體。近年來在工、農(nóng)、醫(yī)等各個科學(xué)領(lǐng)域都有廣泛的應(yīng)用，研究總體呈加速上升的趨勢［12］，因此統(tǒng)計發(fā)掘耐鹽芽胞桿菌，旨在為構(gòu)建高效耐鹽轉(zhuǎn)基因植物提供重要數(shù)據(jù)支持以及基因資源儲備。20 mim后進行試驗。定向耐鹽篩選培養(yǎng)基：LB培養(yǎng)基中加入梯度濃度的NaCl。

1.2 方法

1.2.1 耐鹽芽胞桿菌的篩選與統(tǒng)計

1.2.1.1 土樣采集與芽胞桿菌的分離 廣泛采集東北各地區(qū)土壤樣品，先將表土層鏟去，取距表層5-10 cm的土壤作為樣本，裝入無菌封口袋中，標(biāo)明采集日期、地點、周圍植被等，每個采樣地點至少取10處（表1）。

表1 供試土壤樣品

1.2.1.2 土壤樣品中芽胞桿菌的分離及純化 取1-2 g土樣放入裝有15 mL滅菌水和適量玻璃珠的50 mL滅菌的大離心管中，在旋渦振蕩器上振蕩約1 min，將土壤顆粒打碎，然后80℃水浴20 min，充分將非芽胞菌殺死。待稍靜置后，稀釋500倍后吸取100 μL菌懸液于1/2 LB板上，涂布均勻，30℃培養(yǎng)3 d。挑取菌落涂片，用石炭酸復(fù)紅染色，100倍油鏡下觀察。檢出菌株劃線于LB培養(yǎng)基上培養(yǎng)，4℃保存。

1.2.1.3 菌株生長溫度測試 將分離得到的純培養(yǎng)芽胞桿菌接種于LB液體培養(yǎng)基中，分別置于16℃、22℃、30℃、37℃條件下，220 r/min震蕩培養(yǎng)48 h，取樣稀釋10倍，測量600 nm下OD值，繪制曲線。

1.2.1.4 菌株耐鹽性測試 將分離得到的純培養(yǎng)芽胞桿菌分別接種于含有0%-15%NaCl的LB培養(yǎng)基平板上，30℃恒溫培養(yǎng)48 h，觀察生長情況，統(tǒng)計不同菌株的最高耐鹽度。

1.2.1.5 基因組DNA提取 菌株在固體LB培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng)24 h后收集到1.5 mL EP管中，約100 mg，加入200 μL TE，200 μL 2% SDS，充分混勻，然后加入200 μL Tris飽和酚，200 μL氯仿，混勻后，

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要儀器與試劑 恒溫培養(yǎng)箱購自上海一恒科技有限公司；PCR儀購自百瑞德進出口貿(mào)易有限公司；凝膠成像分析儀購自賽智創(chuàng)業(yè)科技有限公司；PCR相關(guān)試劑購自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司。T4 DNA ligase、DNA Fragment Purification Kit和DNA Marker均購自TaKaRa公司。生理生化鑒定試劑盒購于海博生物有限公司。

1.1.2 培養(yǎng)基 LB液體培養(yǎng)基：trytone 1%，yeast extract 0.5%，NaCl 1%，pH調(diào)為7.0。LB固體培養(yǎng)基：LB液體培養(yǎng)基中加入1.3% 瓊脂，121℃滅菌

