檸檬明串珠菌的研究進(jìn)展

韓瑨，劉振民，郭本恒，吳正鈞

（乳業(yè)生物技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，光明乳業(yè)股份有限公司，上海200436）

檸檬明串珠菌的研究進(jìn)展

韓瑨，劉振民，郭本恒，吳正鈞*

（乳業(yè)生物技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，光明乳業(yè)股份有限公司，上海200436）

檸檬明串珠菌（Leuconostoc citreum）是明串珠菌屬的重要成員，可以合成胞外多糖如右旋糖苷、產(chǎn)生具有廣譜抑菌作用的細(xì)菌素等，具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。概述1993～2013年間對(duì)檸檬明串珠菌在代謝產(chǎn)物、分子生物學(xué)以及食品行業(yè)應(yīng)用方面的研究進(jìn)展。

檸檬明串珠菌；胞外多糖；細(xì)菌素；遺傳學(xué)

檸檬明串珠菌（Leuconostoc citreum）是明串珠菌屬（Leuconostoc genus）乳酸菌的一種，為革蘭氏陽(yáng)性菌，G+C含量40.0%（L.citreum NCDO 1837T），其細(xì)菌學(xué)分類(lèi)隸屬于細(xì)菌界（Bacteria）－厚壁菌門(mén)（Firmicutes）－芽孢桿菌綱（Bacilli）－乳桿菌目（Lactobacillales）－乳桿菌科（Lactobacillaceae）－明串珠菌屬（Leuconostoc）。與其它明串珠菌等乳酸菌的親緣關(guān)系見(jiàn)圖1[1]。

自然界中的L.citreum主要存在于綠色植物及其根部[2]，此外，哺乳動(dòng)物乳汁[3]、傳統(tǒng)發(fā)酵品如泡菜[4]和發(fā)酵面團(tuán)[5]等也可作為篩選的重要來(lái)源。

縱覽近二十年來(lái)對(duì)L.citreum的相關(guān)報(bào)道后可以發(fā)現(xiàn)，對(duì)L.citreum研究的深度與廣度在不斷擴(kuò)展，包括菌株的篩選[6-7]、培養(yǎng)基的優(yōu)化[8]、代謝產(chǎn)物的分析[9]、菌株質(zhì)粒的特性[10]及其在食品行業(yè)的應(yīng)用[4]，均表明L. citreum正受到越來(lái)越多的關(guān)注。本文主要從L.citreum的代謝產(chǎn)物、分子生物學(xué)研究及食品行業(yè)應(yīng)用三方面對(duì)國(guó)內(nèi)外的相關(guān)報(bào)道進(jìn)行概述。

圖1 L.citreum與其他乳酸菌的親緣關(guān)系Fig.1 Phylogenetic relationship between L.citreum and other lactic acid bacteria

