Pseudomonas sp. F-12發(fā)酵優(yōu)化及轉(zhuǎn)化合成半胱氨酸的研究

趙婧楠 李志敏 葉勤

（華東理工大學(xué)生物反應(yīng)器工程國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200237）

Pseudomonas sp. F-12發(fā)酵優(yōu)化及轉(zhuǎn)化合成半胱氨酸的研究

趙婧楠 李志敏 葉勤

（華東理工大學(xué)生物反應(yīng)器工程國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200237）

通過不同發(fā)酵策略對(duì)Pseudomonas sp. F-12以DL-2-氨基-△2-噻唑啉-4-羧酸（DL-ATC）為底物生產(chǎn)L-半胱氨酸的過程進(jìn)行優(yōu)化，以分批發(fā)酵和指數(shù)流加發(fā)酵的形式進(jìn)行生產(chǎn)，將發(fā)酵過程中的DL-ATC濃度分別控制在5 g/L和15 g/L。結(jié)果表明15 g/L DL-ATC分批發(fā)酵生產(chǎn)L-半胱氨酸得到最高酶活為149.1 U/mL，比活為70.9 U/mg DCW；采用15 g/L DL-ATC兩階段指數(shù)流加發(fā)酵，可使最高酶活達(dá)到313.3 U/mL，提高為分批發(fā)酵的2.1倍。同時(shí)在兩階段發(fā)酵過程中，能減少DL-ATC用量為5 g/L。兩階段發(fā)酵過程采用不同流加策略，證明菌體得率對(duì)酶活水平有顯著影響。首次考察了Pseudomonas sp. F-12全靜息細(xì)胞轉(zhuǎn)化合成L-半胱氨酸的主要影響因素。結(jié)果表明Pseudomonas sp. F-12的最適轉(zhuǎn)化pH為8.0，最適轉(zhuǎn)化溫度為30℃。加入甲苯等有機(jī)溶劑改變細(xì)胞膜通透性，使得半胱氨酸產(chǎn)量比對(duì)照組提高7.16倍，最高摩爾轉(zhuǎn)化率達(dá)到93.3 %。不同金屬離子對(duì)轉(zhuǎn)化影響不同，0.1 mmol/ L Fe2+對(duì)轉(zhuǎn)化反應(yīng)有促進(jìn)作用，0.1 mmol/L Co2+、Zn2+、Ni2+等重金屬離子有抑制作用。研究結(jié)果為微生物法發(fā)酵及全細(xì)胞轉(zhuǎn)化合成半胱氨酸的后續(xù)工業(yè)化奠定了基礎(chǔ)。

假單胞菌 L-半胱氨酸 DL-2-氨基-△2-噻唑啉-4-羧酸（DL-ATC） 發(fā)酵 生物轉(zhuǎn)化

L-半胱氨酸（L-cysteine，C3H7NO2S，分子量121.12）是唯一的含巰基氨基酸，肽鏈之間以二硫鍵（S-S）連接［1］，化學(xué)性質(zhì)活潑。L-半胱氨酸可作為呼吸系統(tǒng)藥物，面團(tuán)性質(zhì)改良劑和美白用品等廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、食品和化妝品行業(yè)［2］。

目前我國半胱氨酸的工業(yè)生產(chǎn)主要采用毛發(fā)水解法，但該工藝在制備過程中產(chǎn)生大量廢酸和廢氣，造成嚴(yán)重環(huán)境污染［3］。1977年，日本學(xué)者Sano等［4］發(fā)現(xiàn)嗜硫氮雜環(huán)戊烯假單胞菌（Pseudomonas thiozolinophilum）可以轉(zhuǎn)化DL-2-氨基-Δ2-噻唑啉-4

羧 酸（DL-2- Amino-Δ2-thiazoline-4-carboxylic Acid）合成L-半胱氨酸。相比毛發(fā)水解法，微生物轉(zhuǎn)化法具有工藝簡(jiǎn)單、環(huán)境友好等優(yōu)點(diǎn)。其轉(zhuǎn)化途經(jīng)已進(jìn)行詳細(xì)研究，如圖1所示［5-7］。日本已能在工業(yè)規(guī)模利用微生物法轉(zhuǎn)化合成半胱氨酸，而我國仍然較多采用毛發(fā)水解法，因此開展微生物法生產(chǎn)L-半胱氨酸的研究十分有必要。