12 000 r/min離心10 min。取上清，加入1.5倍體積的異丙醇，50 μL的5 mol/L NaCl，輕輕振蕩混勻，12 000 r/min離心10 min，棄上清，沉淀用無水乙醇洗滌3次，室溫晾干。用適量的ddH2O溶解沉淀，短期-20℃保存，長期-70℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.1.6 基于16S rRNA基因序列的系統(tǒng)發(fā)育分析 對菌株基因組的16S rRNA序列進行PCR擴增，采用的通用引物［13］為16S rRNA-F：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'；16S rRNA-R1：5'-ACGGCTACCTTGTTACGACT-3'；16S rRNA-R2：5'- AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3'。反應(yīng)條件為：94℃ 8 min；94℃ 1 min，52℃ 1 min，72℃ 2 min，共30個循環(huán)；72℃ 10 min。擴增產(chǎn)物經(jīng)DNA純化試劑盒純化后連接pMD19-T載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109，藍白斑篩選陽性克隆，PCR驗證后，提質(zhì)粒送交測序。引物合成和序列測定均由金唯智生物科技有限公司完成。所得序列應(yīng)用NCBI Blast在線比對，找出各序列在NCBI數(shù)據(jù)庫中最親緣種的模式菌株序列，采用Clustal X和MEGA5.0軟件進行多序列比對，然后用Neighbor-Joining方法選擇 Bootstrap為1 000個重復(fù)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育學(xué)進化樹。新菌株16S rRNA序列提交GeneBank數(shù)據(jù)庫，獲取序列號。

1.2.2 優(yōu)勢菌株的初步鑒定

1.2.2.1 最高鹽濃度下菌株的生長情況 將優(yōu)勢菌株接種于LB液體培養(yǎng)基中，30℃，200 r/min培養(yǎng)12 h，離心收集菌體，用無菌水洗滌菌體后制成菌懸液，取1 mL菌懸液以1∶100的比例接種于該菌株最高耐鹽濃度的液體培養(yǎng)基中，30℃，200 r/min搖床培養(yǎng)，每隔1 h測其菌液600 nm下的OD值，并繪制生長曲線。

1.2.2.2 菌株形態(tài)特征觀察 菌株接種于LB固體培養(yǎng)基中，30℃培養(yǎng)2 d，挑取菌體，石炭酸復(fù)紅染色，在10×100倍的光學(xué)顯微鏡下觀察芽胞形成后，刮取培養(yǎng)菌用無菌水洗2-3遍，12 000 r/min離心1 min收集菌體，將沉淀懸浮于1 mL無菌水中，取適量胞晶混合液滴于玻璃片上，待干燥后，經(jīng)鋨酸固定，而后經(jīng)酒精梯度脫水，臨界點干燥，離子濺射噴金（2 nm），進一步的掃描電鏡觀察。電鏡（HITACHI S-3400N）分析在東北農(nóng)業(yè)大學(xué)大型儀器開放平臺電鏡室完成。

1.2.2.3 生理生化特性鑒定 參照生理生化鑒定試劑盒操作說明書。

2 結(jié)果

2.1 耐鹽芽胞桿菌篩選與統(tǒng)計

采用溫度篩選法從東北地區(qū)采集的500份土樣中篩選得到137株芽胞桿菌，本研究中東北地區(qū)芽胞桿菌出土率約為27.4%。進一步采用表面定向培養(yǎng)的方法，調(diào)整基本LB培養(yǎng)基中NaCl濃度，分別配成0%-20%NaCl的培養(yǎng)基，進行耐鹽芽胞桿菌篩選，得到可以在含有4%-14%NaCl的培養(yǎng)基中生長的耐鹽芽胞桿菌74株，占總芽胞桿菌數(shù)量的54%，說明半數(shù)以上的芽胞桿菌對于外界高鹽環(huán)境具有一定的耐受能力。所有芽胞桿菌在NaCl含量為1%時，菌落形態(tài)飽滿，生長旺盛，在高鹽環(huán)境下菌落形態(tài)明顯變小、生長緩慢或不能生長，在不含NaCl環(huán)境下生長速度明顯下降，菌落形態(tài)小，光學(xué)顯微鏡下觀察營養(yǎng)體少，有大量芽胞產(chǎn)生，故本試驗中分離出的所有芽胞桿菌最適生長的NaCl濃度均為1%，為耐鹽菌沒有嗜鹽菌。圖1為137株芽胞桿菌在基本LB培養(yǎng)基和高鹽培養(yǎng)基中可生長的菌株數(shù)量，本試驗中大部分芽胞桿菌的耐鹽性在8%以下，得到兩株耐鹽性10%以上的芽胞桿菌。

