益生菌增殖因子及其效果檢驗方法的研究進展

魯慶，魯海波，劉香榮

（中南林業(yè)科技大學食品科學與工程學院，稻米及副產(chǎn)物深加工國家工程實驗室，湖南長沙410004）

益生菌增殖因子及其效果檢驗方法的研究進展

魯慶，魯海波*，劉香榮

（中南林業(yè)科技大學食品科學與工程學院，稻米及副產(chǎn)物深加工國家工程實驗室，湖南長沙410004）

益生菌是一類與宿主互利共生、有利于宿主健康的腸道生理細菌，其增殖因子的開發(fā)也越來越多，因此增殖效果的檢驗方法顯得十分重要。本文綜述了雙歧桿菌、乳桿菌等益生菌的增殖因子及其檢測方法，為增殖因子的開發(fā)研究和科學的增殖效果檢驗方法的建立提供參考。

益生菌；進展；措施

正常情況下人體腸道中存在著大量的微生物，其中一部分能調(diào)節(jié)或維持宿主的腸道菌群平衡，對宿主的健康有益。1989年，F(xiàn)uller把益生菌定義為能夠促進腸內(nèi)菌群生態(tài)平衡，對宿主起有益作用的活微生物制劑，這是目前人們最常用的定義[1]。但經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，死菌體細胞成分或代謝產(chǎn)物也具有與活菌相同的生理功能，所以目前通常認為：益生菌（Probiotics）是指某種微生物制劑或發(fā)酵制品能通過調(diào)節(jié)宿主黏膜與系統(tǒng)免疫功能或通過改善腸道營養(yǎng)與菌群平衡對宿主產(chǎn)生有益的生理作用，它通過定殖作用改變宿主某一部位菌群的組成，從而產(chǎn)生有利于宿主健康作用的單微生物或組成明確的混合微生物[2]。

益生菌具備以下特點：（1）黏附在宿主腸道上皮細胞上；（2）能耐受胃酸和膽鹽；（3）能清除或減少致病菌的黏附；（4）能產(chǎn)生酸、過氧化氫、細菌素等物質(zhì)，并以此抑制致病菌的生長；（5）安全、無致病性。益生菌廣泛存在于人和動物的乳汁、腸道、糞便中?？茖W家研究發(fā)現(xiàn)，益生菌在腸道內(nèi)達到106cfu/mL[3]，腸道才會健康，這是因為益生菌達到一定數(shù)量，能夠在體內(nèi)建立起一道堅固的微生態(tài)防護墻，促進營養(yǎng)吸收，保持腸道清潔和排便正常，同時減少毒素產(chǎn)生，從而抵抗衰老，真正健康長壽。并且，益生菌在腸道內(nèi)所占比例越高，腸道吸收營養(yǎng)、阻擋致病細菌和致癌物、促進正常排便等功能就越健全，腸道就越年輕。雙歧桿菌和乳桿菌是人體胃腸道內(nèi)重要的益生菌，與宿主終生伴隨[4]。雙歧桿菌在成人腸道中約占腸道總菌數(shù)的3%～10%，在嬰兒腸道占到91%以上[5]。雙歧桿菌和嗜酸乳桿菌在腸道內(nèi)的數(shù)目是評價機體健康程度的重要指標[6]。

1 研究進展

腸道菌群的組成與人體營養(yǎng)、免疫、癌癥、衰老等有著密切的關系，促進腸道中有益菌的增殖，抑制有害細菌的生長，可以防治糖尿病等一些常見病癥。因此益生菌及其制品成為研究的熱點，被廣泛地用于醫(yī)學、食品、生物等領域，在食品領域，益生菌產(chǎn)品的開發(fā)越來越得到人們的重視，成為益生菌研究的主流方向，如益生菌乳制品，一些保健食品，益生元食品等。益生菌廣泛存在于人和動物腸道內(nèi)，對營養(yǎng)要求極高且生長緩慢，對氧條件苛刻，尤其是雙歧桿菌，低pH的抵抗能力差，生存期較短，如何促進益生菌增殖一直是研究的熱點問題。益生菌制品到消費者飲用時活菌數(shù)必須在106cfu/mL才能發(fā)揮保健功能，但在益生菌制品中很難保證消費前保持足夠的活菌數(shù)。目前主要是尋找促進益生菌增殖的物質(zhì)，用以提高人體內(nèi)益生菌的水平，或促進體外培養(yǎng)液中益生菌的增殖。在人們對益生菌生長因素的研究中，發(fā)現(xiàn)了一種可以促進其生長的物質(zhì)—增殖因子。目前，寡聚糖類、多糖類、短鏈脂肪酸、部分蛋白水解物和天然植物及中草藥提取物已經(jīng)被證實具有增殖因子作用[7]。本文主要是從人體內(nèi)本身的益生菌出發(fā)，研究一些外來物質(zhì)，如低聚木糖等對益生菌增殖的影響，目前對這方面的研究還不是很成熟，尤其在添加劑方面，很少見相關的報道，但是在低聚糖，植物多糖，中藥合劑等方面的研究較多，并且研究大多停留在體外研究，對體內(nèi)的研究較少。

