環(huán)境DNA研究技術(shù)及其在生態(tài)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用

徐浩 羅茜 李云 薛洋 葉勤

（西南大學(xué)動物科技學(xué)院 淡水魚類資源與生殖發(fā)育教育部重點實驗室，重慶 400716）

環(huán)境DNA研究技術(shù)及其在生態(tài)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用

徐浩 羅茜 李云 薛洋 葉勤

（西南大學(xué)動物科技學(xué)院 淡水魚類資源與生殖發(fā)育教育部重點實驗室，重慶 400716）

環(huán)境DNA（environmental DNA，eDNA）是指從環(huán)境樣本中提取的所有DNA的集合，包括環(huán)境微生物以及從生物體上脫落下來的活細胞DNA和因生物死亡后細胞破碎而游離出的胞外DNA。按照宏基因組學(xué)概念，eDNA研究技術(shù)主要是指直接從環(huán)境樣本中提取基因組DNA后進行測序分析的方法。較傳統(tǒng)的研究方法，eDNA應(yīng)用最大的優(yōu)勢在于更有效地解決了特定環(huán)境樣本中宏量生物的分類問題，利于更進一步研究生態(tài)學(xué)問題，該技術(shù)耗時短、成本低，準(zhǔn)確度高。第二代高通量測序技術(shù)的開發(fā)成功，進一步拓展了eDNA的應(yīng)用范圍，并開始從微生物學(xué)向動、植物學(xué)領(lǐng)域拓展，促進了傳統(tǒng)生態(tài)學(xué)領(lǐng)域在研究方法和思想上的一場革新。對eDNA的研究技術(shù)在生物多樣性分析、動物食性分析、生物量估測等生態(tài)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用進行了綜述，最后對eDNA研究技術(shù)的發(fā)展趨勢和前景作出展望。

環(huán)境DNA 宏基因組學(xué) 生態(tài)學(xué) 物種分類

環(huán)境DNA（environmental DNA，eDNA）是指從環(huán)境中（如土壤、水、空氣等）提取的所有DNA集合，包括環(huán)境微生物以及從生物體上脫落下來的活細胞DNA和因生物死亡后細胞破碎而游離出的胞外DNA［1，2］。在自然界中eDNA量的變化是一個動態(tài)過程，不斷產(chǎn)生的同時也不斷的降解，但也有如化石一樣能長久存在的古eDNA［3］。

涉及環(huán)境DNA的研究最早始于1987年，即由微生物學(xué)家從湖底沉積物中成功提取出環(huán)境微生物DNA［4］。而首先出現(xiàn)“eDNA”這個詞應(yīng)該是在

2000 年的一篇文獻中［5］，該文獻提出傳統(tǒng)的培養(yǎng)方式培養(yǎng)出的細菌并不能反映所取環(huán)境中細菌群落的多樣性，因為大多數(shù)的細菌在實驗室條件下不可培養(yǎng)。研究者通過從土壤中直接提取細菌DNA基因組并利用細菌人工染色體構(gòu)建環(huán)境基因組文庫，經(jīng)16S rRNA序列比對鑒定出了大量的微生物種類，證明了eDNA可用于研究微生物多樣性以及物種鑒定。隨之而來的是在生態(tài)學(xué)研究中關(guān)于eDNA應(yīng)用的文獻大量出現(xiàn)［6-8］，逐漸從微生物學(xué)拓展到了動植物學(xué)的研究領(lǐng)域中。

可以說eDNA應(yīng)用是伴隨著宏基因組學(xué)的發(fā)展而發(fā)展起來的。1998年，微生物學(xué)家Handelsman［9］首先提出了宏基因組學(xué)（Metagenomics）的概念，意指土壤微生物的全部基因組的集合。近年來，隨著DNA測序技術(shù)的不斷進步以及測序成本的下降極大地推動了宏基因組學(xué)的發(fā)展。現(xiàn)今，宏基因組學(xué)可以廣義的定義為對環(huán)境中直接獲得的總DNA進行分析的所有研究［10］。與傳統(tǒng)的個體生物研究相比，宏基因組學(xué)是將環(huán)境樣本所有生物以整體為研究對象，是直接從環(huán)境樣本中提取基因組DNA后進行測序分析的方法［11］。而eDNA應(yīng)用正是以環(huán)境生物DNA為研究對象，從整體到局部的過程，相信能在生態(tài)學(xué)各領(lǐng)域中得到很好的應(yīng)用。

1 用于eDNA的主要研究技術(shù)

