不同級(jí)別膠質(zhì)瘤中P53蛋白與O6?甲基鳥嘌呤?DNA甲基轉(zhuǎn)移酶表達(dá)的區(qū)別與聯(lián)系

李響，韓圣，秦曉飛，吳安華

（中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院神經(jīng)外科，沈陽110001）

不同級(jí)別膠質(zhì)瘤中P53蛋白與O6?甲基鳥嘌呤?DNA甲基轉(zhuǎn)移酶表達(dá)的區(qū)別與聯(lián)系

李響，韓圣，秦曉飛，吳安華

（中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院神經(jīng)外科，沈陽110001）

目的探討不同級(jí)別膠質(zhì)瘤中P53蛋白與O6-甲基鳥嘌呤-DNA甲基轉(zhuǎn)移酶（MGMT）表達(dá)的關(guān)系。方法2013年1月至2013年12月在我院進(jìn)行神經(jīng)外科手術(shù)切除的98例腦膠質(zhì)瘤組織作為研究對(duì)象，采用免疫組織化學(xué)的方法分析不同級(jí)別膠質(zhì)瘤組織中P53蛋白與MGMT表達(dá)的關(guān)系。結(jié)果在不同級(jí)別膠質(zhì)瘤組織間，MGMT陽性表達(dá)無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P=0.462），但表達(dá)強(qiáng)度差異明顯（P=0.019）。MGMT表達(dá)強(qiáng)度與腫瘤分級(jí)呈負(fù)相關(guān)（r=-0.629，P＜0.05）。MGMT與P53在陽性表達(dá)強(qiáng)度上呈負(fù)相關(guān)（r=-0.750，P＜0.05）。結(jié)論P(yáng)53蛋白與MGMT在不同級(jí)別的膠質(zhì)瘤中的表達(dá)有一定的關(guān)系，而且P53表達(dá)增強(qiáng)和MGMT表達(dá)減弱均會(huì)對(duì)膠質(zhì)瘤的發(fā)生及其惡性程度產(chǎn)生影響。

膠質(zhì)瘤；P53蛋白；O6-甲基鳥嘌呤-DNA甲基轉(zhuǎn)移酶

神經(jīng)膠質(zhì)瘤起源于神經(jīng)外胚層細(xì)胞，是原發(fā)性腦腫瘤中發(fā)病率最高的腫瘤。目前臨床上膠質(zhì)瘤治療主要是手術(shù)治療，術(shù)后輔以放療和化療的綜合治療方式，但總體治療效果不理想，患者預(yù)后非常差，生存期約（12±3）個(gè)月。O6-甲基鳥嘌呤-DNA甲基轉(zhuǎn)移酶（O6-methylguanine-DNA methyltransferase，MGMT）［1］是一種由MGMT基因編碼的DNA修復(fù)蛋白，它能將DNA鳥嘌呤6號(hào)氧上的烷基轉(zhuǎn)移到自身的半胱氨酸殘基上，使DNA上烷基化的鳥嘌呤被還原，而自身則成為失活的烷基化MGMT。所以MGMT在機(jī)體正常細(xì)胞中具體保護(hù)作用，能夠使可致突變毒性和細(xì)胞毒性的烷基化合物所致?lián)p傷修復(fù)，避免烷化基團(tuán)對(duì)細(xì)胞的損害，而這也是腫瘤耐受烷化劑類化療藥物的主要原因之一。P53作為體內(nèi)最重要的抑癌基因之一，在人類癌癥中發(fā)生突變的頻率高達(dá)50%，所形成的突變體P53不但失去了野生型P53的抑癌功能，而且還獲得了一系列類似于癌基因的功能，促進(jìn)了腫瘤的進(jìn)程。抑癌基因P53能使參與調(diào)控的細(xì)胞出現(xiàn)凋亡或負(fù)增長(zhǎng)的情況，并能夠?qū)?xì)胞的惡變產(chǎn)生抑制作用，但是由于P53蛋白半衰期較短，所以很難檢測(cè)。若P53基因出現(xiàn)缺失或突變情況，表達(dá)的P53蛋白半衰期明顯延長(zhǎng)，所以突變型P53基因表達(dá)的蛋白能在多種腫瘤組織中檢測(cè)到。為了進(jìn)一步揭示膠質(zhì)瘤的分子學(xué)特性，為膠質(zhì)瘤的治療方法的探尋和治療結(jié)果的改善提供更多的理論基礎(chǔ)，我們選取2013年1月至2013年12月在我院進(jìn)行神經(jīng)外科手術(shù)切除的98例患者腦膠質(zhì)瘤組織作為研究對(duì)象，研究不同級(jí)別膠質(zhì)瘤中P53蛋白與MGMT表達(dá)的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 臨床資料

