膠原蛋白片的毒理安全性研究

楊亞飛

（湯臣倍健股份有限公司，廣東廣州510663）

膠原蛋白片的毒理安全性研究

楊亞飛

（湯臣倍健股份有限公司，廣東廣州510663）

為判定膠原蛋白片是否會對人體健康產生危害，進行了膠原蛋白片的安全性毒理學評價。采用急性毒性試驗、Ames試驗、小鼠骨髓微核試驗、微小鼠精子畸形試驗和30 d喂養(yǎng)試驗對膠原蛋白片的急性毒性、致突變性及亞慢性毒性進行了研究。結果表明：膠原蛋白片小鼠急性毒性試驗大于20 000mg/kg，屬實際無毒；對基因、體細胞與生殖細胞無明顯致突作用；分別按1.88、3.75、7.5g/kg的劑量用受試物喂養(yǎng)大鼠30d，結果表明動物未出現異常。

膠原蛋白片；急性毒性；微核；精子畸形；Ames試驗

膠原蛋白片是以膠原蛋白粉、天然VE為主要原料，用以增強免疫力的保健食品。免疫是指機體狻觸“抗原性異物”或“異己成分”的一種特異性生理反應[1]。免疫系統(tǒng)對維持機體正常生理功能具有重要意義。當人體營養(yǎng)素攝入不足（蛋白質、維生素、微量元素等缺乏）時會造成機體抵抗力下降，導致免疫活性降低，對免疫機制產生不良影響[2]。免疫活性的變化也影響其他器官的功能，如感染、癌癥[3]、各類的慢性病、失眠癥、抑郁癥、慢性疲勞、以及免疫復合病等等[4-5]。膠原蛋白片是一種以提高免疫力為主要功效的保健食品。為了研究其安全性，特對其毒理安全性進行了研究，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 樣品

膠原蛋白片為白色至淡黃色片劑。人體推薦量為每日4.5 g/60 kg。

1.2 試驗動物及試驗條件

清潔級ICR小鼠，生產許可證號：SCXK（滬）2007－0005，體重19 g～35 g，由上海斯萊克試驗動物有限責任公司提供。試驗動物飼養(yǎng)室溫度20℃～25℃，相對濕度40%～70%。試驗動物使用許可證號：SYXK（滬）2007－0008，動物飼料由蘇州雙獅試驗動物飲料科技服務有限公司提供，登記證號：蘇E飼生字審（2002）006。

1.3 小鼠急性毒性試驗

選用體重為19 g～22 g的昆明種小鼠20只，雌雄各半，分放于兩鼠籠內，同性別小鼠之間體重之差不超過3 g。采用最大耐受量法將受試樣品對試驗動物經口灌胃染毒，灌胃容量按每次0.4mL/20 g體重計。24 h內2次對小鼠灌胃，灌胃間隔時間為6 h。染毒后，觀察動物的一般狀態(tài)、體重變化、中毒癥狀和死亡情況等，觀察期為2周。試驗末再次對動物稱重，對死亡動物及到期處死動物進行尸體解剖，肉眼觀察大體病理改變情況。

1.4 遺傳毒性試驗

1.4.1 Ames試驗

測試菌株：TA97、TA98、TA100、TA102由美國加利福尼亞大學生物化學系提供，經鑒定測試菌株生物學特性符合標準要求。釆用平板摻入法，測試劑量為8、40、200、1 000、5 000μg/皿。樣品處理方法為：取經121℃高壓20min滅菌處理后的樣品2.5 g加無菌蒸餾水至20mL混勻，緩慢加入經預處理好的XAD-II樹脂柱，以20mL/h的流速進行吸附，以去除組氨酸，而后用洗耳球吹入空氣以驅走水分，加入重蒸餾的丙酮50mL，以20mL/h的流速進行洗脫，收集洗脫液。洗脫液經60℃揮發(fā)盡丙酮后，加入DMSO 50mL混勻，此收集液中的樣品含量即為50mg/mL。取收集液依次用DMS0按1∶4稀釋，取得各測試劑量組受試物?！侗墒称窓z驗與評價技術規(guī)范》（2003年版）中鼠傷寒沙門氏菌/哺乳動物微粒體酶試驗中平板摻入法，在保溫的45℃2mL頂層培養(yǎng)基中，依次加入0.1mL受試物、0.1mL菌株增菌液，需活化時加入0.5mLS9混合液，充分混勻迅速傾倒底層平板，做3個平行平板。37℃培養(yǎng)48 h，計數回變菌落數，試驗重復一次。