1 L.citreum的代謝產(chǎn)物

1.1 多糖

右旋糖苷（Dextran，一種由D-葡萄糖以α-1，6糖苷鍵鍵合而成的葡聚糖高分子化合物）是由右旋糖苷蔗糖酶（Dextransucrase，EC 2.4.1.5，DSR）代謝蔗糖產(chǎn)生的一種多糖，目前用于商業(yè)用途的右旋糖苷大多來(lái)自L.mesenteroides，而對(duì)L.citreum多糖的研究報(bào)道相對(duì)較少。Maina NH等以核磁共振技術(shù)分析了L.citreum E497的右旋糖苷結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)該結(jié)構(gòu)除了大部分的α-1，6糖苷鍵之外，還包含了11%α-1，2糖苷鍵和3.5% α-1，3糖苷鍵，屬于Ⅰ型右旋糖苷的特征結(jié)構(gòu)[11]。Son MJ等對(duì)一株篩選自韓國(guó)傳統(tǒng)發(fā)酵蔬菜Dongchimi的L.citreum S5進(jìn)行了產(chǎn)糖條件的優(yōu)化，結(jié)果表明在化學(xué)合成培養(yǎng)基添加1.5%脫脂乳和0.5%馬鈴薯粉可顯著提高菌株的生物量，促進(jìn)蔗糖的轉(zhuǎn)化，增加發(fā)酵液中右旋糖苷的積累量。添加脫脂乳和馬鈴薯的化學(xué)合成培養(yǎng)基經(jīng)L.citreum S5代謝產(chǎn)生的右旋糖苷分子量均為1 100 ku左右，而未添加的發(fā)酵液中多糖分子量則為1 100 ku（70%）、2 000 ku（30%）[12]。2008年，L. citreum HJ-P4因其在低溫（10℃）下優(yōu)良的生長(zhǎng)特性和多糖合成能力從韓國(guó)泡菜Kimchi中被篩選得到。在此溫度下，L.citreum HJ-P4增殖后的菌數(shù)比L. mesenteroides B-512高出2倍以上，并保留了80%的最大DSR合成能力，這種低溫下可快速生長(zhǎng)和產(chǎn)糖的特性為L(zhǎng).citreum HJ-P4參與工業(yè)化生產(chǎn)Kimchi提供了理論依據(jù)[13]。RabeloMC等比較了L.citreum NRRL B-742在化學(xué)合成培養(yǎng)基和蘋(píng)果汁培養(yǎng)基中生長(zhǎng)后獲得的DSR粗酶的穩(wěn)定性，結(jié)果表明在25℃、pH 6.5的條件下，DSR粗酶在后一種培養(yǎng)基中可保持良好的穩(wěn)定性達(dá)48 h[14]。此外，部分報(bào)道涉及L.citreum DSR的異源表達(dá)，如表1所示。

表1 L.citreum DSR異源表達(dá)的報(bào)道Table1 Partial published results of heterologous expression of DSR from L.citreum

菊粉（Inulin，一種主要由果糖以β-2，1糖苷鍵聚合而成的果聚糖）是明串珠菌通過(guò)菊粉蔗糖酶（Inulosucrase，EC 2.4.1.9，ISR）代謝蔗糖產(chǎn)生的另一種多糖，具有降血糖、助消化、改善新陳代謝等益生功能。2002年，Olivaries-Illana V等從墨西哥傳統(tǒng)谷物發(fā)酵飲料Pozol中獲得一株L.citreum CW28，通過(guò)特殊處理，由其細(xì)胞膜上分離得到一種分子量為170 ku的果糖基轉(zhuǎn)移酶（Fructosyltransferase，EC 2.4.1.9，F(xiàn)TF），核磁共振結(jié)果顯示，該酶轉(zhuǎn)化蔗糖形成的多聚物具有與菊粉類(lèi)似的結(jié)構(gòu)，這是首次在Streptococcus mutans以外的微生物中發(fā)現(xiàn)ISR[19]。將該菌株的ISR編碼基因進(jìn)行克隆、表達(dá)于E.coli.，分析后發(fā)現(xiàn)該ISR的結(jié)構(gòu)相當(dāng)特殊：其N(xiāo)-末端與不同微生物來(lái)源的葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶（Glucosyltransferase，GTF）的可變區(qū)相似，催化區(qū)與其他微生物來(lái)源的FTF相近，C末端則與L.mesenteroides NRRLB-1355來(lái)源的交替蔗糖酶（Alternansucrase，EC 2.4.1.140，ASR）與葡聚糖結(jié)合的部位類(lèi)似。截去C末端的ISR基因依然可在E.coli.中成功表達(dá)并合成菊粉，但缺失了熱穩(wěn)定性，這是首次報(bào)道ISR兼有GTF和FTF的結(jié)構(gòu)特征[20]。研究表明，在L.citreum CW28產(chǎn)物中高分子量的菊粉主要由細(xì)胞膜上的ISR合成，而低分子量部分菊粉的合成則與發(fā)酵液中的游離酶有關(guān)。在蔗糖濃度25%的優(yōu)化條件下，L.citreum CW28的ISR對(duì)底物的轉(zhuǎn)化率最高可達(dá)76%[21]。DELMORALS等通過(guò)截除、倒位的方法確定了L.citreum CW 28在進(jìn)化過(guò)程中其FTF獲得的額外區(qū)域的功能，主要與酶的穩(wěn)定性、反應(yīng)動(dòng)力學(xué)和特異性、尤其是水解與轉(zhuǎn)糖基作用的比例有關(guān)[22]。