圖1 DL-ATC轉(zhuǎn)化半胱氨酸的途徑

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種 假單胞菌F-12（Pseudomonas sp. F-12），本研究室篩選保存［8］。

1.1.2 材料與試劑 DL-ATC（分析純）購自天津試劑二廠，葡萄糖為食品級(jí)別。其他試劑為市售分析純。

1.1.3 培養(yǎng)基 （1）種子培養(yǎng)基（g/L）：DL-ATC 15，KH2PO41，MgSO40.5，F(xiàn)eSO40.01，MnSO40.007。其中MnSO4，F(xiàn)eSO4溶液過濾滅菌加入，其余培養(yǎng)基121℃，滅菌20 min。（2）5 L罐分批發(fā)酵培養(yǎng)基（g/L）：DL-ATC 15，KH2PO41，MgSO40.5，F(xiàn)eSO40.01。MnSO40.007。其中MnSO4，F(xiàn)eSO4過濾滅菌加入，其余培養(yǎng)基121℃，滅菌20 min。（3）5 L罐兩階段發(fā)酵培養(yǎng)基（g/L）：葡萄糖2，KH2PO41，NH4Cl 2，MgSO40.5，F(xiàn)eSO40.01，MnSO40.007。 其中FeSO4和MnSO4過濾滅菌加入。補(bǔ)料葡萄糖為1 mol/L，25%的氨水調(diào)節(jié)pH7.0。

1.2 方法

1.2.1 種子培養(yǎng)條件 將-20℃甘油管保存的假單胞菌500 μL接種于的250 mL搖瓶，裝30 mL種子培養(yǎng)基。30℃，220 r/min搖床培養(yǎng)30 h。將一級(jí)種子液按1%-2%的接種量，接種于500 mL搖瓶，裝液量為100 mL，30℃，220 r/min搖床培養(yǎng)12 h。

1.2.2 5 L罐分批發(fā)酵 5 L發(fā)酵罐，裝2 L發(fā)酵培養(yǎng)基，按接種量10%進(jìn)行接種。培養(yǎng)條件為溫度30℃，通氣量2 vvm，攪拌轉(zhuǎn)速初始600 r/min，之后根據(jù)溶氧逐步提高。1 mol/L H2SO4控制發(fā)酵過程pH6.8-7.0。每1 h取樣，測(cè)定菌濃和發(fā)酵產(chǎn)物，留樣待測(cè)酶活。

1.2.3 5 L罐兩階段指數(shù)流加發(fā)酵 兩階段法生產(chǎn)半胱氨酸，第一階段為菌體高密度生長階段，以指數(shù)流加的方式流加葡萄糖，使菌體密度達(dá)到最大。第二階段加入5 g/L或15 g/L DL-ATC誘導(dǎo)酶活。

發(fā)酵罐裝液量2 L，接入二級(jí)種子200 mL，培養(yǎng)條件為溫度30℃，初始攪拌轉(zhuǎn)速600 r/min，初始通氣量2 vvm。菌體生長階段以25%氨水調(diào)節(jié)pH值，流加葡萄糖的濃度為1 mol/L。第二階段以1 mol/L H2SO4加入調(diào)節(jié)pH值。

1.2.4 DL-ATC濃度對(duì)菌體生長及酶活影響試驗(yàn)5 L罐發(fā)酵收集發(fā)酵液100 mL，4℃、12 000 r/min離心20 min。將離心得到的菌體利用種子培養(yǎng)基洗滌兩次，再重懸于20 mL的種子培養(yǎng)基中得到濃縮菌液。將濃縮菌液以2%的接種量加入到含有不同濃度DL-ATC的搖瓶中，30℃、220 r/min培養(yǎng)12 h，每2 h取樣1次，每組試驗(yàn)兩個(gè)平行對(duì)照。

