SH2?Bβ抗體治療肥胖哮喘模型小鼠肥胖和哮喘的機(jī)制研究

金韻，李新鳴，齊金萍，賈志紅

（沈陽醫(yī)學(xué)院1.解剖學(xué)教研室；2.微生物學(xué)教研室；3.2012級(jí)臨床醫(yī)學(xué)，沈陽110034）

SH2?Bβ抗體治療肥胖哮喘模型小鼠肥胖和哮喘的機(jī)制研究

金韻1，李新鳴2，齊金萍1，賈志紅3

（沈陽醫(yī)學(xué)院1.解剖學(xué)教研室；2.微生物學(xué)教研室；3.2012級(jí)臨床醫(yī)學(xué)，沈陽110034）

目的探討SH2-Bβ抗體對肥胖哮喘模型小鼠的治療作用。方法采用8周C57BL/6小鼠（36只），隨機(jī)分為正常組（標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng)）、肥胖哮喘組（高脂飼料喂養(yǎng)）和SH2-Bβ抗體干預(yù)組。測量各組小鼠體質(zhì)量；應(yīng)用免疫組織化學(xué)方法檢測SH2-Bβ在各組小鼠肺內(nèi)及下丘腦的表達(dá)；應(yīng)用小鼠肺功能儀檢測各組小鼠氣道阻力變化。結(jié)果肥胖哮喘組體質(zhì)量明顯高于正常組和SH2-Bβ抗體干預(yù)組（P＜0.05）；免疫組織化學(xué)染色顯示，在下丘腦，SH2-Bβ在肥胖哮喘組小鼠表達(dá)降低，明顯低于SH2-Bβ抗體干預(yù)組和正常組（P＜0.05）。在肺內(nèi)，SH2-Bβ在肥胖哮喘組小鼠表達(dá)增高，明顯高于SH2-Bβ抗體干預(yù)組和正常組（P＜0.05）；肥胖哮喘組小鼠的氣道阻力明顯高于SH2-Bβ抗體干預(yù)組和正常組（P＜0.05）。結(jié)論SH2-Bβ抗體可使肥胖哮喘模型小鼠下丘腦內(nèi)SH2-Bβ表達(dá)上調(diào)，同時(shí)使肺內(nèi)SH2-Bβ表達(dá)下調(diào)，降低體質(zhì)量，降低肺內(nèi)活化炎性細(xì)胞數(shù)量，進(jìn)而降低氣道阻力，使肥胖哮喘得到緩解。

SH2-Bβ；肥胖；哮喘；小鼠

長期以來，研究人員一直認(rèn)為超重與哮喘之間存在某種聯(lián)系。但這種關(guān)系的機(jī)制還不清楚。最近的研究表明肥胖與兒童哮喘的癥狀相關(guān)，控制體質(zhì)量將有利于哮喘兒童［1］。SH2-Bβ是下丘腦內(nèi)重要的能量代謝和糖代謝的正向調(diào)節(jié)者［2］。高脂飲食可使下丘腦內(nèi)SH2-Bβ表達(dá)下調(diào)，從而導(dǎo)致肥胖；肺內(nèi)氣道上皮和炎性細(xì)胞SH2-Bβ過表達(dá)使氣道阻力增加［3］。因此，下丘腦和肺的SH2-Bβ可能是肥胖哮喘發(fā)病的重要基礎(chǔ)。調(diào)節(jié)下丘腦和肺的SH2-Bβ表達(dá)將成為肥胖哮喘患者新的有效治療方法。我們以前的研究發(fā)現(xiàn)SH2-Bβ抗體可減輕哮喘小鼠氣道炎癥和氣道高反應(yīng)性［4］，既然SH2-Bβ與體質(zhì)量的調(diào)控相關(guān)，SH2-Bβ抗體是否會(huì)緩解肥胖哮喘呢？本研究經(jīng)鼻應(yīng)用SH2-Bβ抗體，觀察肥胖哮喘模型小鼠體質(zhì)量以及SH2-Bβ在肺內(nèi)及下丘腦表達(dá)變化，同時(shí)檢測氣道阻力，探討SH2-Bβ在肥胖哮喘中的作用機(jī)制以及SH2-Bβ抗體的治療作用。

1 材料與方法

1.1 材料和儀器

SH2-Bβ羊多克隆IgG抗體（Santa Cruz，sc-10827），SABC試劑盒、DAB（中國武漢博士德生物公司）。電子天平（BS110S，德國Startorius公司），內(nèi)切式電動(dòng)組織勻漿器（瑞士Kinematica公司），超聲霧化器（JWC-201D型，北京超聲儀器廠），紫外分光光度計(jì)（DU70型，美國Beckman公司），電泳轉(zhuǎn)印儀（美國Bio-Rad公司）。其余為國產(chǎn)分析純。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及飼料配制