1.4.2 小鼠骨髓嗜多染紅細胞微核試驗

試驗選用清潔級昆明種小鼠50只，體重：25 g～30 g，雌雄各半。將動物隨機分為5組，每組10只，雌雄各半，分別作為樣品高中低3個劑量組（2.5、5、10 g/kg）及陰性對照組（蒸餾水20 g/kg）和陽性對照組（環(huán)磷酰胺40mg/kg）。釆用30 h兩次灌胃法，將配制的不同濃度樣品按0.4mL/20 g，分別對各組動物灌胃。于第二次灌胃后6 h，頸椎脫臼處死動物，取股骨骨髓加小牛血清混勻，常規(guī)涂片、固定，Giemsa.染色制片。鏡撿觀察，每鼠計數1 000個嗜多染紅細胞（PCE）的微核數，微核率以千分率表示，在計數嗜多染紅細胞（計數200個PCE）時同時計數成熟紅細胞（MCE）數，并計算PCE/ NCE值，用spss11.0進行統(tǒng)計分析。

1.4.3 小鼠精子畸形試驗

雄性昆明種小鼠25只，體重：25 g～35 g。將動物隨機分為5組，每組5只，分別作為樣品高中低3個劑量組（2.5、5、10g/kg）及陰性對照組（蒸餾水20g/kg）和陽性對照組（環(huán)磷酰胺40mg/kg）。將配制的不同濃度樣品按0.4mL/20 g分別對各組動物灌胃。每日1次，連續(xù)5 d。于首次給樣后第35天，頸椎脫臼處死動物，取二側副睪放入生理鹽水中，剪碎，四層過濾，取濾液涂片，固定，2%伊紅染色制片。鏡檢觀察，每鼠計數1 000個精子的畸形數，計算精子畸形發(fā)生率，并用spss11.0進行統(tǒng)計分析。

1.5 30 d喂養(yǎng)試驗

1.5.1 劑量組選擇與受試物給予方式

SD大白鼠80只，雌雄各半，體重60 g～80 g將動物隨機分為4組，每組20只，雌雄各半，分別作為祥品3個劑量組（1.88、3.75、7.5 g/kg，相當于人體推薦劑量的25、50、100倍），另設空白對照組，連續(xù)喂養(yǎng)30 d。根據本實驗劑量設計要求及動物飼料攝入情況（約10 g/100 gBW/d），分別將樣品281、563、1 125 g摻入飼料至15 kg，拌勻，經飼料機制成顆粒飼料，即成低、中、高三種不同樣品含量的飼料，分別給三組動物喂飼?？瞻讓φ战M給予不含樣品的同種飼料。在高劑量組飼料中摻入樣品達7.5%，根據受試蛋白含量調整高劑量組飼料蛋白質含量與對照組飼料一致為20%?？瞻讓φ战M給予不含樣品的基礎飼料。

1.5.2 觀察指標

1）一般情況每天觀察動物1次。

2）體重生長情況每周稱重1次。

3）飲料消耗及利用率每周添加飲料2次，稱重并記錄，同時記錄散失的飲料量。

4）血液學檢查于試驗第30天股動脈以血進行血紅蛋白的測定，紅細胞、白細胞、血小板、網織紅細胞計數及白細胞分類測定。

5）血液生化檢查于試驗第30天股動脈取血，分離血清，使用日立－7150全自動生化儀進行總蛋白（TP）、白蛋白（ALB）、谷丙轉氨酶（ALT）、谷草轉氨酶（AST）、葡萄糖（GLU）、肌酐（CR）、尿素氮（BUN）、膽固醇（T－CHE）及甘油三酯（TG）的測定。

6）臟器重量及病理組織學檢查試驗結束后，采用股動脈放血處死大鼠，立即解剖進行大體檢查。稱取肝、脾、雙側腎和睪丸，分別計算臟體比；以甲醛液固定肝、腎、十二指腸、卵巢、睪丸。石蠟包埋切片，H.E染色后進行病理組織學檢查。

