NF?кBp65和H IF?1α在腎透明細胞癌中的表達及意義

那磊，吳斌

（中國醫(yī)科大學附屬盛京醫(yī)院泌尿外科，沈陽 110004）

腎癌是泌尿系統(tǒng)腫瘤中常見的惡性腫瘤，透明細胞癌由腎小管上皮發(fā)生，是主要的病理類型。腫瘤細胞胞質(zhì)內(nèi)含大量膽固醇，在切片過程中溶解，故胞質(zhì)在鏡下呈透明狀。腎透明細胞癌的治療主要為手術治療，對放化療不敏感。其發(fā)病機制受多種因素影響，目前尚未完全了解。核因子kappa B（nuclear factor kappa B，NF?κB）是一種多向性、多功能的核轉錄因子，可調(diào)控細胞凋亡、增殖的相關基因，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用［1～3］。在結腸癌、胃癌及乳腺癌等多種腫瘤中存在NF?кB信號通路的異常激活，引起活化的NF?κB發(fā)生核異位，從而促進下游靶基因轉錄活性增加，導致某些細胞因子或炎性因子轉錄活性增強，進一步促進腫瘤的發(fā)生、增殖、侵襲和轉移。缺氧誘導因子1α（hypox?ia inducible factor 1 alpha，HIF?1α）是廣泛存在于哺乳動物和人體細胞的另一類核轉錄因子，研究證實HIF?1α僅在人體許多腫瘤中大量表達，與腫瘤的生長繁殖、侵襲和轉移、新生血管生成、凋亡、耐藥等特征都密切相關。腫瘤細胞中普遍存在缺氧狀態(tài)，在缺氧狀態(tài)下，HIF?1ɑ誘導生成大量新生血管、增強糖酵解、增強細胞增殖因子及轉移相關基因表達，是腫瘤低氧惡性演進的重要分子機制［4～6］。本實驗通過免疫組織化學SP法探討NF?κB p65及HIF?1α與腎透明細胞癌的關系，為腎透明細胞癌的發(fā)病機制及靶向基因治療提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

選取我院2007年至2010年通過根治性腎切除和腎部分切除腎腫瘤標本38例，均經(jīng)術后病理證實為腎透明細胞癌?；颊吣挲g20～80歲，男24例，女14例。根據(jù)2002年美國癌癥聯(lián)合委員會（AJCC）腎癌分期組合標準，Ⅰ期18例，Ⅱ期4例，Ⅲ期9例，Ⅳ期7例。根據(jù)Fuhrman病理分級標準，Ⅰ級8例，Ⅱ級22例，Ⅲ級5例，Ⅳ級3例。同時，隨機從38例標本中選取11例距腫瘤較遠的正常腎組織作為對照。所有組織均經(jīng)病理證實，術前均未行放療、化療。

1.2 方法

1.2.1 免疫組化染色：石蠟切片常規(guī)二甲苯脫蠟后，高壓修復抗原，實驗步驟按NF?κB p65和HIF?1α試劑盒說明書進行，封片鏡檢。以已知的陽性片作為陽性對照，PBS代替一抗作為陰性對照。NF?κB p65和HIF?1α蛋白陽性表達呈棕黃色顆粒位于細胞核或細胞質(zhì)。

1.2.2 結果判斷：NF?кB P65以胞核或胞質(zhì)中出現(xiàn)棕黃色顆粒作為陽性，參照Malik等［7］的方法，在高倍（×400）光鏡下對陽性細胞進行評分。隨機選擇5個視野，總共計數(shù)200個細胞。沒有細胞著色為0分，≤20%細胞著色為1分，21%～50%細胞著色為2分，＆gt;50%細胞著色為3分。陽性染色強度按以下標準區(qū)分：沒有著色為0分；微弱棕黃色為1分；細胞核或細胞質(zhì)中等強度棕黃色為2分；陽性細胞核或細胞質(zhì)呈深棕色為3分。最后，將上述兩種評分相乘之積作為評判標準，分數(shù)為0～2分者作為陰性，3分或以上作為陽性表達。HIF?1ɑ按照Zhong等［8］的方法，在高倍（×400）光鏡下對陽性細胞進行評分。隨機選擇5個視野，每個視野200個細胞。沒有細胞著色為0分，≤25%細胞著色為1分，25%～50%細胞著色為2分，＆gt;50%細胞著色為3分。陽性染色強度按以下標準區(qū)分：不染色為0分；輕度染色為1分；中度染色為2分；強染色為3分。最后，將上述兩種評分之和作為評判標準，分數(shù)為0～3分者為陰性，4分或以上為陽性表達。