選取2013年1月至2013年12月在我院神經(jīng)外科手術(shù)切除患者腦膠質(zhì)瘤組織98例，所有患者均為初次手術(shù)，復(fù)發(fā)膠質(zhì)瘤患者未入組。其中男53例，女45例，年齡13～77歲，平均（38.2±2.5）歲。膠質(zhì)瘤的組織學(xué)診斷根據(jù)2007年WHO中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，膠質(zhì)瘤Ⅰ級(jí)5例，Ⅱ級(jí)42例，Ⅲ級(jí)22例，Ⅳ級(jí)29例。

1.2 試劑

P53屬于即用型的單克隆鼠抗人抗體，試劑盒與液體DAB酶底物顯色試劑盒購自福州邁新公司，MGMT診斷試劑盒購自四川宇康生物技術(shù)有限公司。

1.3 方法

P53蛋白檢測(cè)選擇Envision兩步法，MGMT操作過程參考試劑盒說明，Envision兩步法操作如下：脫蠟，然后乙醇梯度水化，把構(gòu)椽酸鈉緩沖液（pH6.0）按照0.01 mol/L加入，12 min微波爐抗原修復(fù)，微波爐溫度控制在92～98℃，處理完冷卻后，用PBST漂洗，然后通過加專用封閉液，在37℃的環(huán)境下，用10 min孵化，完成后將封閉液脫去，加入單抗，在37℃孵育60 min，3次漂洗PBST，加二抗然后在37℃孵育30 min，漂洗PBST，進(jìn)行酶復(fù)合物添加，在37℃下進(jìn)行30 min的孵育，漂洗PBST。司底物液加入量為1 mg/mL，顯色15 min，顯色停止選用蒸餾水［2］，復(fù)染蘇木精，用封片劑進(jìn)行封片。

1.4 結(jié)果判斷

P53及MGMT陽性表達(dá)染色均定位于細(xì)胞核，陽性細(xì)胞表現(xiàn)為棕黃色顆粒。在40倍顯微鏡觀察細(xì)胞核染色數(shù)并計(jì)分：0分，陽性細(xì)胞數(shù)0～1%；1分，陽性細(xì)胞數(shù)1～10%；2分，陽性細(xì)胞數(shù)10%～25%；3分，陽性細(xì)胞數(shù)25%～50%；4分，陽性細(xì)胞數(shù)＞50%。細(xì)胞核染色程度：1為弱染色，淡黃色；2為中度染色，黃色；3為重度染色，黃褐色。兩項(xiàng)乘積得分分為5類等級(jí)：0分陰性（-），1～2分弱陽性或可疑陽性（+-），3～4分陽性（+），6分中等陽性（++），≥8分強(qiáng)陽性（+++）［3］。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

運(yùn)用Spearman等級(jí)相關(guān)檢驗(yàn)MGMT染色強(qiáng)度、腫瘤分級(jí)的相關(guān)性，雙變量相關(guān)探討MGMT與P53表達(dá)強(qiáng)度的關(guān)系。P＜0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 P53蛋白與MGMT的表達(dá)

P53蛋白與MGMT的表達(dá)均位于細(xì)胞核內(nèi)，P53蛋白表達(dá)細(xì)胞多分散分布，更傾向血管周細(xì)胞核染色。表達(dá)強(qiáng)度隨著腫瘤的惡性程度增加而增強(qiáng)，低分化膠質(zhì)瘤中分布更廣，強(qiáng)度更高（圖1）。P53蛋白的陽性表達(dá)率為53.1%。MGMT陽性細(xì)胞為棕黃色顆粒，分布不均勻，呈散在或灶性分布。不同腫瘤級(jí)別、不同標(biāo)本的差異較大；腫瘤分級(jí)高者與分級(jí)低者比較染色強(qiáng)度較弱，細(xì)胞核數(shù)較少（圖2）。MGMT陽性表達(dá)率為90.8%。