圖1 東北地區(qū)耐鹽芽胞桿菌的統(tǒng)計

2.2 基于16S rRNA基因序列的系統(tǒng)發(fā)育分析

提取74株耐鹽芽胞桿菌的基因組，用通用引物擴增16S rRNA基因序列，測序結(jié)果應(yīng)用DNAMAN軟件進行序列分析比對，結(jié)合菌株的耐鹽性差異，得到36株差異耐鹽芽胞桿菌用于后續(xù)分析菌株多樣性。將得到的16S rRNA基因序列與在線NCBI數(shù)據(jù)庫中的序列比對，選擇相似度最高的模式菌株應(yīng)用

上述方法構(gòu)建Neighbor Joining Tree（圖2）。由于蘇云金芽胞桿菌與蠟樣芽胞桿菌的16S rRNA序列的同源性非常高，鑒于蘇云金芽胞桿菌在芽胞期分泌伴孢晶體，結(jié)合光學(xué)顯微鏡下觀察的結(jié)果，區(qū)分蘇云金芽胞桿菌與蠟樣芽胞桿菌。結(jié)果顯示，該36株耐鹽芽胞桿菌分屬于芽胞桿菌屬中的7個種：蘇云金芽胞桿菌14株（占總數(shù)38.9%）、蠟樣芽胞桿菌7株（19.4%）、枯草芽胞桿菌7株（19.4%）、炭疽芽胞桿菌4株（11.1%）、彎曲芽胞桿菌2株（5.6%）、球形芽胞桿菌1株（2.8%），阿氏芽胞桿菌1株（2.8%）。該36株代表菌株與最近緣種的模式菌株的16S rRNA基因序列相似性在99.7%-100%之間，其中有22株菌株相似性在99.7%-99.9%之間，17株菌株的16S rRNA基因序列已提交GenBank獲得登錄號分別為：KJ022700、KJ496370- KJ496385。

2.3 各種芽胞桿菌耐鹽性統(tǒng)計

耐鹽性最好的菌株為LBR-4（Bacillus flexus）最高耐鹽度為14% NaCl和S5-1（Bacillus subtilis）最高耐鹽度為11%。但在高鹽脅迫下這兩株菌株的菌落形態(tài)都較正常培養(yǎng)基中小，再轉(zhuǎn)接到正常培養(yǎng)基中會恢復(fù)到正常生長狀態(tài)，說明高鹽脅迫對菌株的正常生長有一定的影響。總體菌株耐鹽性統(tǒng)計結(jié)果顯示，耐鹽性較好的菌株為彎曲芽胞桿菌（最高耐鹽度9%-14%NaCl）和枯草芽胞桿菌（8%-11%）。其它種芽胞桿菌耐鹽性差別不大，多數(shù)菌株的耐鹽性在7%以下（蘇云金芽胞桿菌，4%-9%；蠟樣芽胞桿菌，4%-8%；枯草芽胞桿菌，8%-11%；炭疽芽胞桿菌，5%-7%；球形芽胞桿菌，5%；阿氏芽胞桿菌，6%）。圖3顯示了各芽胞桿菌在不同鹽含量的培養(yǎng)基中可生長菌的數(shù)量。