選用健康、雌性、出生8周的c57BL/6小鼠，體質(zhì)量21 g左右。普通飼料：玉米粉30%，豆餅21.0%，麩皮10.0%，次粉28.0%，魚粉9.0%，酵母粉1.0%，魚肝油1%（g/100 g）等。高脂飼料：豬油12.0%，奶粉8.0%，雞蛋10.0%，花生5.0%，麻油3.0%，以普通飼料補(bǔ)足100 g混成含12%豬油的高脂飼料，食用前2 d配好，低溫保存。

1.3 動(dòng)物分組

將36只c57BL/6小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，按體質(zhì)量隨機(jī)均分為3組：對照組（12只）、肥胖哮喘組（12只）、SH2-Bβ抗體干預(yù)組（12只），對照組喂普通飼料，肥胖哮喘組和SH2-Bβ抗體干預(yù)組喂高脂飼料。自由飲食水，共飼養(yǎng)8周。每周稱體質(zhì)量1次，以體質(zhì)量超過對照組體質(zhì)量2 g作為肥胖標(biāo)準(zhǔn)。

1.4 肥胖哮喘小鼠模型制備及抗體干預(yù)處理

4周高脂飼料喂養(yǎng)后，（1）肥胖哮喘組：第1天每只小鼠腹腔注射20 μg卵蛋白和2 mg氫氧化鋁（混合于0.5 mL PBS中）。第8天和第14天每只小鼠腹腔注射10 μg卵蛋白和1 mg氫氧化鋁（混合于0.5 mL PBS中）。26～30 d將小鼠置于封閉容器中，給予5%卵蛋白（PBS配成）霧化吸入激發(fā)哮喘發(fā)作（1次/d），每次25 min；（2）SH2-Bβ抗體干預(yù)組：操作同肥胖哮喘組，每次霧化吸入5%卵蛋白溶液前3 h經(jīng)鼻腔滴入SH2-Bβ抗體（1∶50稀釋液25 μL）。各組隨機(jī)選出6只小鼠于最后1次激發(fā)后測氣道阻力，其余最后1次激發(fā)后24 h處死。（3）對照組：以PBS代替卵蛋白注射和霧化吸入，鼻腔滴入與抗體等量生理鹽水。

1.5 氣道阻力的測定

實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，自由飲水，禁食12 h后各組隨機(jī)取6只小鼠，以1%戊巴比妥鈉（40 mg·kg-1）腹腔麻醉，16 G氣管插管，用AniRes 2003動(dòng)物肺功能分析系統(tǒng)（貝蘭博科技有限公司）測定氣道阻力。呼吸頻率為1.67 breaths·S-1，潮氣量為0.2 mL，正壓氣壓為0.02～0.04 kPa。經(jīng)頸靜脈濃度梯度增加應(yīng)用甲乙酰膽堿（methacholine，MCh）（0～0.2 μg·g-1）激發(fā)氣道阻力。待曲線平穩(wěn)后進(jìn)行下次給藥。

1.6 免疫組織化學(xué)反應(yīng)（SABC法）檢測SH2-Bβ表達(dá)

各組取6只小鼠用1%戊巴比妥鈉腹腔麻醉（40 mg·kg-1），用0.1 mol·L-1PBS配制的含有多聚甲醛（40 g·L-1）灌流液灌流固定后取下丘腦和肺，后固定24 h后移入0.87 mol·L-1的蔗糖緩沖液中至標(biāo)本沉降。OCT包埋，恒冷箱連續(xù)切片（厚14 μm），冷風(fēng)干燥后進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色（SABC法）。一抗SH2-Bβ工作濃度為1∶150，DAB顯色。經(jīng)SH2-Bβ免疫組織化學(xué)染色切片，每塊組織隨機(jī)取3～4張切片，且各組所選部位相同，每張切片平均選取4個(gè)視野，使用Metamoph圖像分析系統(tǒng)，進(jìn)行光密度測定。測量值與相應(yīng)陰性對照切片測量值相減后的平均值為各區(qū)域最終平均光密度值。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)體質(zhì)量比較

肥胖哮喘組實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)平均體質(zhì)量和體質(zhì)量變化均值明顯高于SH2-Bβ抗體干預(yù)組和正常組（P＜0.05），見表1。

表1 各組小鼠實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)體質(zhì)量比較結(jié)果Tab.1 Comparison of the weight among three groups

表1 各組小鼠實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)體質(zhì)量比較結(jié)果Tab.1 Comparison of the weight among three groups

1）P＜0.01 vs groups NS and OB+AS.NS，normal control；OB+AS，obese+asthma.