1.1 NGS技術(shù)

第二代測序（Next-generation sequencing，NGS）即是目前最新的高通量測序技術(shù)。其技術(shù)的核心思想是邊合成邊測序，通過捕捉新合成的末端的標(biāo)記來確定DNA的序列?，F(xiàn)有的技術(shù)平臺主要包括454 Pyrosequencer GS FLX Titanium（Roche）、Solexa GA（Illumina）、HeliScope（Helicos BioSciences）、SOLiD 4（Life/Applied Biosystems）［12］和 SMRT（Pacific Biosciences）［13］。各技術(shù)平臺應(yīng)用范圍非常廣泛，且各有所長，其中Roche 454 GS FLX測序技術(shù)最適合用于生態(tài)學(xué)中宏基因組學(xué)的研究。其測序PCR反應(yīng)發(fā)生在固相的微珠上，整個PCR反應(yīng)相關(guān)的酶和試劑都被油包水的液滴包裹，每個油滴系統(tǒng)只包含一個DNA模版進行獨立的PCR擴增。擴增后，每個DNA分子可以得到富集，每個微珠代表著一個克隆集落。測序過程中，GS FLX系統(tǒng)會將引物上dNTP的聚合與熒光信號釋放偶聯(lián)起來，通過檢測熒光信號達到DNA測序的目的。例如，林平等［14］通過Roche 454 GS FLX測序技術(shù)對病原菌16S rDNA的分析檢測病人痰中細菌。從101例樣本中發(fā)現(xiàn)了129個菌屬，其中大量的是臨床不易培養(yǎng)的菌屬，如支原體屬、嗜血桿菌屬、莫拉菌屬等，而臨床培養(yǎng)出的細菌只有12種。由此可見，Roche 454 GS FLX技術(shù)能將信息量巨大的DNA集轉(zhuǎn)化為具體的種屬。與傳統(tǒng)的Sanger測序相比較，NGS在很多技術(shù)上都有了突破，包括文庫的構(gòu)建、錨定橋接、預(yù)擴展等等，使得上百萬的測序反應(yīng)同時發(fā)生在一個反應(yīng)里［15］，既降低了測序成本，也縮短了測序時間。盡管讀取準(zhǔn)確度以及讀取片段的長度都不及Sanger測序，但這些不足可以通過測序的覆蓋率和生物信息學(xué)的方法來克服，在很短的時間內(nèi)完成對上百億堿基的測序，可實現(xiàn)極短時間內(nèi)對eDNA序列進行細致的研究。

1.2 DNA宏條形碼技術(shù)

DNA條形碼的主要作用是用于物種水平的鑒別，通過所得的DNA序列與標(biāo)準(zhǔn)條形碼（Standard barcoding）比對，就可以知道目標(biāo)生物的種類。自2002年，Tautz等［16］提出要用DNA序列作為生物分類系統(tǒng)的主要平臺，即DNA分類學(xué)后，加拿大Guelph大學(xué)的動物學(xué)家Hebert等［17］在2003年明確提出了DNA條形碼（DNA Barcoding）的概念。如今已有專門的DNA條形碼數(shù)據(jù)庫（International barcode of life），10年來超過10萬個物種的DNA條形碼數(shù)據(jù)的信息存儲其中。但發(fā)展至今，傳統(tǒng)的DNA條形碼已經(jīng)不能滿足人們在eDNA應(yīng)用中的需求。首先，與提取的組織DNA不同，eDNA通常受到不同程度的降解，甚至?xí)到獾鬌NA條形碼部分的片段。其次，eDNA來源復(fù)雜，包含著所屬環(huán)境的所有物種的DNA，如CYTB、16S rRNA、COI、rbcL和ITS rDNA等傳統(tǒng)的條形碼鑒定出的群落物種只能算是冰山一角。所以，Pompanon等［18］在2011年提出了一種新型DNA條形碼，即DNA宏條形碼（DNA metabarcoding），但是該概念目前還沒有一個非常具體和權(quán)威的定義。其作用并不是用于鑒別單

一、少許的樣本，而是用于多重分類單元的分類鑒定。通過合理的通用引物設(shè)計和宏DNA條形碼選擇可以做到對環(huán)境群落物種進行準(zhǔn)確的分類鑒定。然而，就目前的宏條形碼技術(shù)發(fā)展的水平而言，全面的鑒定環(huán)境生物還存在著非常大的挑戰(zhàn)。例如，如何合理的選擇DNA宏條形碼以及通用引物的設(shè)計。對此，Pompanon等［19］在利用NGS技術(shù)檢測動物食性的研究中對該難題做了詳細的探討，為更深入開發(fā)宏條形碼技術(shù)提供了寶貴意見。