1.1 體外研究

微生物體外增菌研究主要是將微生物接種于培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，在不同時間分別測定其重量，吸光度（即比濁法），活菌數(shù)，酸度或者采用抑菌圈來比較其生長情況，對于不同濃度的添加物也以同樣的方法測定比較濃度對其增殖的影響。

1.1.1 重量法

將一離心管置于干燥烘箱中烘干至恒重，自然冷卻后用分析天平稱其質(zhì)量m1。準確稱取10mL菌液，調(diào)節(jié)pH至3，放入離心機中進行離心分離（3500 r/min、10min），傾去上清液，將菌體放進干燥箱中烘干至恒重，自然冷卻后取出稱重m2，利用差量法求得菌液中菌體的真實濃度。重量法作為經(jīng)典的分析方法，具有準確度高的特點。但是重量分析法操作繁瑣，耗時長，難以滿足控制分析的需要，且在微生物操作中無菌操作困難，容易感染雜菌。該法一般不用于分析菌液濃度的變化。

1.1.2 比濁法

分光光度法測菌液濃度來比較細菌生長情況在益生菌增菌中用的比較多，該法操作簡單，精確度高。劉彥亮[8]等研究了黃芪及其它中草藥對雙歧桿菌增菌的影響，采用比濁法，即將接種好的含中藥的培養(yǎng)基稀釋10倍，分別檢測其在波長600 nm處的吸光值。再取同樣的接種后的培養(yǎng)基37℃厭氧培養(yǎng)16 h后，同上稀釋10倍并檢測其在波長600 nm處的吸光度DD樣品，求出各培養(yǎng)基OD的增殖ΔOD，令E=ΔOD樣品-ΔOD對照，若E＞0，說明該中藥品種對雙歧桿菌有增殖作用，若E≤0說明該中藥品種對雙歧桿菌無明顯的增殖作用。其體外研究結(jié)果表明黃芪浸提液在體外對長雙歧桿菌Blm和兩歧雙歧桿菌Bbm的生長具有促進作用，將對其增殖促進效果明顯的黃芪制成50%、25%、12.5%、6.25%幾個濃度，加入基礎培養(yǎng)基中比較濃度對其增殖的影響，其效果隨著黃芪浸提液添加量的增加而增加，并且對不同菌種的促生長效果存在差異。

Raquel Tabasco[9]等研究了葡萄多酚對乳酸菌和雙歧桿菌生長的影響，乳酸菌每隔60min測定其OD600值來評價細菌的生長情況，雙歧桿菌在24 h和48 h測定吸光值的變化，將其與不加葡萄多酚的培養(yǎng)液OD值比較，繪制生長曲線，比較增菌變化。結(jié)果表明不同菌株之間抑菌性不同，且酚類組成也會影響抑菌活性，原花青素含量高的抑菌性也大。

劉嘉[10]等探討辣椒中主要成分辣椒素和發(fā)酵過程中食鹽質(zhì)量濃度對乳酸菌純培養(yǎng)物生長的影響，在MRS培養(yǎng)基中加入不同濃度的辣椒素樣液及食鹽，分別接種5種活化好的乳酸菌，在600 nm處每2小時測一次吸光值，與不加任何物質(zhì)的培養(yǎng)基中的菌種OD值比較，發(fā)現(xiàn)辣椒素及食鹽對乳酸菌的生長均有一定的延遲作用，辣椒素對乳酸菌抑制的最低質(zhì)量濃度為0.133mg/mL，且不同的菌株對食鹽的耐受能力不同。