1.2.5 假單胞菌F-12轉(zhuǎn)化細(xì)胞的制備 將-20℃保存的菌株接種到裝有30 mL種子培養(yǎng)基的三角瓶中，30℃、220 r/min培養(yǎng)30 h。將培養(yǎng)好的一級(jí)種子液按2%接種量接種到裝有100 mL培養(yǎng)基的500 mL三角瓶中，30℃、220 r/min培養(yǎng)12 h。發(fā)酵液6 000 r/min、4℃離心10 min，棄上清液，將菌體用1 mol/L的磷酸緩沖液離心洗滌2次，得到轉(zhuǎn)化反應(yīng)所需的靜息細(xì)胞。

1.2.6 pH對(duì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化反應(yīng)的影響 用磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖體系配制pH值為4.0、5.0、6.0、7.0的轉(zhuǎn)化液，甘氨酸-氫氧化鈉緩沖配制pH值為8.0、9.0、10.0的轉(zhuǎn)化液。利用1 mol/L、pH8.0的磷酸緩沖液將靜息細(xì)胞配制成OD為8.9的細(xì)胞懸液，置于水浴搖床（100 r/min）進(jìn)行反應(yīng)，每2 h取樣1 mL，12 000 r/min、4℃離心10 min，取上清測(cè)定L-半胱氨酸含量。

1.2.7 溫度對(duì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化反應(yīng)的影響 配制pH為8.0，DL-ATC濃度為 10 g/L的轉(zhuǎn)化液。利用上述轉(zhuǎn)化液將發(fā)酵獲得的靜息細(xì)胞配置成OD為9.0的細(xì)胞懸液，分別在30℃、37℃、42℃、45℃水浴條件下進(jìn)行轉(zhuǎn)化，每2 h各取樣1 mL，測(cè)定半胱氨酸含量。

1.2.8 細(xì)胞滲透劑對(duì)轉(zhuǎn)化反應(yīng)的影響 將培養(yǎng)細(xì)胞離心重懸，在菌液中分別加入1 mL甲苯、吐溫80、氯仿、CTAB（十六烷基三甲基溴化銨），將各類有機(jī)試劑與細(xì)胞充分混勻，30℃混合培養(yǎng)20 min，12 000 r/min離心10 min棄去上清，加1 mL pH8.0的磷酸緩沖溶液重懸。取處理過的菌液作轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化液中DL-ATC濃度10 g/L。

1.2.9 金屬離子對(duì)轉(zhuǎn)化反應(yīng)的影響 考察了Mg2+、Fe2+、Co2+、Al3+、Ca2+、Zn2+、Ni2+、Mn2+對(duì)轉(zhuǎn)化的影響，配制含上述8種金屬離子（0.1 mmol/L）的DL-ATC轉(zhuǎn)化液。加入靜息細(xì)胞，置于水浴搖床進(jìn)行轉(zhuǎn)化，每2 h取樣1次，測(cè)定半胱氨酸含量。

1.2.10 分析方法

（1）菌體濃度采用濁度法測(cè)定。將培養(yǎng)的菌液按適當(dāng)比例進(jìn)行稀釋，使用721型分光光度計(jì)在600 nm下檢測(cè)發(fā)酵液的光密度（OD600）。

（2）發(fā)酵液中殘留的DL-ATC采用島津LC-20A型高效液相色譜儀測(cè)定［9］。色譜柱為C18柱（150 mm×4.6 mm，Wondasil，Japan），檢測(cè)器為紫外檢測(cè)器（SPD-20A），波長260 nm，柱溫30℃，流動(dòng)相為1∶1的超純水和乙腈，流速為0.6 mL/min。

（3）酶活測(cè)定。在轉(zhuǎn)化過程中有3種酶存在，這3種酶結(jié)合在一起形成半胱氨酸合成酶，其活性能反應(yīng)完整細(xì)胞的轉(zhuǎn)化能力［10］。檢測(cè)表觀半胱氨酸合成酶活性的方法：細(xì)胞放置于1.5 mL離心管中，4℃，12 000 r/min離心5 min，加入0.1 mol/L 磷酸緩沖液（pH8.0）洗滌2次，重懸于包含10 g/L DLATC的0.1 mol/L磷酸緩沖液（pH 8.0），42℃ 水浴15 min，加入200 μL 10%（W/V）鹽酸停止反應(yīng)，利用酸式茚三酮法測(cè)定半胱氨酸含量［11］。一個(gè)酶活單位定義為在上述標(biāo)準(zhǔn)條件下1 min產(chǎn)生1 μg L-半胱氨酸所需的酶量。單位菌體質(zhì)量的酶活力定義為比活。