2 eDNA在生態(tài)學(xué)中的應(yīng)用

eDNA應(yīng)用的最核心的手段是能夠?qū)?fù)雜的宏量生物環(huán)境樣本DNA進行準(zhǔn)確分類，可以說eDNA應(yīng)用于分類是對傳統(tǒng)分類學(xué)方法的一次革新，并且隨著NGS技術(shù)的出現(xiàn)極大地降低了測序成本，使得一些研究者敢于做一些以前受技術(shù)限制和經(jīng)費限制的實驗，大大拓展了研究領(lǐng)域。下面將近年來eDNA技術(shù)在生態(tài)學(xué)中的最新應(yīng)用作了回顧。

2.1 物種多樣性研究

隨著全球氣候變化和人類活動的影響，生物多樣性保護的重要性愈加突出，生物多樣性已開始成為國內(nèi)外研究的熱點，而物種多樣性作為生物多樣性最基礎(chǔ)的研究內(nèi)容，準(zhǔn)確鑒別物種就顯得尤為重要。傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)分類方法對研究人員的專業(yè)知識和實踐經(jīng)驗要求高，鑒定物種費時費力，準(zhǔn)確性也不高。借助分子生物學(xué)方法來鑒定物種［20-25］，解決了形態(tài)學(xué)鑒定方法的諸多弊端，而NGS技術(shù)和eDNA應(yīng)用的出現(xiàn)可以說是在前面方法的基礎(chǔ)上更進一步。目前已經(jīng)有少量關(guān)于eDNA應(yīng)用于物種多樣性研究的文獻報道。例如，Blaalid等［26］對拳參屬植物（Bistorta vivipara）演替過程中與其處于共生關(guān)系的外生菌根真菌多樣性以及分布情況進行了研究。從60個根系中提取真菌eDNA，通用引物PCR擴增后采用Roche 454 GS FLX測序，進行數(shù)據(jù)分析后得到470個操作分類單位（OTUs），每個根系的OTUs在8-41個之間，并發(fā)現(xiàn)了真菌的多樣性沿著頂極植被逐漸增多，其中根擔(dān)子菌是優(yōu)勢菌株；Philip等［27］通過對丹麥港口海域的魚類物種多樣性進行評估發(fā)現(xiàn)，該海域中有15種魚類。既包括重要的經(jīng)濟魚類，如大西洋鱈、歐洲鰻鱺、歐鰈和大西洋鯡魚，也有非經(jīng)濟魚類，如短角大杜父魚、尖海龍及巖梳隆頭魚，同時還發(fā)現(xiàn)歐洲沙丁魚——洄游魚類。除此之外，他們還發(fā)現(xiàn)了多種鳥類，包括紅喉潛鳥、原鴿、疣鼻天鵝和鸕鶿。另外，與常規(guī)的9種魚類多樣性調(diào)查方式相比發(fā)現(xiàn)，利用eDNA除了能檢測出傳統(tǒng)方法調(diào)查到的魚類，還能檢測到用傳統(tǒng)方法不能調(diào)查到的魚類。以上說明eDNA技術(shù)能成功應(yīng)用于物種多樣性研究，有助于更加全面的了解物種資源情況。

2.2 水生動物生物量的估測

一直以來，人們對植被生物量評估方法研究比較多［28-30］，而在動物生物量評估方面的研究相對較少。其中一個重要的原因是動物好動、易躲藏且難以捕捉，為調(diào)查帶來了諸多的困難。目前，科學(xué)家們?nèi)詻]有找到一種合適的方法能對動物進行量的評估。但是最近出現(xiàn)的應(yīng)用eDNA對魚類生物量進行評估的文獻報道，其方法可能對動物生物量評估的研究起到促進作用。為Teruhiko等［31］對日本的“Iba-naiko”湖中的鯉魚進行生物量的評估。他們提出了一個假設(shè)——某物種的生物量與其釋放在環(huán)境中的DNA成正比，那么通過檢測該物種的eDNA濃度就可以反映出其在環(huán)境中的生物量。首先，在實驗室和池塘里模擬野外環(huán)境，探索eDNA和鯉魚數(shù)量的線性關(guān)系，證明了eDNA濃度與魚的數(shù)量呈正相關(guān)，并建立線性方程。然后，取樣于“Iba-nailo”湖中的湖水，估測鯉魚在湖中的數(shù)量以及分布，結(jié)果發(fā)現(xiàn)溫度越高的地方鯉魚的數(shù)量越多。與傳統(tǒng)捕撈方式相比，前者采樣不受復(fù)雜的地質(zhì)和灌木條件影響，且對環(huán)境不會造成任何破壞。通過這種方法我們可以更快的估計出物種生物量。盡管以上結(jié)論的準(zhǔn)確度以及在未來的適用性還有待進一步驗證，但其研究方法能為未來在改進生物量評估手段上提供很好的思路，相信在瀕危物種的保護，以及水產(chǎn)養(yǎng)殖的科學(xué)管理等領(lǐng)域中應(yīng)用前景廣闊。