2.4 代表菌株形態(tài)特征

選取3株代表菌株分別為耐鹽性超過10%的彎曲芽胞桿菌LBR-4、枯草芽胞桿菌S5-1以及最高耐鹽9%的蘇云金芽胞桿菌DL1-5進行初步鑒定分析。代表菌株的菌體形態(tài)如圖4，總體上菌體均為桿狀，石炭酸復(fù)紅染色后顯微鏡下觀察呈紅色，芽胞為橢球形，染色后呈空心粉色。蘇云金芽胞桿菌DL5-1菌株可以在芽胞期分泌出球形伴孢晶體，染色后呈均一的紅色。彎曲芽胞桿菌LBR-4的營養(yǎng)體相對較長，而枯草芽胞桿菌S5-1的芽胞相對較圓。

2.5 代表菌株的培養(yǎng)特性及生理生化指標(biāo)

將3株菌株分別擴增繁殖后，按一定比例分別接種于LB培養(yǎng)基和相應(yīng)最高耐鹽度的培養(yǎng)基中進行搖床培養(yǎng)，每隔1 h取樣測量600 nm處OD值，繪制如圖5的菌株生長曲線。菌株在LB培養(yǎng)基中2.5 h左右開始進入對數(shù)生長期，而在相應(yīng)最高鹽脅迫下有將近10-12 h的調(diào)整期。說明芽胞桿菌有很強的適應(yīng)能力，菌株最開始并不能適應(yīng)高鹽環(huán)境，但是經(jīng)過一段時間的調(diào)整后仍能生長。菌株在LB培養(yǎng)基中從對數(shù)期到穩(wěn)定期經(jīng)過近14 h，與高鹽脅迫下經(jīng)歷的時間基本相同，但在高鹽脅迫下進入穩(wěn)定期后的OD值有2-2.5倍的差異。

代表菌株LBR-4、S5-1及DL1-5最適生長鹽濃度均為1%，最高耐鹽度分別為14%、11%和9%，最適生長溫度為30℃（圖6）。V-P反應(yīng)均為陽性。菌株LBR-4可以利用葡萄糖、半乳糖和蔗糖作為唯一碳源生長，不能利用纖維二糖、甘露糖、七葉苷、水楊苷。可以利用L-精氨酸，不能利用尿素酶。菌株S5-1可以利用葡萄糖、蔗糖、纖維二糖、七葉苷和水楊苷作為唯一碳源生長，不能利用半乳糖和甘露糖。不能利用L-精氨酸，可以利用尿素酶。菌株DL1-5可以利用葡萄糖、蔗糖、纖維二糖和七葉苷作為唯一碳源生長，不能利用半乳糖、甘露糖、水楊苷。不能利用L-精氨酸和尿素酶（表2）。

2.6 代表菌株的系統(tǒng)發(fā)育分析

將同為彎曲芽胞桿菌的LBR-4和MS14-1菌株16S rRNA基因序列與已鑒定的模式菌株16S rRNA基因序列比較后，結(jié)果（圖7）顯示這兩株菌株均與模式菌株Bacillus flexus IFO 15715聚在一起，形成一個單獨的分支。通過序列兩兩比較，LBR-4菌株與模式菌株Bacillus flexus IFO 15715的相似性為99.87%，分別在第167和173個堿基處有2個堿基的差異。MS14-1菌株與模式菌株Bacillus flexus IFO 15715的相似性為99.93%，在第173個堿基處有1個堿基差異，LBR-4菌株與MS14-1菌株相似性為99.93%。

圖2 基于16S rRNA基因序列構(gòu)建的東北地區(qū)耐鹽芽胞桿菌系統(tǒng)發(fā)育樹

將同為枯草芽胞桿菌的7株菌株16S rRNA基因序列與已鑒定的模式菌株比較后，結(jié)果（圖8）顯

示這7株菌株均與模式菌株Bacillus subtilis的3個不同亞種聚在一起，形成一個單獨分支。其中S5-1菌株和S18-4與模式菌株Bacillus subtilis subsp. subtilis NCIB 3610的親緣關(guān)系最近，其他5株菌與模式菌株Bacillus subtilis subsp. inaquosorum KCTC 13429的親緣關(guān)系較近。通過序列兩兩比較，S5-1菌株與模式菌株Bacillus subtilis subsp. subtilis NCIB 3610的相似性為99.80%，分別在第222、456和1019個堿基處有3個堿基差異。S18-4菌株與模式菌株Bacillus subtilis subsp. subtilis NCIB 3610的相似性也為99.80%，分別在第276、476和1061個堿基處有3個堿基差異。S5-1菌株與S18-4菌株的相似性為99.60%，有6個堿基的差異。