1.2 乳酸鹽

乳酸鹽（Lactate）是乳酸菌發(fā)酵糖代謝的主要終產(chǎn)物，根據(jù)構(gòu)型不同可分為D-乳酸鹽（D-Lactate）和L-乳酸鹽（L-Lactate），兩者均由其對(duì)應(yīng)的乳酸脫氫酶合成得到。其中L-乳酸脫氫酶（L-Lactate Dehydrogenase，簡(jiǎn)稱(chēng)L-LDH）與細(xì)菌、植物和動(dòng)物有同源關(guān)系，而D-乳酸脫氫酶（D-Lactate Dehydrogenase，簡(jiǎn)稱(chēng)DLDH）的結(jié)構(gòu)與短鏈脂肪酸脫氫酶有一定同源性，值得關(guān)注的是，未成年人或病人過(guò)量攝入D-乳酸鹽會(huì)引起代謝性應(yīng)激反應(yīng)。有報(bào)道指出，朝鮮泡菜Kimchi中L. citreum發(fā)酵產(chǎn)生的乳酸鹽絕大部分屬于D構(gòu)型，L-乳酸鹽相對(duì)較少[23]。為了提高L-乳酸鹽的產(chǎn)量，JINQ等借助穿梭載體pLeuCM將植物乳桿菌的L-LDH克隆并引入L.citreum中，獲得的轉(zhuǎn)化子成功將該基因轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，產(chǎn)物中的L-乳酸鹽的增加與D-乳酸鹽的少使兩種異構(gòu)體的比例發(fā)生變化，但乳酸鹽總量沒(méi)有顯著增加，這是首次以調(diào)節(jié)中央碳通量的方式將代謝工程應(yīng)用于明串珠菌的改造[24]。采用穿梭載體pMBLT02，L.citreum 95成功地過(guò)量表達(dá)了D-LDH，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，補(bǔ)充了14%葡萄糖的培養(yǎng)液經(jīng)轉(zhuǎn)化株發(fā)酵后D-乳酸產(chǎn)量可達(dá)61 g/L，比對(duì)照組的產(chǎn)量高6倍以上[25]。

1.3 細(xì)菌素

細(xì)菌素（Bacteriocin）是產(chǎn)生菌以抑制同源種或近似種的生長(zhǎng)為目的所分泌的肽類(lèi)抗菌物質(zhì)，通常由質(zhì)粒編碼產(chǎn)生，主要通過(guò)吸附并作用于敏感菌細(xì)胞表面的特異受體從而達(dá)到抑菌的目的。目前關(guān)于明串珠菌產(chǎn)細(xì)菌素的報(bào)道，，主要有Mesentericin Y105（L. mesenteroides）、L.gelidum（eucocin A-UAL 187）、L. carnosum（carnosin 44A）、L.paramesenteroides（leuconocin S）等，卻較少涉及的L.citreum產(chǎn)細(xì)菌素功能。Chang JY等篩選得到一株產(chǎn)細(xì)菌素的L.citreum GJ7，這種細(xì)菌素命名為Kimchicin-GJ7，分子量在3 500 u左右，不但熱穩(wěn)定性強(qiáng)、耐酸堿能力佳，而且對(duì)廣譜微生物有拮抗作用。以滅活的細(xì)菌素敏感菌株Lb. plantarum KFRI 464為環(huán)境刺激因素可提高Kinchicin-GJ7的產(chǎn)量。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，Lb.plantarum KFRI464可產(chǎn)生一種使L.citreum GJ7增產(chǎn)細(xì)菌素的誘導(dǎo)因子，以其N(xiāo)末端的一段由16個(gè)氨基酸組成的序列為模板合成的16肽對(duì)Kinchicin-GJ7的誘導(dǎo)效果僅比完整誘導(dǎo)因子的效果低10%左右。這是首次報(bào)道關(guān)于一種細(xì)菌產(chǎn)物影響另一種細(xì)菌的細(xì)菌素產(chǎn)量[26]。在優(yōu)選的發(fā)酵條件下，使用經(jīng)上述誘導(dǎo)方式獲得的細(xì)菌素高產(chǎn)菌株L.citreum GJ7來(lái)發(fā)酵泡菜，可以控制泡菜的后熟程度和菌群組成，同時(shí)延長(zhǎng)商品的貨架期，此項(xiàng)研究為發(fā)酵制品企業(yè)提供了敞開(kāi)式、非無(wú)菌發(fā)酵過(guò)程中控制微生物生長(zhǎng)的理論依據(jù)[27]。研究表明，L.citreum的乳酸發(fā)酵過(guò)程可以顯著延緩3種真菌（Cladosporium sp.YS1，Neurospora sp.YS3，Penicillium crustosum YS2）在米團(tuán)中的增殖，這種抑菌效果比添加0.3%丙酸鈣要好得多，乳酸發(fā)酵時(shí)的副產(chǎn)物如乳酸和乙酸等有機(jī)酸被認(rèn)為是主要抑菌物質(zhì)，因此，L.citreum等乳酸菌在控制米團(tuán)發(fā)酵、延長(zhǎng)年糕保存期等方面有一定優(yōu)勢(shì)[28]。