燕衛(wèi)東[11]通過加入質(zhì)量濃度不同的硒培養(yǎng)基對乳酸菌進行培養(yǎng)，一定時間后迅速將培養(yǎng)液稀釋10倍，通過吸光值探討硒對乳酸菌增殖的影響。結(jié)果表明，硒在一定質(zhì)量濃度下對乳酸菌增殖具有促進作用，當硒質(zhì)量濃度在4mg/L時，菌體增殖量達到最大值。

1.1.3 活菌計數(shù)

活菌計數(shù)的方法較多，最常用的就是平板計數(shù)法，此外還有厭氧滾管計數(shù)法等。韓雪[12]等研究了幾種天然提取物對兩株雙歧桿菌的增殖作用，將菠菜汁、卷心菜汁、平菇浸出液、胡蘿卜汁、豆?jié){等各增殖因子分別按5%、15%、25%加入到基礎培養(yǎng)基中，按4%接菌量接種厭氧培養(yǎng)16 h后平板涂布計數(shù)。采用單因素選取各提取物的最佳增殖濃度，然后采取正交設計優(yōu)化出各物質(zhì)的最佳添加量組合。結(jié)果表明20%的平菇汁，20%的卷心菜汁，20%的豆?jié){，5%的胡蘿卜汁可使嬰兒雙歧桿菌PBA活菌數(shù)增加2.78倍；10%的平菇汁，15%的番茄汁，15%的肝浸汁可使長雙歧桿菌INF活菌數(shù)增加2.95倍。

段長恩[13]等探討椰子汁（CM）對青春雙歧桿菌（BFA）體外增殖的作用，將BFA接種于不同濃度的CM培養(yǎng)基和MRS液體培養(yǎng)基中，37℃厭氧培養(yǎng)，通過測定△OD及平板菌落數(shù)，分析BFA的體外生長情況。結(jié)果表明各濃度的CM對BFA體外增殖均起促進作用，并可以縮短該菌到達生長穩(wěn)定期的時間，可以作為BFA體外培養(yǎng)的天然培養(yǎng)基。

王忠堂等研究了核黃素對雙歧桿菌和芽孢桿菌增殖的影響發(fā)現(xiàn)：1 g/L核黃素組，在48 h后雙歧桿菌活菌數(shù)增加約10倍～100倍；0.5 g/L和0.25 g/L核黃素組，在72 h內(nèi)活菌數(shù)增加約10倍～390倍，并可提高懸液中雙歧桿菌和蠟樣芽孢桿菌的長期存活率。

劉彥亮等采用比濁法同時也將Blm和Bbm按0.1%接種量分別接種于含12.5%的4種中藥的基礎培養(yǎng)基中，37℃厭氧培養(yǎng)，分別于12 h和16 h后進行Hungate厭氧滾管計數(shù)。用2種方法評價4種中藥對雙歧生長的影響。

1.1.4 酸度測量

一般是用采用pHS-3C酸度計測定pH，有時還采用酸度滴定法。舒國偉[14]等在MRS培養(yǎng)基中分別加入不同濃度的水蘇糖、低聚木糖及低聚半乳糖，37℃恒溫培養(yǎng)，每隔一定時間取樣測定吸光值和pH，結(jié)果發(fā)現(xiàn)水蘇糖的添加在前期能加速兩歧雙歧桿菌的生長，且0.8%及1.0%的添加量對該菌有一定的生長促進作用；低聚木糖的最適添加量為0.8%；添加低聚半乳糖可促進兩歧雙歧桿菌的生長，最適添加量為0.6%。

萬榮峰，江善祥[15]研究了低聚異麥芽糖（IMO）和低聚果糖（FOS）對乳酸菌體外增殖的影響。結(jié)果顯示，在體外實驗中，IMO和FOS均對乳酸菌有一定生長促進作用，培養(yǎng)液pH略有下降，但與對照組相比，差異不顯著（P＞0.05），并且在普通肉湯培養(yǎng)基中增殖效果更加明顯。