2.3 動物食性分析

食性分析最早是通過消化殘留物觀察法和腸道解剖法。對于通常所熟知的動物可以通過此方法在一定程度上得以了解，但對于無脊椎動物、夜行性以及生活在土壤和水下的生物通過視覺觀察是很難做到的［32］。另外，顯微觀察具有一定的局限性，它

依賴于觀察者對咀嚼后半消化食物碎片的準(zhǔn)確判斷［33-36］。為了能更準(zhǔn)確的研究動物的食性，生態(tài)學(xué)家從分子生物學(xué)方法上著手，具體的技術(shù)包括蛋白免疫印跡［37］、近紅外線光譜（Near infrared spectroscopy，NIRS）［38］、穩(wěn)定同位素分析［39］、溫度/變性梯度凝膠電泳（Temperature gradient gel electrophoresis，TGGE/Denatured gradient gel electrophoresis，DGGE）［40］。但是每種技術(shù)都有各自的優(yōu)缺點，并且適用性不一［32］，如蛋白免疫印跡技術(shù)適合于研究狹食性的捕食者［41］，對于寬食譜的動物就無能為力了；NIRS技術(shù)方便檢測植食性動物消化的總氮［42］，但很難分析出食物中具體的植物種類；穩(wěn)定同位素分析技術(shù)主要用于研究動物在一段較長時期內(nèi)的攝食情況，而不僅僅是短期的一個攝食情況［43］；TGGE/DGGE技術(shù)主要用于研究動物的腸道、糞便等微生物群落［44，45］，在研究動物食性方面常常受到DNA條帶分離技術(shù)的限制。近年來eDNA也開始被應(yīng)用于動物食性的研究，其最大的優(yōu)勢在于能分析出動物短期的食物。如Shehzad等［46］研究了一種生活在野外的、人們對其食性了解甚少的豹貓的食性，他們從38只豹貓糞便中提取了eDNA，序列分析后發(fā)現(xiàn)其食物包括魚類、兩棲動物、鳥類、哺乳動物共18種生物。另外，應(yīng)用eDNA技術(shù)研究食性的報道還包括海狗、企鵝、蝙蝠、熊、田鼠和蠕蟲等［47-52］?？梢姡琫DNA應(yīng)用于動物食性研究潛力巨大，再結(jié)合之前的分子生物學(xué)方法取長補短，相信能在全面了解動物的食性方面取得更大進展。

2.4 重建古植物史

目前研究古植物學(xué)主要還是通過植物大化石和孢子花粉地質(zhì)記錄的方法。大化石包括根、莖、葉、孢子囊穗或球果等，因其肉眼可見，保存形式多樣、信息較全，研究歷史悠久，但無論是動物界還是植物界，能保存成化石者只是其極細小的一部分，導(dǎo)致地質(zhì)記錄嚴(yán)重不全［53］。與此相反，孢子花粉產(chǎn)量非常高［54］，并且其外壁大多由孢粉素組成，非常堅固，強酸強堿和一定程度的高溫高壓對其影響不大，保存能力極強［55］，但許多孢子花粉植物親緣關(guān)系目前仍分不清楚［53］，很難對古植物群系進行準(zhǔn)確描述，故以上兩種研究方法都存在各自的局限。近年來，有大量通過分析沉積古DNA（sedaDNA）來研究古環(huán)境的文獻報道［56-63］，其方法是提取保存至今的古eDNA，通過NGS測序得到eDNA基因組，分析其序列然后將古植物進行分類。例如，Mikkel等［63］通過對南格陵蘭島湖底層沉積物中古DNA的序列分析重建了格陵蘭島的古植物群系，并將eDNA方法和傳統(tǒng)的兩種方法所得出的結(jié)果相對比。從采集的38個樣本中，通過Roche 454 GS-FLX測序法得到了252 902個DNA序列，數(shù)據(jù)分析出古湖中古植物包括13個科。而傳統(tǒng)的孢子花粉和大化石地質(zhì)記錄分別是36個科和17個科，檢測到的數(shù)量都比eDNA法多，但是后者有2個科卻在前兩種方法中沒有記錄。因此，eDNA應(yīng)用對前兩種方法的研究起到查漏補缺的作用。不僅如此，eDNA法與前兩者的檢測結(jié)果也有部分重疊，對傳統(tǒng)的檢測結(jié)果起到了驗證的效果?？梢?，將3種方法相結(jié)合能更準(zhǔn)確地描述古植物史。