圖3 各種芽胞桿菌耐鹽性統(tǒng)計

圖4 3株代表菌株的革蘭氏染色和掃描電鏡圖片

圖5 三株代表菌株在正常LB培養(yǎng)基和最高耐鹽度培養(yǎng)基中的生長曲線

圖6 三株代表菌株不同溫度下的生長曲線

通過16S rRNA基因序列的兩兩比對，將與

DL1-5菌株同源性較高的4株Bt菌株與Bt各亞種模式菌株的16S rRNA基因序列比較后，結(jié)果（圖9）顯示，這5株Bt菌株與kurstaki、chinensis、berliner和huazhongensis亞種的Bt模式菌株聚在一起，形成一個單獨的分支。序列兩兩比對結(jié)果顯示DL1-5菌株與模式菌株Bacillus thuringiensis serovar kurstaki CP004069的相似性為99.81%，分別在第554、630和720處有3個堿基的差異。菌株S3-3和菌株DL2-6與該模式菌株相似性為100%，與DL1-5相似性為99.81%。菌株MX2和菌株DL3-4與該模式菌株相似性為99.94%，在第53個堿基處有1個堿基的差異，與DL1-5菌株的相似性為99.74%。

表2 三株代表菌株生化指標(biāo)

圖7 鄰接法構(gòu)建菌株LBR-4基于16S rRNA基因序列的系統(tǒng)發(fā)育樹

3 討論

本研究在東北各地區(qū)采集分離的137株芽胞桿菌篩選出74株耐鹽性高于4%的芽胞桿菌，說明大部分芽胞桿菌具有較好的適應(yīng)高鹽環(huán)境的能力。另外在國內(nèi)，大量從不同地區(qū)分離得到的耐鹽、嗜鹽菌的報道中都有芽胞桿菌屬的細(xì)菌分布。例如，新疆達坂鹽湖［14］、云南省一平浪鹽礦古老巖鹽［15］和昆明鹽礦古老巖鹽［16］地區(qū)均以芽胞桿菌屬為最優(yōu)勢屬。因此研究統(tǒng)計芽胞桿菌耐鹽性，可以為今后發(fā)掘高效耐鹽的細(xì)菌提供有力的數(shù)據(jù)依據(jù)。

圖8 鄰接法構(gòu)建菌株S5-1基于16S rRNA基因序列的系統(tǒng)發(fā)育樹

圖9 鄰接法構(gòu)建菌株DL1-5基于16S rRNA基因序列的系統(tǒng)發(fā)育樹

本研究基于16S rRNA基因序列構(gòu)建了分離得到的36株不同耐鹽芽胞桿菌和3株代表菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹。但是在分析過程中，蘇云金芽胞桿菌和蠟樣芽胞桿菌的16S rRNA基因序列具有高度的保守性，并不能單憑16S rRNA基因序列來區(qū)分這兩個種的菌株，本研究應(yīng)用了蘇云金芽胞桿菌可以在芽胞期分泌伴孢晶體來區(qū)分，下一步工作可以采用de la Haba等［17］提出的多為點序列分析方法（MLSA）繼續(xù)進