1.4 其他代謝產(chǎn)物

通過(guò)體外瘤胃發(fā)酵的方法，Baek E等發(fā)現(xiàn)L.citreum TSD-1在發(fā)酵紅絨球和象草時(shí)，pH不斷降低，同時(shí)伴有氨氣和戊酸鹽產(chǎn)量增加的現(xiàn)象[9]。Rodriguez-Alengria ME等對(duì)L.citreum IS的ISR催化區(qū)域IslA4進(jìn)行定位突變，其中突變株S425A喪失了原有產(chǎn)菊粉的能力，只分解蔗糖與合成低聚果糖。在0.67mol/L蔗糖溶液里，低聚果糖轉(zhuǎn)化率可達(dá)65%，進(jìn)一步研究表明，這種果糖基轉(zhuǎn)化過(guò)程符合一級(jí)動(dòng)力學(xué)規(guī)律，因此，S425A表達(dá)的ISR可用于以蔗糖為底物合成低聚果糖[29]。對(duì)大多數(shù)L.citreum而言，甘露醇是其代謝蔗糖的一類(lèi)副產(chǎn)物，然而OtgonbayarGE通過(guò)研究發(fā)現(xiàn)，在優(yōu)化條件下（pH 6.50，30℃），L.citreum 91348P發(fā)酵改良的MRS培養(yǎng)基（葡萄糖∶果糖1∶2）時(shí)合成甘露醇的最大效率為14.38 g/L·h，終產(chǎn)物總獲率達(dá)到86.6%，說(shuō)明該菌株在含果糖食品發(fā)酵方面具有一定應(yīng)用前景[30]。Leathers TD等發(fā)現(xiàn)L.citreum和L.mesenteroides不同菌株之間形成生物膜的能力存在差異巨大，但菌株形成生物膜的能力與菌株所產(chǎn)的多糖類(lèi)型無(wú)關(guān)[31]。人參皂苷是人參重要的功能組分，具有調(diào)節(jié)免疫、降血壓等益生作用，但不易被人體吸收，L.citreum LH1卻可將人參皂苷Rb1轉(zhuǎn)化為易吸收的復(fù)合物K，后者可通過(guò)抑制癌細(xì)胞入侵、阻斷癌細(xì)胞形成的方法來(lái)遏制癌細(xì)胞擴(kuò)散，該轉(zhuǎn)化線路如圖2所示[32]。

圖2 L.citreum LH 1將人參皂苷Rb1轉(zhuǎn)化為復(fù)合物K的線路Fig.2 Bioconversion pathway of ginsenoside Rb1 to compound K by Leuconostoc citreum LH 1