戴遠臣[16]等將山楂多糖用于保加利亞乳桿菌的增殖試驗，通過測定其pH和吸光度表明山楂多糖對保加利亞乳桿菌有促生作用，并且在多糖添加量為2%，pH為6.5，溫度為42℃時促進效果最好。

王成濤[17]等研究了五味中藥對乳酸菌生長及保存活力的影響，結(jié)果表明：1%和2%的金銀花、青蒿對植物乳桿菌及嗜酸乳桿菌的生長和保存活性有明顯的促進作用，魚腥草的作用受其濃度的影響，而黃連和板藍根對它們的生長和保存有一定抑制作用，五味中藥對嗜熱鏈球菌生長都表現(xiàn)出明顯抑制作用，其中以魚腥草最為突出。

樂國偉和上海萊雀生物科技有限公司的沈會祥[18]，在不改變培養(yǎng)基其它成分的條件下，用兩種水解度不同的大豆肽A、B替代部分或者全部有機氮源，研究其對乳酸菌生長及產(chǎn)酸活力以及其對乳酸菌活力保持的促進作用。通過測定pH，菌液吸光值，平板計數(shù)及滴定酸度幾種指標來評價乳酸菌的生長情況。其中酸度滴定法是用標準的NaOH溶液進行，酸度=消耗NaOH的毫升數(shù)×c×10×20°T（c為NaOH標準溶液濃度）。結(jié)果顯示，兩種大豆肽對乳酸菌生長及產(chǎn)酸均有顯著的促進作用，且在酸奶發(fā)酵中添加大豆肽濃度為5 g/L時，大豆肽對乳酸菌作用效果最佳，且兩種肽比較，B效果更佳。

1.1.5 抑菌圈實驗

該法人為主觀性較大，結(jié)果不客觀，可以作為評價的指標，但是一般和其它方法結(jié)合使用進行實驗。田碧文[19]等研究了阿膠、五味子、枸杞和刺五加對嬰兒雙歧桿菌生長的影響，將制備好的菌液均勻涂布于BL血平板上，然后貼上占有這幾種中藥的紙片，用一個不含中藥的紙片做對照，厭氧培養(yǎng)24 h后觀察紙片周圍細菌生長情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)涂有阿膠、五味子、枸杞和刺五加這幾種中藥紙片周圍菌苔生長旺盛，說明對嬰兒雙歧桿菌生長有明顯的促進作用。

1.1.6 其它

張桂蘭[20]采用平板打洞法對青春雙歧桿菌和嬰兒雙歧桿菌進行了體外生長促進實驗，用無菌棉拭沾取106CFU/mL的菌液涂布接種于新鮮配制的BS瓊脂表面，重復3次，每次旋轉(zhuǎn)平皿約60度，使菌液均勻分布，蓋好平皿。放置2min左右，待平板表面水分吸收后，用外徑6mm的滅菌銅管于平板上打4個洞，并取出洞內(nèi)培養(yǎng)基。然后在不同孔內(nèi)分別加入上述不同濃度海帶汁0.05mL，同時另設一對照孔，內(nèi)加等量BS液體培養(yǎng)基，35℃厭氧培養(yǎng)48 h后，觀察細菌生長情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，兩種雙歧桿菌在含有海帶汁洞口周圍，菌苔生長均較為茂盛；隨著離洞口的距離漸近，菌苔逐漸增厚；隨著海帶汁濃度的增加，菌苔茂盛程度增加，活菌數(shù)亦增多；在海帶培養(yǎng)基中，雙歧桿菌增殖12 h基本達到穩(wěn)定期，與對照管比較，增殖速度快而穩(wěn)定。

近幾年體外試驗方法大部分采用比濁法，pH測量及平板計數(shù)法，且會選擇幾種指標結(jié)合來評價益生菌的增菌影響，這樣避免了個體差異性及方法的局限性，使得實驗結(jié)果更可靠。在實驗的過程中，不僅會對某種中藥或者浸提液進行單因素評價，通常會選擇幾種添加物進行培養(yǎng)基的優(yōu)化，選擇最佳組合添加物培養(yǎng)基進行篩選培養(yǎng)。