2.2 各組小鼠SH2-Bβ在下丘腦的表達(dá)

對照組小鼠下丘腦多數(shù)細(xì)胞呈SH2-Bβ陽性（圖1A），肥胖哮喘組SH2-Bβ陽性細(xì)胞數(shù)明顯減少（圖1B）。肥胖哮喘組小鼠下丘腦內(nèi)SH2-Bβ免疫陽性產(chǎn)物平均光密度值為0.212±0.019，明顯低于對照組（0.685±0.011）和SH2-Bβ抗體干預(yù)組（0.512±0.021，P＜0.05；圖1C）。

圖1 免疫組織化學(xué)染色各組小鼠下丘腦SH2?Bβ表達(dá)的比較SABC法×400Fig.1 Comparison of SH2?Bβ expression in hypothalamus of different groups by immunohistochemistry staining SABC×400

2.3 SH2-Bβ在肺組織的表達(dá)

對照組小鼠肺組織支氣管上皮有少數(shù)細(xì)胞呈SH2-Bβ陽性，炎性細(xì)胞數(shù)量少，含少量SH2-Bβ陽性物質(zhì)（圖2A）。肥胖哮喘小鼠肺組織細(xì)支氣管、肺泡上皮細(xì)胞和較多炎性細(xì)胞呈SH2-Bβ強(qiáng)陽性（圖2B）?？贵w干預(yù)組與肥胖哮喘組比較肺組織細(xì)支氣管、肺泡上皮細(xì)胞SH2-Bβ陽性物質(zhì)減少，炎性細(xì)胞數(shù)減少且SH2-Bβ免疫陽性產(chǎn)物減少（圖2C）。肥胖哮喘小鼠肺內(nèi)SH2-Bβ免疫陽性產(chǎn)物平均光密度值為0.742±0.015，明顯高于對照組（0.207±0.019）和抗體干預(yù)組（0.312±0.022）（P＜0.05）。

圖2 免疫組織化學(xué)染色各組小鼠肺SH2?Bβ表達(dá)的比較SABC法×400Fig.2 Comparison of SH2?Bβ expression in lung of different groups by immunohistochemistry staining SABC×400

2.4 各組小鼠氣道阻力變化

肥胖哮喘組氣道阻力較正常組和抗體干預(yù)組明顯升高（P＜0.05）。見圖3。

圖3 anti?SH2?Bβ對甲乙酰膽堿激發(fā)的氣道阻力的影響Fig.3 Effect of anti?SH2?Bβon airway resistance in response to methacholine challenges

3 討論

SH2-Bβ是細(xì)胞內(nèi)一種連接物蛋白。Ren等［5］通過對小鼠的實(shí)驗(yàn)表明，SH2-Bβ是瘦素敏感性、能量平衡和體質(zhì)量的重要調(diào)節(jié)者。Duan等［6］的研究也表明SH2-Bβ是瘦素及其他多種細(xì)胞因子發(fā)揮作用的重要調(diào)節(jié)者。擾亂SH2-Bβ基因可能導(dǎo)致嚴(yán)重瘦素抵抗、食欲過盛、肥胖和肥胖相關(guān)的代謝綜合征。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：肥胖哮喘小鼠下丘腦內(nèi)SH2-Bβ的表達(dá)下降，而肺內(nèi)SH2-Bβ過表達(dá)，經(jīng)鼻應(yīng)用SH2-Bβ抗體，下丘腦內(nèi)SH2-Bβ的表達(dá)上調(diào)，肺內(nèi)SH2-Bβ的表達(dá)下調(diào)，使肥胖哮喘小鼠體質(zhì)量減輕，同時(shí)肺內(nèi)炎性細(xì)胞數(shù)量減少，氣道阻力降低。