行深入的分類研究。

通過對3株代表菌株在正常情況下和最高耐受鹽濃度下生長曲線的測定中，看出這3株芽胞桿菌在剛進入高鹽環(huán)境中需要一段很長的適應(yīng)時間，3株菌株調(diào)整期時間基本一致，在進入對數(shù)期到達穩(wěn)定期的時間和正常環(huán)境下的菌株也基本相同。但是高鹽脅迫下的對數(shù)生長期的生長曲線斜率明顯小于正常情況下的曲線斜率，同時在達到穩(wěn)定期后3株菌株的OD600nm值均比正常情況下的OD600nm值要小很多。推測有可能高鹽脅迫影響了菌株正常繁殖分裂的速率。但是本研究并未涉及耐鹽機理，為了尋找耐鹽芽胞桿菌適應(yīng)高鹽環(huán)境的原因，我們正在繼續(xù)研究在高鹽脅迫下的耐鹽芽胞桿菌的蛋白表達差異，以確定其是否通過蛋白調(diào)節(jié)來改變自身適應(yīng)性。

通過比較3株代表菌株的16S rRNA基因序列發(fā)現(xiàn)耐鹽性較好的這3株菌株在16S rRNA基因序列上均有不同程度的堿基替換，可能這3株菌在進化過程中有了一些改變，使之能夠更好地適應(yīng)逆境。同時Bt菌株MX2與DL3-4和DL2-6與S3-3在16S rRNA基因序列上完全一致，但是卻表現(xiàn)出不同的耐鹽性，甚至相差近1倍，說明同一亞種的芽胞桿菌之間也有著不同的適應(yīng)逆境能力。

4 結(jié)論

本研究對東北各地區(qū)土壤樣品中的芽胞桿菌進行了耐鹽性的統(tǒng)計與分析，得到該地區(qū)芽胞桿菌總體耐鹽性的數(shù)據(jù)。初步測定了分屬于芽胞桿菌屬不同種的3株耐鹽性較好的代表菌株的形態(tài)學(xué)特征、生理生化特征、鹽脅迫下生長情況及16S rRNA基因序列系統(tǒng)發(fā)育進化關(guān)系。

［1］王春裕. 中國東北鹽漬土［M］. 北京：科學(xué)出版社, 2004, 333-337.

［2］姚榮江, 楊勁松, 劉廣明. 東北地區(qū)鹽堿土特征及其農(nóng)業(yè)生物治理［J］. 土壤, 2006, 38（3）：256-262.

［3］朱偉, 劉曉靜. 中國鹽堿地改良專利技術(shù)發(fā)展概述［N］. 中國知識產(chǎn)權(quán)報, 2013-01-16007.

［4］阿吉艾克拜爾, 邵孝侯, 常婷婷, 等. 我國鹽堿地改良技術(shù)和方法綜述［J］. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué), 2013, 16：7269-7271.

［5］馬蕓, 謝占玲, 李德英, 馬志杰. 青藏高原藥用植物內(nèi)生細(xì)菌多樣性研究［J］. 生物技術(shù)通報, 2010（6）：234-239.

［6］Buchanan RE, Gibbens NE. 伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊［M］. 北京：科學(xué)出版社, 1984.

［7］El-Komy HMA, Abdel-Samad HM, Hetta AMA, Barakat NA. Possible roles of nitrogen fixation and mineral uptake induced by rhizobacterial inoculation on salt tolerance of maize［J］. Polish Journal of Microbiology, 2004, 53（1）：53-60.

［8］尹漢文, 郭世榮, 劉偉, 陳海麗. 枯草芽孢桿菌對黃瓜耐鹽性的影響［J］. 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報, 2006, 29（3）：18-22.

［9］Horsburgh MJ, Moir A. σM, an ECF RNA polymerase sigma factor of Bacillus subtilis 168, is essential for growth and survival in high concentrations of salt［J］. Mol Microbiol, 1999, 32（1）：41-50.

［10］Hahne H, M?der U, Otto A, et al. A comprehensive proteomics and transcriptomics analysis of Bacillus subtilis salt stress adaptation［J］. Journal of Bacteriology, 2010, 192（3）：870-882.