3 展望

至今，環(huán)境生態(tài)學(xué)研究仍然面臨方法有限、采樣空間局限、數(shù)據(jù)處理慢及監(jiān)測結(jié)果不準(zhǔn)等問題［64］。但是近年分子生物學(xué)技術(shù)的應(yīng)用開啟了生態(tài)學(xué)領(lǐng)域的一場革命，有了NGS等技術(shù)的支撐，將極大地提升人類從生態(tài)系統(tǒng)中獲取數(shù)據(jù)的能力，其監(jiān)測模式的核心思想就是利用eDNA結(jié)合NGS技術(shù)平臺快速準(zhǔn)確的對環(huán)境生物進行分類鑒定以及生物多樣性和物種分布的調(diào)查。但是，目前eDNA技術(shù)的應(yīng)用在滿足人們對環(huán)境信息采集的同時也面臨著很大的挑戰(zhàn)。首先，盡管人們有能力得到環(huán)境基因組序列，但是在信息處理方面的能力還顯不足。雖然各種統(tǒng)計建模在環(huán)境應(yīng)用中并不陌生，但是環(huán)境基因組因其序列來源極度復(fù)雜、采集數(shù)據(jù)的穩(wěn)定性影響因子多，使得統(tǒng)計建模變得更加困難。其次是eDNA數(shù)據(jù)的儲存問題，隨著eDNA應(yīng)用越來越多，將會累積大量的數(shù)據(jù)，僅僅一個環(huán)境樣本就會產(chǎn)生千萬數(shù)量級的DNA宏條形碼，這就需要有更大容量的數(shù)據(jù)庫來存儲，就像“GenBank”一樣，將有用的數(shù)據(jù)進行有效的管理和分享［65］?？傊?，長遠來看，eDNA技術(shù)將替代一些傳統(tǒng)技術(shù)，但是在大多數(shù)情況下它與傳統(tǒng)方法有機結(jié)合相互補充才能夠發(fā)揮更好效果，

這需要生態(tài)學(xué)家、生物信息學(xué)家和統(tǒng)計學(xué)家的密切協(xié)作才能實現(xiàn)。目前，eDNA研究尚處于初級階段，其應(yīng)用和發(fā)展前景非常廣闊，這些新方法的應(yīng)用將促進人們了解從分子到整個生態(tài)系統(tǒng)各個層次的組織結(jié)構(gòu)和相互作用，整合生態(tài)學(xué)的思想也許將改變傳統(tǒng)上人們對生態(tài)學(xué)的認(rèn)識。

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（責(zé)任編輯 狄艷紅）

Applications of Environmental DNA Approaches to Ecological Researches

Xu Hao Luo Xi Li Yun Xue Yang Ye Qin
（Key Laboratory of Freshwater Fish Reproduction and Development（Ministry of Education），College of Animal Science and Technology，Southwest University，Chongqing 400716）

Environmental DNA（eDNA）refers to DNA that can be extracted from environmental samples, without first isolating any target organisms, which includes DNA of environmental microorganisms, alive cellular fallen off from organisms, and extracellular DNA resulting from natural death organisms and subsequent destruction of cell structure. According to metagenomics concept, eDNA technologies mainly refers to the methods of sequencing analysis with genomic DNA from environmental samples. Comparing with the traditional way, the significant advantage of eDNA technologies is more efficient in solving the classification problem of mass organisms in given environmental sample, which exert shorter time-consuming, lower cost, higher accuracy. The next generation of high-throughput sequencing technology（NGS）further expands the application fields of eDNA technologies, from microbiological field to zoological and botanic fields, and results in an innovation in research methods and ideas in traditional ecology. The present review summarized the eDNA technologies and applications aspects in analysis of biological diversity, animal diets, aquatic biomass estimation, etc. Finally, the trends and prospects regarding eDNA technologies development are presented.

Environmental DNA Metagenomics Ecology Species classification

2014-03-28

國家農(nóng)業(yè)部種質(zhì)資源保護項目（2013），中國長江三峽集團公司項目（0799526）

徐浩，男，碩士，研究方向：分子生態(tài)學(xué)；E-mail：haoxusw@163.com

李云，男，博士，教授，研究方向：魚類生理生態(tài)學(xué)；E-mail：yunlicn@126.com