研究表明，通過調(diào)節(jié)飲食、運(yùn)動(dòng)和藥物治療降低體質(zhì)量，可以改善支氣管哮喘兒童的系統(tǒng)性炎癥［7］。而Jensen等［8］的研究則認(rèn)為，降低體質(zhì)量只能改變肺功能，減輕哮喘癥狀，不改變支氣管哮喘患者的炎癥和氣道高反應(yīng)性。本研究經(jīng)鼻腔應(yīng)用SH2-Bβ抗體，一方面使肥胖哮喘模型小鼠體質(zhì)量降低，另一方面減少了肺內(nèi)炎性細(xì)胞數(shù)量，進(jìn)而減少炎性介質(zhì)的釋放，相當(dāng)于從抗炎和降低體質(zhì)量雙方面使肥胖哮喘得到緩解，既有機(jī)械通氣的改善，又有肺內(nèi)炎癥和氣道反應(yīng)性的改善。目前對肥胖哮喘的研究常會(huì)得出不同結(jié)論，主要由于干預(yù)措施的不同，比如單純降低體質(zhì)量，降低體質(zhì)量同時(shí)抗炎，抗氧化應(yīng)激［7，9，10］。葉澤慧等［10］認(rèn)為肥胖能增加甲乙酰膽堿的敏感性，并限制吸入性糖皮質(zhì)激素對哮喘的治療。本研究也發(fā)現(xiàn)肥胖哮喘小鼠在甲乙酰膽堿刺激下的氣道阻力明顯增加。Ren等［2］的研究表明，敲除腦內(nèi)SH2-Bβ基因，小鼠出現(xiàn)食量劇增，并導(dǎo)致肥胖。本研究經(jīng)鼻腔應(yīng)用SH2-Bβ抗體，引起了下丘腦內(nèi)SH2-Bβ表達(dá)上調(diào)，并降低體質(zhì)量，這說明SH2-Bβ抗體可能經(jīng)嗅細(xì)胞直接吸收入腦或經(jīng)其他途徑到腦內(nèi)發(fā)揮作用。鼻腔給藥的應(yīng)用被認(rèn)為存在巨大的潛在應(yīng)用價(jià)值，它使得通過口服或靜脈給藥不能通過血腦屏障的藥物得以進(jìn)入腦內(nèi)發(fā)揮作用［11，12］。洪佳璇等［13］關(guān)于肥胖兒童與哮喘病的相關(guān)性研究表明，哮喘肥胖兒嗜酸性細(xì)胞數(shù)明顯增高；其肺功能明顯降低。而且肥胖能增加嗜酸細(xì)胞活性［14］，肥胖者血中嗜酸細(xì)胞細(xì)胞數(shù)量和活性變化造成肺功能損傷［15］。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，肥胖哮喘小鼠肺內(nèi)高表達(dá)SH2-Bβ的細(xì)胞，大多為嗜酸性粒細(xì)胞，經(jīng)鼻腔應(yīng)用SH2-Bβ抗體，使肺內(nèi)炎性細(xì)胞減少及SH2-B β的表達(dá)下調(diào)，同時(shí)氣道阻力下降，說明肺內(nèi)炎性細(xì)胞減少及SH2-Bβ的表達(dá)下調(diào)使得哮喘狀態(tài)下過強(qiáng)的嗜酸性粒細(xì)胞免疫反應(yīng)受到抑制。

綜上所述，經(jīng)鼻應(yīng)用SH2-Bβ抗體，通過改變下丘腦神經(jīng)元的SH2-Bβ表達(dá)，使體質(zhì)量減輕，免疫受到抑制。這一生長和免疫抑制作用可能通過神經(jīng)—內(nèi)分泌—免疫網(wǎng)絡(luò)得以實(shí)現(xiàn)，也不排除SH2-Bβ抗體對中樞和周圍組織的不同作用。具體的作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

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（編輯 武玉欣）

Mechanism Study ofSH2-BβAntibody for Treating Obese and Asthma in Mice Model

JINYun1，LIXin-ming2，QIJin-ping1，JIA Zhi-hong3
（1.DepartmentofAnatomy，Shenyang MedicalCollege，Shenyang 110034，China；2.DepartmentofMicrobiology，Shenyang MedicalCollege，Shenyang 110034，China；3.2012 Clinic Medicine，Shenyang MedicalCollege，Shenyang 110034，China）

ObjectiveTo explore the therapy effectsofSH2-Bβantibody in the obese asthma mice.MethodsTotally 36 C57BL/6 mice（female）aged 8 weeks were used throughout the study.Mice were randomized to 3 groups，including a standard rodent chow（NS，n=12），a high fat diet chow obese asthma group（OB+AS，n=12）and the anti-SH2-Bβ intervene group.The weight was measured，and the SH2-Bβ expression in hypothalamus and lung was determined by immunohistorical staining.The changes of the airway resistance were evaluated by AniRes 2003 animal lungs function analysis system.ResultsThe weightofOB+AS group was higherthan thatofNCgroup and anti-SH2-Bβintervene group（P＜0.05）.Immunohistochemistry staining demonstrated that SH2-Bβ expression in hypothalamus of OB+AS group were decreased compared with those of NC group and anti-SH2-Bβ intervene group（P＜0.05）.SH2-Bβ expression in lung of OB+AS group were increased compared with those of NC group and anti-SH2-Bβ intervene group（P＜0.05）.Airway resistance to methacholine（MCh）was significantly increased in OB+AS group compared with anti-SH2-Bβintervene group（P＜0.05）.ConclusionSH2-Bβantibody upregulated the SH2-Bβexpression in hypothalamus，butdownregulate its expression in lung.The obese asthma may be remitted through the decreased weight，number of the activated inflammatory cells and also airway resistance.

SH2-Bβ；obesity；asthma；mice

R392.5；R562.2+5

A

0258-4646（2014）06-0508-04

金韻（1963-），女，副教授，本科.

齊金萍，E-mail：qijinping2013@163.com

2014-02-19

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