（4）半胱氨酸含量的測(cè)定。取待測(cè)發(fā)酵液于4℃，12 000 r/min，離心10 min，棄上清，沉淀用25 mL溶有10 g/L DL-ATC的磷酸緩沖溶液（pH8.0）重懸。42℃水浴搖床（100 r/min）中，反應(yīng)10-12 h，每2 h取樣1 mL。將樣品12 000 r/min，室溫離心10 min，取上清煮沸1 min，相同條件離心，再取上清利用酸式茚三酮法測(cè)定半胱氨酸含量。

2 結(jié)果

2.1 5 L罐15 g/L DL-ATC分批及兩階段發(fā)酵

圖2 假單胞菌F-12 15 g/L DL-ATC分批發(fā)酵

5 L罐15 g/L DL-ATC分批發(fā)酵曲線如圖2所示。整個(gè)發(fā)酵過程為10 h，發(fā)酵8 h溶氧迅速跳升，9 h達(dá)到最高OD 5.38。在0-4 h基本檢測(cè)不到酶活的產(chǎn)生，說明此階段DL-ATC用于菌體生長，沒有誘導(dǎo)

出轉(zhuǎn)化的酶。5 h之后開始產(chǎn)生酶活。在溶氧跳升點(diǎn)后1 h，酶活產(chǎn)生最大值為148.1 U/mL，比活為70.9 U/mg DCW。在發(fā)酵過程中，溶氧和菌濃可作為重要指標(biāo)判斷出酶活情況。溶氧跳升說明碳氮源物質(zhì)供給不足，跳升后菌體濃度基本不再增加，此時(shí)DLATC消耗完全，產(chǎn)物積累最多，因此在溶氧跳升點(diǎn)產(chǎn)生酶活最大值。

分批發(fā)酵可知菌體生長和誘導(dǎo)酶活均依賴于唯一的碳氮源DL-ATC。因此若要降低成本，菌體生長階段可采用較廉價(jià)的碳氮源如葡萄糖。Pseudomonas sp. F-12在以DL-ATC為碳氮源的分批培養(yǎng)情況下，最大OD值僅為5.38。由分批試驗(yàn)可知，Pseudomonas sp. F-12產(chǎn)生酶活與菌體濃度相關(guān)，若要獲得較高的酶活需要提高菌濃。考慮降低成本，同時(shí)希望獲得更高的酶活，故采用兩階段策略進(jìn)行發(fā)酵。兩階段發(fā)酵第一階段以葡萄糖為碳源，以氨水為氮源高密度發(fā)酵產(chǎn)生菌體；第2階段一次性補(bǔ)加DL-ATC進(jìn)行誘導(dǎo)。

圖3 假單胞菌F-12 15 g/L DL-ATC指數(shù)流加發(fā)酵

如圖3所示，葡萄糖作為碳源時(shí)菌體增加較快，在16 h菌體達(dá)到最大OD 29.1。生長階段初期，生長速率會(huì)超過0.2 h-1以上，之后隨限制性因素增加，代謝副產(chǎn)物大量積累，增長速率逐漸放緩。菌體達(dá)到最大OD加入DL-ATC進(jìn)行誘導(dǎo)。誘導(dǎo)階段溶氧逐漸下降，4 h后溶氧跳升發(fā)酵結(jié)束。在誘導(dǎo)后3 h，酶活最高，達(dá)到313.3 U/mL。指數(shù)流加發(fā)酵得到的最大單位酶活為分批發(fā)酵的2.1倍，有效提高了體積酶活，但是比酶活并未顯著升高。主要原因是菌體生長階段利用葡萄糖代謝，積累酸性物質(zhì)，此酸性物質(zhì)會(huì)影響菌體轉(zhuǎn)化活力［8］。誘導(dǎo)后期，由于溶氧條件限制及代謝廢物的積累導(dǎo)致菌體的比生長速率明顯下降，大量菌體自溶，利用DL-ATC能力降低，因此菌體相對(duì)比活并無提高。