1.3 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件，率的比較采用Fisher精確概率檢驗，相關性分析采用Spearman相關分析，以P＆lt;0.05為有統(tǒng)計學差異。

2 結果

2.1 NF?κB p65與HIF?1α在腎透明細胞癌標本中的表達

NF?κB p65、HIF?1α染色陽性的標本中，陽性染色大部分集中在胞質(zhì)中，偶見胞核染色，呈淺黃至深棕色顆粒狀（圖1）。

2.2 NF?κB p65與HIF?1α的陽性表達相關性及與腎透明細胞癌的臨床病理特征關系

圖1 NF?κB和H IF?1α的腎透明細胞癌免疫組織化學染色Fig.1 Immunohistochemical staining of NF?κB and HIF?1α

在11例正常腎組織中，NF?κB p65陽性表達率為 36.36%（4/11），HIF?1α陽性表達率為 18.18%（2/11）；在38例腎透明細胞癌組織中，NF?κB p65陽性表達率為73.68%（28/38），HIF?1α陽性表達率為63.16%（24/38）。2者在正常腎組織和腎透明細胞癌組織的陽性表達率均有統(tǒng)計學差異（P＆lt;0.05）。臨床分期早期腎癌組織的NF?κB p65的陽性表達率低于晚期腎癌組織，差異有統(tǒng)計學意義（P＆lt;0.05）。腫瘤直徑＆lt;5 cm的腎癌組織的HIF?1α的陽性表達率低于腫瘤直徑≥5 cm的腎癌組織，差異有統(tǒng)計學意義（P＆lt;0.05）。見表1。

NF?κB p65 與HIF?1α在腎透明細胞癌組織中的表達不相關（r=0.088，P=0.549）。

表1 NF?кB P65與H IF?lɑ的表達與腎透明細胞癌的臨床病理特征關系Tab.1 Correlation between NF?κB and HIF?1αin renal clear cell carcinoma

3 討論

NF?κB是一種調(diào)節(jié)炎性和細胞增殖的重要核轉錄因子，參與多種疾病和腫瘤的細胞因子、生長因子、細胞黏附因子等的基因調(diào)控［10］。在人類腫瘤細胞中，許多情況可以影響NF?κB的表達和活化，進而導致促進細胞轉化的關鍵靶基因轉錄增強，促進腫瘤的發(fā)生發(fā)展［11］。國內(nèi)外的相關文獻報道NF?κB因子的持續(xù)活化可作為乳腺癌、卵巢腫瘤、結腸癌、胰腺癌、甲狀腺癌、膽道腫瘤和前列腺腫瘤等實體腫瘤的標志，但尚無明確報道證實NF?κB在腎透明細胞癌組織中是否存在高表達。本研究顯示，73.68%的腎透明細胞癌組織中有NF?κB p65的陽性表達，與正常腎組織的陽性表達比較差異有統(tǒng)計學意義（P＆lt;0.05）。臨床分期晚的腎癌組織的陽性表達率高于臨床分期早的腎癌組織，差異有統(tǒng)計學意義（P＆lt;0.05），提示NF?κB p65的高表達可以作為腎透明細胞癌的標志物與正常腎組織區(qū)別，而且其在腎透明細胞癌組織中的高表達可能與腫瘤的發(fā)展及預后有關。

HIF?1α是在缺氧條件下廣泛存在于哺乳動物和人體內(nèi)一種轉錄因子，它調(diào)節(jié)多種缺氧相關的靶基因的表達，使機體適應缺氧環(huán)境。在人類腫瘤細胞中，由于腫瘤細胞的快速生長，缺氧條件廣泛存在。HIF?1α的過表達促進了腫瘤組織的血管生成，進而提高對缺氧環(huán)境的適應性［12］。國內(nèi)外的相關文獻報道［8，13～15］在結腸癌、肺癌、乳腺癌、胃癌、腎癌等十余種人類腫瘤組織中存在HIF?1α的高表達。本研究顯示，63.16%的腎透明細胞癌組織中有HIF?1α的陽性表達，與正常腎組織比較有統(tǒng)計學差異（P＆lt;0.05），提示HIF?1α可以作為腎透明細胞癌的標志物與正常腎組織區(qū)別。以腫瘤大小分組，得到直徑大（≥5 cm）的腫瘤組織HIF?1α的陽性表達明顯高于直徑?。ǎt;5 cm）的腫瘤（P＆lt;0.05），考慮可能在大腫瘤的內(nèi)部細胞缺氧更加明顯，HIF?1α表達更加充分，在一定程度上可以用作預測腎透明細胞癌的進展程度。