2 L.citreum的分子生物學(xué)研究

2008年，Kim JF等完成了L.citreum KM20的全基因組測(cè)序，發(fā)現(xiàn)了4個(gè)環(huán)狀質(zhì)粒和一些可能與發(fā)酵和益生功能相關(guān)的基因[33]。來(lái)源于法國(guó)小麥發(fā)酵面團(tuán)的三株檸檬明串珠菌（L.citreum LBAEC10，L.citreum LBAEC11 and L.citreum LBAEE16）也在2012年被測(cè)序并構(gòu)建成基因組圖譜[34]。Park J等從L.citreum IH3中分離獲得一種隱秘質(zhì)粒pIH01（1.8 kb），單一的開(kāi)放閱讀框（Opening Reading Frame，ORF）結(jié)構(gòu)表明該質(zhì)粒的復(fù)制模式為滾環(huán)復(fù)制，其產(chǎn)物與L.mesenteroides FR52來(lái)源的質(zhì)粒pFR18所編碼的復(fù)制酶蛋白有較高的相似度（64%），因此，pIH01的衍生質(zhì)?？捎糜趯?duì)明串珠菌進(jìn)行遺傳學(xué)的研究[35]。L.citreum C4的pCC3是另一個(gè)被深入研究的質(zhì)粒，該質(zhì)粒堿基對(duì)長(zhǎng)度達(dá)3338bp兼有3個(gè)ORF，其中ORF3與θ型質(zhì)粒pTXL1有高度同源性，ORF3所在片段含有一個(gè)功能性質(zhì)粒的復(fù)制子。以pCC3為基礎(chǔ)構(gòu)建成的穿梭質(zhì)粒pUCC3E1可在E.coli TG1和克隆宿主菌L.citreum C16及L.citreum GJ7中復(fù)制表達(dá)[36]。由來(lái)源于L.citreum CBNU75的另一種隱秘質(zhì)粒pCB18（1，821 bp，G+C 39.2%）與大腸桿菌質(zhì)粒pEK104構(gòu)建的穿梭載體pLeuCM，可通過(guò)滾環(huán)復(fù)制的方式，完成在E.coli.和L.citreum中的復(fù)制，而且遺傳性相當(dāng)穩(wěn)定。實(shí)驗(yàn)表明，克隆了植物乳桿菌β-半乳糖苷酶編碼基因的pLeuCM可以在L.citreum中成功表達(dá)，同時(shí)，pLeuCM在L.citreum，L.mesenteroides，Lb.plantarum，Lb.reuteri，Lc.lactis，Streptococcus thermophilus，Weissella confusa和Oenococcus oeni中均可被復(fù)制。因此，質(zhì)粒pLeuCM可以成為多種乳酸菌之間進(jìn)行基因傳遞的有效工具[10]。

上述研究大多針對(duì)L.citreum的特定質(zhì)粒，在L. citreum相關(guān)的分子生物學(xué)報(bào)道中，還有一部分是將L. citreum作為外源基因表達(dá)的宿主菌的研究。Park JY等以穿梭載體為手段，將L.mesenteroides SY1的α-半乳糖苷酶編碼基因引入L.citreum KCTC3526，該基因在宿主菌中獲得成功表達(dá)[37]。Eom HJ等通過(guò)同樣的方法完成了α-淀粉酶在L.citreum中的異源表達(dá)[38]。