2.2 搖瓶試驗(yàn)對(duì)比不同濃度DL-ATC對(duì)生長和酶活的影響

搖瓶考察不同DL-ATC濃度對(duì)菌體生長和產(chǎn)酶的影響。由圖4可知，DL-ATC濃度對(duì)于菌體生長有一定影響。在20 g/L DL-ATC發(fā)酵6 h下，菌體得到最高菌濃OD600為5.67。在5 g/L、10 g/L和15 g/L DL-ATC濃度下，菌濃最高值OD600分別為5.33，5.34和5.65，為20 g/L DL-ATC的94%，94.5%和99.6%，其結(jié)果相差不大。由圖5可知，在DL-ATC濃度10 g/L時(shí)，酶活的誘導(dǎo)效果最好，達(dá)到13.12 U/mL。5 g/L、15 g/L和20 g/L DL-ATC濃度誘導(dǎo)的酶活分別為12.86 U/mL，12.73 U/mL，11.43 U/mL。酶活為10 g/L DL-ATC誘導(dǎo)的98%，97%和87%。搖瓶試驗(yàn)成功地將DL-ATC由原來的15-20 g/L降低為5-10 g/L。

圖4 不同DL-ATC濃度對(duì)菌體濃度及酶活影響曲線

2.3 5 L罐5 g/L DL-ATC分批及兩階段發(fā)酵

5 L罐Pseudomonas sp. F-12的分批發(fā)酵，DLATC的量減少為5 g/L。發(fā)酵趨勢(shì)與15 g/L DL-ATC差別不大，酶活測(cè)定結(jié)果見圖5。

圖5 假單胞菌F-12 5 g/L DL-ATC分批發(fā)酵過程中的酶活表達(dá)

5 L罐5 g/L DL-ATC分批發(fā)酵菌體OD達(dá)到最大值為3.19。 3-5 h比生長速率迅速升高，同時(shí)酶活逐漸增高。溶氧跳升后酶活達(dá)到最大為95.5 U/mL，比活為91.5 U/mg DCW。相比較15 g/L DL-ATC與5 g/L DL-ATC發(fā)酵情況，5 g/L DL-ATC菌體濃度為3.19，為15 g/L DL-ATC 最大菌體濃度的59.3%。5 g/L DL-ATC分批發(fā)酵最大酶活為95.5 U/mL，為15 g/L DL-ATC最大酶活148.1 U/mL的64.5%，而比酶活5 g/L DL-ATC分批發(fā)酵高于15 g/L DL-ATC分批發(fā)酵，說明5 L罐分批發(fā)酵降低DL-ATC濃度可行。

兩階段發(fā)酵降低DL-ATC濃度進(jìn)行誘導(dǎo)，以兩種控制不同比生長速率的策略考察對(duì)于酶活的影響。第一種策略以比生長速率0.2 h-1控制菌體生長，再以5 g/L DL-ATC進(jìn)行誘導(dǎo)。第二種策略以比生長速率0.27 h-1控制菌體生長，再以5 g/L DL-ATC進(jìn)行誘導(dǎo)，結(jié)果如圖6和圖7。