圖1 膠質(zhì)瘤組織MGMT蛋白免疫組織化學(xué)染色結(jié)果×40Fig.1 Immunohistochemical staining result of MGMT in glioma tissue×40

圖2 膠質(zhì)瘤組織P53蛋白免疫組織化學(xué)染色結(jié)果×40Fig.2 Immunohistochemical staining result of P53 protein in glioma tissue×40

2.2 MGMT表達(dá)與腦膠質(zhì)瘤病理分級(jí)的關(guān)系

MGMT在不同級(jí)別膠質(zhì)瘤的陽性表達(dá)率無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P=0.462），但表達(dá)強(qiáng)度有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P= 0.019），見表1。MGMT表達(dá)強(qiáng)度與腫瘤分級(jí)呈負(fù)相關(guān)（r=-0.629，P＜0.05）。

2.3 P53表達(dá)與MGMT表達(dá)間的關(guān)系

本組膠質(zhì)瘤中MGMT和P53蛋白陽性表達(dá)一致的符合率為40.8%（40/98），MGMT表達(dá)陽性組中隨其表達(dá)強(qiáng)度增高P53的表達(dá)強(qiáng)度明顯降低，兩者的表達(dá)強(qiáng)度呈明顯負(fù)相關(guān)（r=-0.750，P＜0.05），見表2。

表1 98例膠質(zhì)瘤組織MGMT的表達(dá)Tab.1 Expression of MGMT in 98 cases of glioma

表2 98例膠質(zhì)瘤組織中MGMT與P53蛋白表達(dá)強(qiáng)度比較Tab.2 Expression intensity of MGMT and P53 protein in 98 cases of glioma

3 討論

膠質(zhì)瘤的產(chǎn)生可能由人腦基因突變引發(fā)，也有可能是蛋白功能失調(diào)的原因。造成各種抑癌基因失活的一個(gè)因素是啟動(dòng)子區(qū)內(nèi)甲基化，進(jìn)而引發(fā)腫瘤。能夠保護(hù)DNA異常甲基化的是MGMT，它能夠避免烷化劑損傷正常組織，降低癌癥出現(xiàn)頻次，然而，它也存在一些不良反應(yīng)，抵消了烷化劑類化療藥物的藥效。

研究表明，MGMT與P53蛋白表達(dá)上兩者呈負(fù)相關(guān)，也就是說當(dāng)MGMT表達(dá)明顯的時(shí)候，P53蛋白表達(dá)較弱。這可能是因?yàn)镻53基因中的DNA被MGMT的高度活性保護(hù)所致，使得基因發(fā)生突變時(shí)能夠及時(shí)得到阻止［4］。與之相反MGMT啟動(dòng)子高度甲基化的個(gè)體，MGMT就不能夠充分顯示其保護(hù)能力，也就增加了P53基因突變的可能性，使細(xì)胞中突變型P53蛋白表達(dá)增加，在一定程度上強(qiáng)化了免疫組化的表達(dá)。野生型P53能使參與調(diào)控的細(xì)胞出現(xiàn)凋亡或負(fù)增長(zhǎng)的情況，并能夠?qū)?xì)胞的惡變產(chǎn)生抑制作用，但是由于它的半衰期較短，所以免疫組化方法很難檢測(cè)出陽性結(jié)果［5］。若P53基因出現(xiàn)缺失或突變情況，其P53蛋白的表達(dá)特別顯著，而且半衰期也明顯延長(zhǎng)，所以P53蛋白在多種腫瘤組織中都能檢測(cè)到［6］。對(duì)于MGMT和P53表達(dá)的關(guān)系問題，本研究只是初步進(jìn)行，還需要更深入研究論證。