2 結果與分析

2.1 急性經口毒性試驗

急性經口毒性試驗，見表1。

試驗期間各組動物活動正常，毛色光澤度好，未見任何中毒癥狀和死亡，到期處死動物，大體解剖肉眼觀察各臟器情況，未見異常。膠原蛋白片對雌雄小白鼠急性經口毒性試驗的最大耐受劑量MTD均大于20 000mg/kg。根據急性毒性（LD50）劑量的分級標準，膠原蛋白片屬無毒級。

表1 雌雄小鼠急性經口毒性試驗結果Table1 Resuts of acute toxcity to male&female mice by oral administration

2.2 遺傳毒性試驗

2.2.1 Ames試驗

在本實驗條件下的二次試驗中，受試物每皿8μg至5 000μg，在加與不加S9活化系統(tǒng)平板摻入法檢測的回復菌落數小于溶劑對照的2倍，也未呈現劑量反應關系，樣品Ames試驗結果為陰性。即膠原蛋白片未見致突變作用。兩次試驗結果分別見表2、表3。

表2 Ames試驗第一次測試結果Table2 The results of the first Ames test

表3 Ames試驗第二次測試結果Table3 The results of the second Ames test

2.2.2 骨髓細胞微核試驗

骨髓細胞微核試驗，見表4。

結果表明，試驗組小鼠在各試驗劑量下嗜多染紅細胞（PCE）微核出現率、PCE/成熟紅細胞與陰性對照組之間的差異均不顯著，而陽性對照組表現出強烈的致突變作用。經統(tǒng)計學分析，膠原蛋白片未見致突變作用。

2.2.3 小鼠精子畸形試驗

小鼠精子畸形試驗，見表5。

由表5可知，各劑量組小鼠的精子畸形發(fā)生率在正常范圍內，陽性對照組（環(huán)磷酰胺組）與陰性對照組之間的差異極顯著（P＜0.01）。

表4 動物骨髓嗜多染紅細胞微核發(fā)生率Table4 The incidence of polychromatic crythrocyte micronucleus of animals'marrow

表5 膠原蛋白片對小鼠精子畸形發(fā)生率的影響Table5 The influence of collagen tablets on the incidence of the sperm deformity of mice

注：**表示與陰性對照組差異極顯著（P＜0.01）。

2.3 30 d喂養(yǎng)試驗

2.3.1 一般情況

整個喂養(yǎng)期間，小鼠毛色正常，未見行為異常，無死亡發(fā)生。

2.3.2 食物利用率

以每100克飼料的大鼠增重克數計算食物利用率。由表6可知，各劑量組動物食物利用率與同性別對照組之間差異不顯著（P＞0.05）。

表6 膠原蛋白片30天喂養(yǎng)試驗對大鼠總食物利用率的影響Table6 The effect of collagen tablets on the food utilization rate in the30 days feeding study

2.3.3 血常規(guī)及血生化指標

血常規(guī)及血生化指標，見表7、表8。

表7 膠原蛋白片30 d喂養(yǎng)試驗大鼠血液學檢查結果Table7 The results of collagen tablets on the blood test of the rats in the30 days feeding study

表8 膠原蛋白片30 d喂養(yǎng)試驗大鼠的血清生化檢驗結果Table8 The results of collagen tablets on the Serum biochemical test in the30 days feeding study

由表7、表8可知，樣品分別按高、中、低劑量給予各組大鼠30 d，對照組和各劑量組的白細胞計數及其分類均在正常值范圍內。對照組和各劑量組的各項生化指標均在正常值范圍內。用SPSS11.0對結果進行方差分析：樣品各劑量組與對照組相比，均無顯著性差異（P＞0.05）。

2.3.4 臟體比

臟體比見表9。

表9 膠原蛋白片30 d喂養(yǎng)試驗對大鼠臟體比的影響Table9 The effet of collagen tablets on the Organ/body weight ratio in the30 days feeding study