圖6 假單胞菌F-12 5 g/L DL-ATC 指數(shù)流加發(fā)酵（策略1）

圖7 假單胞菌F-12 5 g/L DL-ATC指數(shù)流加發(fā)酵（策略2）

第1種策略下的菌體最高OD為21.2，平均比生長速率為0.233 h-1，得率為0.296。第2種策略菌體最高OD為24.5，平均比生長速率為0.235 h-1，得率為0.241。兩種情況比生長速率基本一致，但得率有較大差別。第一種情況體積酶活為62.99 U/mL，比活為16.4 U/mg DCW。第2種情況下體積酶活為60.4 U/mL，比活為6.63 U/mg DCW。得率不同，積累的代謝副產(chǎn)物有機(jī)酸的量不同，因此兩種不同得率的情況酶活有較大差別。得率的高低和副產(chǎn)物的合成可與補(bǔ)堿消耗量相耦聯(lián)分析。Pseudomonas sp. F-12利用葡萄糖的過程中，會(huì)產(chǎn)生有機(jī)酸，造成pH的下降。補(bǔ)入的氨水可以中和生成的有機(jī)酸，使發(fā)酵液保持恒定的pH。消耗氨水的量越多，說明副產(chǎn)物有機(jī)酸產(chǎn)生越多。在策略一得率0.296的情況下，消耗氨水量較少，為153.7 g。在策略二得率0.241的情況下，氨水消耗為208.4 g，說明此時(shí)有機(jī)酸產(chǎn)生量多。初步推斷發(fā)酵過程中產(chǎn)生的未知有機(jī)酸，對(duì)于酶活有較大的影響。

2.4 轉(zhuǎn)化合成研究

發(fā)酵獲得全細(xì)胞后，研究不同pH，轉(zhuǎn)化溫度，底物濃度，不同表面活性劑及不同金屬離子對(duì)其轉(zhuǎn)化合成半胱氨酸的影響。

不同pH和溫度對(duì)全細(xì)胞轉(zhuǎn)化反應(yīng)有顯著影響（圖8）。反應(yīng)時(shí)間為8 h，pH值為8.0時(shí)合成L-半胱氨酸為1.65 g/L。當(dāng)pH值大于9.0時(shí)，L-半胱氨

酸產(chǎn)量顯著下降。pH值小于6.0時(shí)，幾乎沒有L-半胱氨酸生成。pH9.0轉(zhuǎn)化合成半胱氨酸的量要大于pH7.0，說明Pseudomonas sp. F-12在堿性條件下的轉(zhuǎn)化水平要優(yōu)于中性及酸性條件。Pseudomonas sp. F-12最適轉(zhuǎn)化pH值為8.0（圖8-A），與此前文獻(xiàn)報(bào)道的凍融細(xì)胞最適轉(zhuǎn)化pH一致［12，13］。

考察在30、37、42、45℃條件下合成L-半胱氨酸的情況（圖8-B）。轉(zhuǎn)化溫度為30和37℃時(shí)，L-半胱氨酸產(chǎn)量呈持續(xù)上升趨勢(shì)。轉(zhuǎn)化溫度為42℃和45℃時(shí)，L-半胱氨酸產(chǎn)量在8 h時(shí)達(dá)到最大值，隨后半胱氨酸轉(zhuǎn)化量下降。分析原因?yàn)楸驹囼?yàn)使用靜息細(xì)胞，未經(jīng)凍融，細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)沒有破裂滲出，細(xì)胞內(nèi)絕大多數(shù)酶在30-37℃為最適轉(zhuǎn)化溫度，轉(zhuǎn)化溫度在42℃以上，超過細(xì)胞體內(nèi)酶的耐受范圍，因此轉(zhuǎn)化時(shí)間縮短且轉(zhuǎn)化量較低。由前期試驗(yàn)可知凍融細(xì)胞的最適轉(zhuǎn)化溫度為42℃，本試驗(yàn)證明靜息細(xì)胞與凍融細(xì)胞在轉(zhuǎn)化溫度上有較大差別。

圖8 轉(zhuǎn)化液pH值（A）和溫度（B）對(duì)L-半胱氨酸合成的影響

表面活性劑顯著降低表面張力，改變細(xì)胞通透性，使細(xì)胞內(nèi)的酶系更易滲出，從而促進(jìn)轉(zhuǎn)化反應(yīng)。不同表面活性劑對(duì)轉(zhuǎn)化反應(yīng)作用不同（表1）。甲苯的促進(jìn)效果最為顯著，為空白對(duì)照的7.16倍，最高摩爾轉(zhuǎn)化率達(dá)到93.3%。CTAB的促進(jìn)作用弱于甲苯，產(chǎn)量達(dá)空白對(duì)照的1.86倍。氯仿對(duì)轉(zhuǎn)化略有促進(jìn)作用。