［11］H?per D, Bernhardt J, Hecker M. Salt stress adaptation of Bacillus subtilis：a physiological proteomics approach［J］. Proteomics, 2006, 6（5）：1550-1562.

［12］劉國紅, 林乃銓, 林營志, 劉波. 芽孢桿菌分類與應(yīng)用研究進展［J］. 福建農(nóng)業(yè)學(xué)報, 2008, 23（1）：92-99.

［13］李玉紅. 蘇云金芽胞桿菌的抑菌活性及新型cry基因研究［D］. 哈爾濱：東北農(nóng)業(yè)大學(xué), 2012：41-42.

［14］吳海平, 王真輝, 等. 新疆達坂鹽湖沉積土壤嗜鹽細(xì)菌的定向富集與多樣性分析［J］. 微生物學(xué)通報, 2010, 37（7）：956-961.

［15］陳義光, 李匯明, 李沁元, 等. 一平浪鹽礦古老巖鹽沉積中可培養(yǎng)細(xì)菌的系統(tǒng)發(fā)育多樣性研究［J］. 微生物學(xué)報, 2007, 47（4）：571-577.

［16］肖煒, 楊亞玲, 劉宏偉, 等. 昆明鹽礦古老巖鹽沉積中可培養(yǎng)細(xì)菌多樣性研究［J］. 微生物學(xué)報, 2006, 46（6）：967-972.

［17］De la Haba R R, Sánchez-Porro C, Márquez M C, et al. Taxonomy of halophiles［M］. Extremophiles Handbook, 2011.

（責(zé)任編輯 李楠）

Isolation and Primary Identification of Salt-tolerant Bacillus in Northeast of China

Du Chuanying Li Haitao Liu Rongmei Xie Binjiao Zhang Jinbo Gao Jiguo
>（College of Life Science，Northeast Agricultural University，HarBin 150030）

To analyze the biodiversity of salt-tolerant Bacillus in the northeast of China, the temperature screening and gradient plate methods were used. 137 Bacillus strains were obtained, in which has 74 salt-tolerant Bacillus strains, 54% of total Bacillus strains. The optimum salt concentrations of these salt-tolerant Bacillus strains were all 1% and the range were 4%-14%. 16S rRNA sequences were amplified and analyzed for the determination of phylogenetic relationships. The 36 salt-tolerant Bacillus strains were different from each other in their 16S rRNA sequences or the salt tolerance, classified into 7 species of Bacillus genera. Among them, Bacillus thuringiensis was majority（14 strains, 38.9% of all, highest salt tolerance were 4%-9%NaCl）, second were Bacillus cereus（7, 19.4%, 4%-8%）and Bacillus subtilis（7, 19.4%, 8%-11%）, then Bacillus anthracis（4, 11.1%, 5%-7%）, Bacillus flexus（2, 5.6%, 9%-14%）, Bacillus sphaericus（1, 2.8%, 5%）and Bacillus aryabhattai（1, 2.8%, 6%）. Bacillus flexus and Bacillus subtilis were shown better salt tolerance. Cultural and morphology characteristics, biochemical indexes and phylogenetic analysis of 3 typical strains were given. Provide an effective data support for the discovery of salt-tolerant Bacillus.

Salt-tolerant Bacillus Isolation Primary identification 16S rRNA

2014-02-23

國家高技術(shù)研究發(fā)展計劃資助項目（2011aa10a203），轉(zhuǎn)基因生物新品種培育（國家科技重大專項）（2014ZX0800913B-002），國家基礎(chǔ)科學(xué)人才培養(yǎng)基金資助項目（J1210069），東北農(nóng)業(yè)大學(xué)博士啟動基金項目（2010RCB54）

杜傳英，女，碩士，研究方向：生物化學(xué)與分子生物學(xué)；E-mail：duchuanying@126.com

高繼國，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向：生物化學(xué)與分子生物學(xué)；E-mail：gaojiguo1961@hotmail.com