3 L.citreum在食品行業(yè)的應(yīng)用

Choi IK等利用L.citreum的高產(chǎn)酸能力，在泡菜制作工藝中人為添加L.citreum IH22來(lái)加快發(fā)酵過(guò)程中pH的下降速率，以此法制成的泡菜比未添加L.citreum IH22制成泡菜保持期更長(zhǎng)[39]。L.citreum的這種高產(chǎn)酸能力同樣被運(yùn)用于北京豆汁的生產(chǎn)工藝中，北京豆汁中主要產(chǎn)酸微生物為乳酸乳球菌（Lactococcus lactis）和檸檬明串珠菌（Leuconostoc citreum），且分別占72%與26%，乳酸菌發(fā)酵導(dǎo)致可溶性蛋白及可溶性糖含量下降，游離氨基酸含量迅速累積，綠豆內(nèi)源蛋白酶與淀粉酶活性下降，微生物蛋白酶活性增強(qiáng)[40]。Delgerzaya P等嘗試用L.citreum HJ-P4發(fā)酵麥芽汁來(lái)探索一種新型益生菌飲料，發(fā)現(xiàn)發(fā)酵液中功能性代謝產(chǎn)物（有機(jī)酸、功能性糖等）的濃度及其風(fēng)味主要受到麥芽烘焙條件和發(fā)酵條件的影響[41]。經(jīng)實(shí)踐證明，含糖14.08%、檸檬香精0.98%的麥芽汁經(jīng)S.cerevisiae和L.citreum HJ-P4相繼發(fā)酵后的產(chǎn)物最受消費(fèi)者歡迎，此項(xiàng)研究為L(zhǎng).citreum在功能性飲品發(fā)酵制備方面的應(yīng)用提供了理論依據(jù)[42]。ChoiH等在酵母面包制作過(guò)程中添加了L.citreum HO12參與發(fā)酵的面團(tuán)，此法顯著延緩了真菌、芽孢桿菌等腐敗菌在面包產(chǎn)品中的生長(zhǎng)，這是利用了L.citreum產(chǎn)細(xì)菌素的特性[4]，這種特性使L.citreum被廣泛地應(yīng)用于延長(zhǎng)產(chǎn)品貨架期等方面[27-28]。

4 展望

明串珠菌最初被發(fā)現(xiàn)于20世紀(jì)40、50年代，對(duì)明串珠菌的研究工作僅限于培養(yǎng)條件分析等技術(shù)層面，直到20世紀(jì)末，尤其是近年來(lái)，有關(guān)明串珠菌的研究才慢慢開(kāi)始升溫，包括了L.citreum培養(yǎng)基的優(yōu)化[8]、生長(zhǎng)保存的特性[43-45]、致病性[46-48]、調(diào)節(jié)免疫[49]、功能性酶的發(fā)現(xiàn)[50]、與L.mesenteroides的分子差異[51]和產(chǎn)糖差異[5]等方面，這些研究提高并深化了對(duì)L.citreum的認(rèn)識(shí)。

盡管L.citreum代謝產(chǎn)物豐富（有機(jī)酸、多糖、細(xì)菌素等），作為研究對(duì)象，具有廣泛用途（質(zhì)粒供體、宿主菌等），但與明串珠菌其它菌株或其它乳酸菌相比，其應(yīng)用特性往往不夠突出。例如，L.citreum的產(chǎn)糖能力普遍低于L.mesenteroides，商業(yè)用途的多糖合成菌株基本采用L.mesenteroides，因此，目前對(duì)L.citreum的研究依然處于技術(shù)層面。

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Progress in Study on Leuconostoc citreum

HAN Jin，LIU Zhen-min，GUO Ben-heng，WU Zheng-jun*
（State Key Laboratory of Dairy Biotechnology，Bright Dairy&Foods Co.，Ltd.，Shanghai 200436，China）

Leuconostoc citreum is an important member of Leuconostoc genus with application potential i.e. production of polysaccharides including dextrans，and bacteriocins with antagonistic activity against a broad spectrum of microorganisms.In this article，the research progress in metabolites，genetics as well as present and potential application in fermented food of Leuconostoc citreum in update was reviewed.

Leuconostoc citreum；exopolysaccharide；bacteriocin；genetics

10.3969/j.issn.1005-6521.2014.16.032

2013-05-13

“十二五”國(guó)家科技支撐計(jì)劃課題：發(fā)酵乳制品乳酸菌菌種與發(fā)酵劑的研究與開(kāi)發(fā)（2013BAD18B01）；“十二五”國(guó)家863項(xiàng)目：優(yōu)良益生菌高效篩選與應(yīng)用關(guān)鍵技術(shù)（2011AA100901）

韓瑨（1980—），男（漢），工程師，碩士，研究方向：乳品科學(xué)專(zhuān)業(yè)。

*通信作者