金屬離子對(duì)轉(zhuǎn)化過程有不同程度的激活或抑制作用。試驗(yàn)考察了Mg2+、Fe2+、Co2+、Al3+、Ca2+、Zn2+、Ni2+、Mn2+對(duì)轉(zhuǎn)化的影響（表2）。過高金屬離子濃度會(huì)極大影響轉(zhuǎn)化反應(yīng)進(jìn)行，而過低的濃度則不能體現(xiàn)出金屬離子的影響，目前已知報(bào)道中多以濃度0.1 mmol/L為標(biāo)準(zhǔn)［14］。

相比較空白對(duì)照，F(xiàn)e2+對(duì)轉(zhuǎn)化反應(yīng)的促進(jìn)效果最顯著，為空白對(duì)照的1.5倍。Co2+、Zn2+、Ni2+、Al3+等重金屬離子對(duì)生物體往往具有毒性，這幾種金屬離子對(duì)于DL-ATC轉(zhuǎn)化L-半胱氨酸具有明顯抑制作用。在0.1 mmol/L 濃度下Mn2+、Ca2+、Mg2+等金屬離子對(duì)轉(zhuǎn)化反應(yīng)影響不明顯。

表1 表面活性劑對(duì)L-半胱氨酸合成的影響

表2 不同金屬離子對(duì)L-半胱氨酸合成的影響

3 討論

半胱氨酸在工業(yè)具有廣泛用途，日本微生物法已能實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)，其摩爾轉(zhuǎn)化率能達(dá)到100%。而我國微生物酶法仍處在實(shí)驗(yàn)室階段。南開大學(xué)劉忠等［15］以DL-ATC為唯一氮源篩選到假單胞菌TS1138，鑒定其產(chǎn)物為L-半胱氨酸。懷麗華等［16，17］采用5 L發(fā)酵罐對(duì)TS1138菌株的補(bǔ)料分批發(fā)酵動(dòng)力學(xué)及合成途徑的代謝控制進(jìn)行了研究。周昌平等［18］對(duì)酶促反應(yīng)條件進(jìn)行探討，菌體42℃下

轉(zhuǎn)化2.5 h，產(chǎn)物的質(zhì)量濃度可達(dá)6 g/L。浙江大學(xué)吳敏［19］等以假單胞菌酶法轉(zhuǎn)化DL-ATC合成L-半胱氨酸，篩選到的菌株進(jìn)行原生質(zhì)體誘變后，最高轉(zhuǎn)化量為10 g/L，摩爾轉(zhuǎn)化率達(dá)到76.5%。這些研究仍然與工業(yè)化微生物法生產(chǎn)半胱氨酸具有較大差距，因此優(yōu)化發(fā)酵過程，提高產(chǎn)量、轉(zhuǎn)化率和降低成本具有深遠(yuǎn)意義。

在本試驗(yàn)中Pseudomonas sp. F-12分批發(fā)酵以DL-ATC為唯一碳氮源，DL-ATC既可作為反應(yīng)底物也可作為酶活的誘導(dǎo)物，在發(fā)酵過程中能很快誘導(dǎo)出轉(zhuǎn)化的酶活體系。發(fā)酵過程中平均比生長速率達(dá)到0.305 h-1，比生長速率較高，酶活相對(duì)較高，說明菌體活力能明顯影響酶活。

兩階段發(fā)酵采用指數(shù)流加的方式控制菌體生長階段葡萄糖流加量，以葡萄糖作為限制性底物。結(jié)果表明，Pseudomonas sp. F-12細(xì)胞具有快速代謝葡萄糖的能力，如葡萄糖濃度超過2 g/L，其發(fā)酵液中可檢測(cè)到未知有機(jī)酸的存在。菌體在利用葡萄糖的過程中，過多的葡萄糖會(huì)導(dǎo)致副產(chǎn)物積累。