對NF?κB p65與HIF?1α在腎透明細胞癌組織中的表達相關性分析顯示2者無相關性（P＆gt;0.05），故尚不能認為2者對于腎透明細胞癌的發(fā)生存在共同的表達調(diào)控機制。但有文獻報道［15］NF?κB p65為HIF?1α的上游基因并對其表達及維持活性起著重要作用，存在一定相關性。

NF?κB p65與HIF?1α在人類腫瘤細胞中調(diào)控的確切機制尚不十分清楚，隨著NF?κB p65與HIF?1α深入研究和一些新藥臨床試驗的開展應用，相信它們能成為治療腎透明細胞癌的新靶點。

［1］Calzado MA，Bacher S，Schmitz ML，et al.NF?kappa B inhibitors for the treatment of inflammatory diseases and cancer［J］.Curr Med Chem，2007，14（3）：367-376.

［2］TerzicˊJ，Grivennikov S，Karin E，et al.Inflammation and colon can?cer［J］.Gastroenterology，2010，138（6）：2101-2114.

［3］Karin M.NF?kB as a critical link between inflammation and cancer［J］.Cold Spring Harb Perspect Biol，2009，1：a000141.

［4］Zhao X，Gao S，Ren H，et al.HIF?1 promotes pancreatic ductal ade?nocarcinoma invasion and metastasis by activating transcription of the actin?bundling protein fascin［J］.Cancer Res，2014，PMID：24599125

［5］Snell CE，Turley H，McIntyre A，et al.Proline?hydroxylated hypoxia?inducible factor 1α（HIF?1α）upregulation in human tumours［J］.PLoS One，2014，9（2）：e88955.

［6］White NM，Masui O，Newsted D，et al.Galectin?1 has potential prog?nostic significance and is implicated in clear cell renal cell carcino?ma progression through the HIF/mTOR signaling axis［J］.Br J Can?cer，2014，110（5）：1250-1259.

［7］Malik SN，Brattain M，Ghosh PM，et al.Immunohistochemical dem?onstration of phospho?Akt in high gleason grade prostate cancer［J］.Clin Cancer Res，2002，8（4）：1168-1171.

［8］Zhong H，De Mario AM，Langhner E，et al.Overexpression of hypox?ia?inducible factor 1alpha in common human cancers and their me?tastases［J］.Cancer Res，1999，55（2）：5830-5835.

［9］郝天春，周玉林，汪小勇，等.HIF?1ɑ和CXCR4在腎透明細胞癌中的表達［J］.安徽醫(yī)科大學學報，2010，45（2）：168-171.

［10］Bernal?Mizrachi L，Lovly CM，Ratner L.The role of NF?kappa B?1 and NF?kappa B?2?mediated resistance to apoptosis in lymphomas［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2006，103（24）：9220-9222.

［11］Djavaheri?Mergny M，Amelotti M，Mathieu J，et al.NF?kappa B ac?tivation represses tumor necrosis factor?alpha?induced autophagy［J］.J Biol Chem，2006，281（41）：30373-30382.

［12］Semenza GL.HIF?1：mediator of physiological and pathophysiologi?cal responses to hypoxia ［J］.J Appl Physiol，2000，88（4）：1474-1480.

［13］徐可，李映川，陳波，等.HIF?1ɑ和HIF?2ɑ在腎透明細胞癌中的表達及意義［J］.中國癌癥雜志，2007，7（3）：245-247.

［14］Klatte T，Seligson DB，Riggs SB，et al.Hypoxia?inducible factor 1 alpha in clear cell renal cell carcinoma［J］.Clin Cancer Res，2007，13（24）：7388-7393.

［15］Van Uden P，Kenneth NS，Rocha S.Regulation of hypoxia?induc?ible factor?1alpha by NF?kappa B［J］.Biochem J，2008，412（3），477-484.