由表9可知，各組的臟器絕對重量及其肝重/體重、脾重/體重、腎重/體重、睪丸重/體重比與對照組相比未見異常。

2.3.5 大體解剖及組織學檢查結果

1）大體解剖檢查樣品喂養(yǎng)30 d后，對各組實驗動物進行大體解剖，肉眼觀察各組動物臟器未發(fā)現明顯病變。

2）病理組織學檢查，僅選高劑量組及正常對照組（每組20只，雌雄各半）作組織病理學檢查。詳細結果見下：①肝臟：對照組雌鼠見1例肝細胞輕度空泡變性、1例匯管區(qū)炎癥細胞輕度浸潤。雄鼠見.1例肝細胞輕度空泡變性、1例匯管區(qū)炎癥細胞輕度浸潤。高劑量組雌鼠見.2例有少量肝細胞嗜酸性變。雄鼠見2例肝細胞輕度空泡變性、1例肝細胞周圍少量炎細胞浸潤、1例肝細胞輕度嗜酸性變、1例匯管區(qū)輕度炎癥細胞浸潤。②腎臟：對照組雌鼠腎皮質部見4例腎小管上皮細胞輕度腫脹、1例上皮細胞輕度空泡變性、2例腎小管管腔內少量管型，以及腎髓質部1例曲細精管中少量管型、1例間質炎細胞浸潤。雄鼠腎皮質部有2例腎小管管腔內少量管型。高劑量組雌鼠腎皮質部見3例腎小管上皮細胞輕度腫脹、2例輕度空泡變性、3例腎小管管腔內少量管型，以及腎髓質部1例間質炎細胞浸潤。雄鼠腎皮質部見3例腎小管管腔內少量管型，以及腎髓質部1例曲細精管中少量管型。③脾臟：對照組雌鼠脾臟未見異常，雄鼠3例脾臟紅髓輕度擴張。高劑量組見雌鼠2例、雄鼠3例脾臟紅髓輕度擴張。此外雌鼠還有1例造血細胞輕度增生。④胃腸：對照組雌鼠見胃黏膜下3例輕度炎細胞浸潤。雄鼠2例黏膜下少量炎細胞浸潤、以及1例輕度水腫。高劑量組雌鼠胃粘膜下分別有3例輕度炎細胞浸潤及水腫。雄鼠1例黏膜下少量炎細胞浸潤。⑤睪丸：對照組雄鼠睪丸可見3例間質輕度水腫。高劑量組有1例間質輕度水腫。⑥卵巢：對照組與高劑量組雌鼠均有1例卵巢輕度囊腫改變，而且高劑量組還有1例少量卵巢細胞變性。

3 小結

研究結果表明，膠原蛋白片小鼠經口LD50＞20.0 g/（kg·bw），屬實際無毒；對基因、體細胞及生殖細胞無明顯致突作用；受試物分別按照高、中、低劑量喂養(yǎng)大鼠30天，結果表明試驗期間動物未出現拒食現象，動物生長活動正常，皮毛濃密有光澤。各劑量組動物體重、食物利用率、主要臟體比與對照組差異不顯著。對照組和各劑量組的白細胞計數及其分類、紅細胞計數、血紅蛋白及各項生化指標均在正常值范圍內。大體解剖及組織學檢查未發(fā)現該受試物對各劑量組被檢動物的受檢臟器產生有意義的病理變化。

[1]劉波,章世元,姜德興,等.蛋白質氨基酸營養(yǎng)免疫研究[J].動物醫(yī)學與動物科學,2002,19(8)：38－41

[2]王秋卓.論膠原蛋白對人類健康的特殊作用[J].價值工程,2012, 31(5)：320－322

[3]郭愛平.免疫營養(yǎng)與抗腫瘤治療的研究進展[J].臨床腫瘤學雜志, 2006,11(4)：314－316

[4]王洪榮,季昀.氨基酸的生物活性及其營養(yǎng)調控功能的研究進展[J].動物營養(yǎng)學報,2013,25(3)：447-457

[5]武覆青.開發(fā)氨基酸營養(yǎng)保健制劑提高國民健康素質[J].中國制藥信息,2010,26(6)：38-40

Toxicological Safety Assessment on Collagen Tablet

YANG Ya-fei
（By-health Incorporated Company，Guangzhou 510663，Guangdong，China）

The toxicological safety assessment on collagen tablets was carried out in order to judge whether they do harm on human body.The acute toxicity，mutagenicity and subchronic toxicity were studied by using acute toxicity test，Ames test，mice marrow micronucleus experiment，mice sperm malformation experiment and 30-days feeding test.Results showed that the LD50 of acute toxicity test was over 20 000 mg/kg which signified harmlessness of the collagen tablets.

collagen talets；acute toxicity；micronucleus；sperm deformity；Ames test

10.3969/j.issn.1005-6521.2014.16.030

2013-05-26

楊亞飛（1979—），女（漢），碩士研究生，研究方向：藥劑學。