靜息細(xì)胞轉(zhuǎn)化反應(yīng)，通過滲透處理可以促使底物進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)與酶進(jìn)行充分反應(yīng)，同時(shí)也有利于轉(zhuǎn)化產(chǎn)物被運(yùn)輸?shù)降郊?xì)胞外。加入表面活性劑或有機(jī)溶劑使得細(xì)胞滲透性增大，加快物質(zhì)運(yùn)輸?shù)哪芰?。本研究通過在轉(zhuǎn)化過程中加入滲透劑，增加細(xì)胞通透性，并且將細(xì)胞懸液置于搖床充分振蕩，可有效增加細(xì)胞與滲透劑的接觸，提高轉(zhuǎn)化量7.16倍以上。在金屬離子對(duì)于轉(zhuǎn)化反應(yīng)的影響過程中，可以在現(xiàn)結(jié)果基礎(chǔ)上采用不同濃度梯度金屬離子進(jìn)行轉(zhuǎn)化。提高Fe2+離子濃度，測(cè)定其能促進(jìn)反應(yīng)的濃度范圍。降低Co2+、Zn2+、Ni2+、Al3+離子濃度，測(cè)定抑制范圍。

4 結(jié)論

研究了不同發(fā)酵策略對(duì)Pseudomonas sp. F-12發(fā)酵生產(chǎn)L-半胱氨酸的影響。分批發(fā)酵控制DL-ATC濃度在15 g/L，最大體積酶活達(dá)到148.1 U/mL。兩階段發(fā)酵過程中，利用15 g/L DL-ATC進(jìn)行誘導(dǎo)最高體積酶活為313.3 U/mL，提高酶活為分批發(fā)酵的2.1倍。利用5 g/L DL-ATC進(jìn)行誘導(dǎo)最高體積酶活為62.99 U/mL，最高比酶活為16.4 U/mg DCW。較多代謝副產(chǎn)物的情況下，酶活受到一定影響，說明代謝產(chǎn)生的未知有機(jī)酸對(duì)于菌體誘導(dǎo)產(chǎn)生酶活有抑制作用?？疾炝宿D(zhuǎn)化液pH值、濃度，轉(zhuǎn)化溫度，不同滲透劑及金屬離子等因素對(duì)于轉(zhuǎn)化反應(yīng)的影響。在轉(zhuǎn)化液pH 8.0，加入1 mL甲苯的條件下，轉(zhuǎn)化量提高至原來的7.16倍，摩爾轉(zhuǎn)化率達(dá)到93.3%，是目前國內(nèi)報(bào)道的較高轉(zhuǎn)化水平。

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（責(zé)任編輯 李楠）

Study on Fermentation and Conversion of L-cysteine by Pseudomonas sp. F-12

Zhao Jingnan Li Zhimin Ye Qin
（State Key Laboratory of Bioreactor Engineering，East China University of Science and Technology，Shanghai 200237）

L-cysteine has been widely applied in food and pharmaceuticals. In this study, different fermentation strategies of Pseudomonas sp. F-12 transforming DL-ATC to L-cysteine were investigated. The results showed that the highest enzyme activity of 15 g/L DL-ATC batch fermentation was 149.1 U/mL, specific activity was 70.9 U/mg DCW. The highest enzyme activity of two phase fermentation using 15 g/L DLATC was 313.3 U/mL, 2.1 times higher than the batch fermentation. The amount of DL-ATC was reduced to 5 g/L. In this study, the major factors on the biotransformation of L-cysteine by Pseudomonas sp. F-12 were investigated. The optimal reaction conditions for cells were 30℃, pH 8.0. The addition of organic solvents could change cellular permeability and enhance the production of L-cysteine by 7.16 times. The maximum conversion of L-cysteine was 93.3%. 0.1 mmol/L Fe2+benefitted the reaction, while 0.1 mmol/L Co2+, Zn2+, Ni2+and other heavy metal ions inhibited transformation.

Pseudomonas sp. F-12 L-cysteine DL-ATC Fermentation Bioconversion

2014-04-24

趙婧楠，女，碩士，研究方向：生物催化與基因克隆；E-mail：zhaojingnan0218@163.com

李志敏，女，博士，教授，研究方向：生物化工，發(fā)酵工程，代謝工程，微生物生理和代謝調(diào)控；E-mail：lizm@ecust.edu.cn