1.2 體內(nèi)研究

益生菌抑菌性研究的體內(nèi)試驗目前研究較少，大多是采用動物實驗或者模擬胃腸道環(huán)境來測量雙歧桿菌對動物膽鹽耐受性，胃腸道菌群等的影響，孫紀錄[21]用菊芋和清水喂養(yǎng)試驗小鼠進行體內(nèi)試驗，于第0（預飼結(jié)束后）、1、2、3、4周，分別無菌采取小鼠糞便（每只0.19左右）．將其盡快加入到已稱重的內(nèi)裝玻璃珠的稀釋管中，再次稱重，計算出小鼠糞便的重量。用旋渦振蕩器打碎糞便，系列稀釋。選擇適宜稀釋度，分別接種在各培養(yǎng)基中，按要求進行培養(yǎng)。于0、1、2、3、4周取小鼠糞便測定雙歧桿菌和大腸桿菌數(shù)量，與對照組比較表明菊芋在體內(nèi)可以促進雙歧桿菌的生長，對大腸桿菌的生長和定植產(chǎn)生不利作用，且雙歧桿菌有明顯的整腸作用。

1.3 厭氧方法

現(xiàn)有的厭氧培養(yǎng)方法有厭氧罐、厭氧袋、厭氧箱和亨蓋特（Hungate）厭氧培養(yǎng)技術等。厭氧罐和厭氧袋的厭氧效果不是很好，厭氧箱設備費用高，亨蓋特厭氧培養(yǎng)技術是一種目前使用較多且較理想的厭氧培養(yǎng)方法。有些實驗室還會根據(jù)實驗條件設計簡單的厭氧環(huán)境，如厭氧產(chǎn)氣袋、還原劑結(jié)合厭氧罐、厭氧袋的使用等，燭缸法。孫力軍[22]等研究了4種香辛料對泡菜發(fā)酵過程中乳酸菌生長的影響，采用燭缸法即將上述試管置于干燥器中，點燃一支蠟燭，用凡士林將干燥器蓋密封，創(chuàng)造厭氧環(huán)境，待火焰熄滅后，置于30℃恒溫培養(yǎng)箱中厭氧培養(yǎng)24 h，在波長480 nm處測定其OD值。結(jié)果發(fā)現(xiàn)大蒜、茴香、辣椒3種香辛料對明串珠菌和植物乳桿菌的生長均有明顯的促進作用，且對明串珠菌的作用強于植物乳桿菌，2%的辣椒和茴香影響最強，效果最佳。

2 存在的問題

我國目前對益生菌的研究大部分停留在對其功能和作用機理的研究，且主要是體外研究，對益生菌增殖研究主要是中藥及一些多糖。近年來報道中藥對益生菌增殖作用的文獻逐漸增加，但大多數(shù)都是將中藥提取物添加到MRS或者其他培養(yǎng)基中，比較其菌數(shù)或者pH的變化，研究具體增菌因子的文獻不多，一般都只根據(jù)中藥的成分對增菌因子進行推測，認為增菌因子是中藥中的多糖、低聚糖、氨基酸核苷酸、肽類或者維生素等，但很少有進一步研究的報道[23]?；蛘呤怯枚嗵谴嬉嫔囵B(yǎng)基中的葡萄糖來比較其菌數(shù)變化等。多從人們?nèi)粘５娘嬍持邪l(fā)現(xiàn)益生菌增殖因子，并且提取其中的具體成分進行分析，得到具體的某種增殖成分，便于從飲食中發(fā)現(xiàn)含有該成分的多種物質(zhì)，避免重復研究。

益生菌生長對營養(yǎng)要求苛刻，尤其是雙歧桿菌，菌種易失活，生產(chǎn)、運輸和保存比較困難，易造成生物活性降低，在腸道內(nèi)繁殖速度較慢。這樣就導致雙歧桿菌制劑及產(chǎn)品的質(zhì)量較差，活菌數(shù)較少或無，在使用時用量較大，增加了成本。因此目前靠補充雙歧桿菌活菌數(shù)來調(diào)節(jié)腸道功能的效果還不太理想。而在我們的研究中發(fā)現(xiàn)有不少食物以及調(diào)味品對雙歧桿菌具有抑制作用，但是目前對飲食影響體內(nèi)雙歧桿菌的研究開展得很少。如果能夠很好地掌握日常食物對自身體內(nèi)益生菌的影響，可以很好地控制飲食，使人體內(nèi)的益生菌數(shù)量保持在健康的范圍內(nèi)，就能很好的達到身體的保健功能，因此研究調(diào)味品等食物對人體益生菌增殖的影響很有意義。除此，還可以延長益生菌制品的貨架期，如添加菌的促生長因子，加含有乳清蛋白的酸奶緩沖液，改善包裝條件都對菌的存活數(shù)量有一定的提高，改變其制劑形式以增強穩(wěn)定性和保存期，采用生物工程技術，對雙歧桿菌菌株進行基因改良，提高菌株的耐氧性和耐酸性，培育出各方面性能都比較優(yōu)良的生產(chǎn)型菌種。