一般低度惡性膠質(zhì)瘤的范圍在Ⅰ～Ⅱ級(jí)，高度惡性膠質(zhì)瘤是Ⅲ～Ⅳ級(jí)。P53蛋白陽性表達(dá)率、表達(dá)強(qiáng)度與這些腫瘤分級(jí)相關(guān)（P＜0.05），而且是正比例的關(guān)系，也就是腫瘤惡性程度較高的情況下，其P53表達(dá)顯著增強(qiáng)［7］。這也反向證明了P53表達(dá)強(qiáng)度較高的腫瘤，具有更大的侵襲能力和惡性度。對(duì)于膠質(zhì)瘤惡性程度是否與MGMT的表達(dá)有關(guān)的問題，本研究結(jié)果顯示不同惡性程度膠質(zhì)瘤MGMT陽性表達(dá)率沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但表達(dá)強(qiáng)度之間具有一定的差異，其他研究也證實(shí)在低級(jí)別膠質(zhì)瘤中MGMT的表達(dá)陽性強(qiáng)度更大。而高級(jí)別膠質(zhì)瘤中表達(dá)強(qiáng)度相對(duì)較?。?］，這就削弱了對(duì)烷基化的保護(hù)能力，使抑癌基因突變?cè)龆啵夜δ鼙灰种?，使癌?xì)胞具備更強(qiáng)的增值能力和侵襲性。從另一方面說，正常活性的MGMT對(duì)維持基因組的穩(wěn)定性及細(xì)胞的正常生理功能有一定作用。就惡性度高腫瘤組織內(nèi)MGMT的減弱機(jī)制而言，可能是MGMT啟動(dòng)子區(qū)異常甲基化，使之出現(xiàn)MGMT的低表達(dá)而產(chǎn)生的［9］。異常甲基化所致的MGMT低表達(dá)也是膠質(zhì)瘤對(duì)烷化劑類化療藥物的敏感因素之一［10］。

綜上所述，P53與MGMT表達(dá)在不同級(jí)別的膠質(zhì)瘤中均有一定的關(guān)系，而且MGMT表達(dá)減弱以及P53表達(dá)增強(qiáng)會(huì)對(duì)膠質(zhì)瘤的出現(xiàn)和惡化產(chǎn)生影響。在臨床中動(dòng)態(tài)觀察P53蛋白及MGMT的表達(dá)，進(jìn)而行基因干預(yù)治療也許是未來深入研究的課題之一。

［1］焦保華，劉宏雷，耿少梅，等.MGMT在腦膠質(zhì)瘤中表達(dá)的臨床意義及替莫唑胺聯(lián)合放療對(duì)預(yù)后的影響［J］.內(nèi)蒙古民族大學(xué)學(xué)報(bào)，2009，11（5）：79-80.

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（編輯 武玉欣）

The Differencesand Relationsof P53 Protein and MGMTExpression between Different Grade ofGliomas

LIXiang，HAN Sheng，QINXiao-fei，WUAn-hua
（DepartmentofNeurosurgery，The FirstHospital，China MedicalUniversity，Shenyang 110001，China）

ObjectiveTo investigate the P53 protein and O6-methylguanine-DNA methyltransferase（MGMT）expression in differentgrade ofgliomas，and explore theirrelationship with the tumorbiologicalcharacteristics.MethodsThe expression ofP53 and MGMT were detected in 98 different gliomas by using immunohistochemical method.The roles of the two proteins，in the aspects such as tumor invasion，were compared.ResultsNo obvious difference of MGMT expression was found in different grade of gliomas（P=0.462），but the expression intensity was difference（P= 0.019），which was negatively correlated with the grade of tumor（r=-0.629，P＜0.05）.MGMT and P53 in expressing intensity showed a negative correlation（r=-0.750，P＜0.05）.ConclusionP53 and MGMT expression in gliomas have a certain relationship with differentlevels ofglioma；in addition，both increased P53 expression and decreased MGMT expression affects glioma malignancy.

glioma；P53 protein；O6-methylguanine-DNA methyltransferase

R739.4

A

0258-4646（2014）06-0499-04

國家自然科學(xué)基金（81172409）

李響（1983-），男，助教，本科.

吳安華，E-mail：wuanhua@yahoo.com

2014-05-05

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