雖然乳酸菌可以提高機體免疫功能，但也有少量資料表明某些種類的乳酸菌對機體有致病性。這可能與乳酸菌的種類、劑量、給與方式及作用機制等方面有關。因此乳酸菌提高機體免疫力等功能和作用機制還有待進一步研究探討。所以不是所有的乳酸菌都可以作為益生菌來發(fā)揮其功效，要在一定的實驗數(shù)據(jù)基礎上進一步確定其作用。因此在研究的過程中不能單一的進行某種菌株的研究，來概括該菌屬的性質(zhì)，要考慮同種添加物對不同菌株，相同菌株不同菌齡，菌株傳代后是否有影響等因素。所有對益生菌的研究需要進一步證實其在分子水平上對人體的作用機制，同時，宿主與益生菌的相互關系也有待進一步闡明，并且所有的研究都具有菌株特異性和個體差異性。

從理論上講，用人類志愿者做體內(nèi)試驗最為恰當。但是由于條件限制，多數(shù)體內(nèi)試驗仍然用實驗動物來代替人類志愿者，并且選擇試驗動物時應考慮到宿主的生理機能、健康狀態(tài)、飲食、年齡等個體差異諸多因素的影響。還要采用不同時期多次測定以觀察指標菌在整個試驗過程中的動態(tài)變化，而不是通常的試驗前后兩次測定作簡單比較。

由于比濁法采用的分光光度計測量范圍有限，考慮到測量的準確性，菌液測量前一般進行稀釋及離心過濾，使其測量值保持在0.3～0.8之間，并且在培養(yǎng)一段時間取菌液時要保持無菌操作，離心過濾時也要無菌，各種環(huán)節(jié)使其在操作過程中感染雜菌的幾率增大，且厭氧條件達不到，使得測量結(jié)果不準確，尤其會影響后期的活菌計數(shù)，通?；罹嫈?shù)前還會進行革蘭氏染色以確定菌種。未解決上述問題，目前有研究自動檢測的儀器可以設定指標進行檢測，獲得所需的數(shù)據(jù)，這樣避免了雜菌感染且使得厭氧環(huán)境得以保持。

3 展望

隨著對人體益生菌研究的不斷深入，益生菌增殖因子的開發(fā)會越來越多，對于益生菌增殖因子的效果檢驗方法也將會克服以上存在的問題，開發(fā)出更科學與方便的方法，促進益生菌增殖因子的開發(fā)。這些將會對人們的健康飲食結(jié)構調(diào)整具有積極的作用，也有助于調(diào)節(jié)胃腸道保健食品及藥品的開發(fā)，為益生菌產(chǎn)品的研究提供更高的平臺，提高人們的生活質(zhì)量。

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Research Advance on the Multiplication Things of Probiotics

LU Qing，LU Hai-bo*，LIU Xiang-rong
（College of Food Science and Engineering，Central South University of Forestry and Technology，National Engineering Laboratory of Rice and By-products Further Process，Changsha 410004，Hunan，China）

Probiotics is intestinal physiological bacteria which is symbiotic relationship with the host and is conducive to the host intestinal physiology of the healthy bacteria.More and more proliferation factors are also deveioped now.So the test methods of proliferative effect are very important.In the present article，the proliferation factors of probiotics such as Bifidobacterium，Lactobacillus and its detection methods are reviewed. These will provide a reference for the development research of proliferation factors and the build of scientific testing methods of the proliferation effect.

probiotics；research advance；measures

10.3969/j.issn.1005-6521.2014.16.033

2013-02-27

魯慶（1988—），女（漢），碩士，研究方向：保健食品的研究與開發(fā)。

*通信作者：魯海波，男（漢），教授，碩士生導師。