SPARC蛋白在乳腺癌組織中的表達(dá)及臨床意義

徐東旭，徐璐，李彥君，李朝輝，李智，滕月娥

（中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院腫瘤內(nèi)科，沈陽110001）

SPARC蛋白在乳腺癌組織中的表達(dá)及臨床意義

徐東旭，徐璐，李彥君，李朝輝，李智，滕月娥

（中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院腫瘤內(nèi)科，沈陽110001）

目的探討富含半胱氨酸的分泌性酸性蛋白（SPARC）在乳腺癌組織的表達(dá)及其臨床意義。方法收集1997年至2008年在我院行根治性手術(shù)的255例有完整隨訪資料的乳腺癌腫瘤組織石蠟標(biāo)本，采用組織芯片制作和免疫組化方法檢測SPARC蛋白在乳腺癌組織中的表達(dá)，分析其與臨床病理因素及預(yù)后的關(guān)系。結(jié)果乳腺癌組織SPARC蛋白陽性表達(dá)率為76.1%，SPARC在乳腺癌組織中的表達(dá)與病理類型（P=0.007）及激素受體狀態(tài)（P=0.034）相關(guān)。SPARC是否陽性表達(dá)對乳腺癌患者的無病生存時間（DFS）（P=0.451）、總生存時間（OS）（P=0.562）未顯示出有統(tǒng)計(jì)學(xué)差別，亞組分析顯示：絕經(jīng)前SPARC陰性組患者的DFS優(yōu)于SPARC陽性組患者的DFS，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.013）。多因素Cox比例風(fēng)險回歸分析顯示SPARC不是浸潤性乳腺癌復(fù)發(fā)及死亡的獨(dú)立預(yù)后因素。結(jié)論SPARC蛋白在乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展中起一定作用，它與雌激素受體表達(dá)密切相關(guān)，可能是影響絕經(jīng)前乳腺癌預(yù)后的重要指標(biāo)。

乳腺癌；富含半胱氨酸的分泌性酸性蛋白；免疫組化；預(yù)后

乳腺癌在女性惡性腫瘤發(fā)病率中居首位，每年新發(fā)病例超過100萬，死于惡性腫瘤的患者中有16%以上是死于乳腺癌［1］。乳腺癌已經(jīng)成為婦女健康的最大威脅。但目前已知的關(guān)于乳腺癌的預(yù)后因素仍十分欠缺。富含半胱氨酸的分泌性酸性蛋白（secreted protein acidic and rich in cysteine， SPARC）是一種32 kDa分泌糖蛋白，也稱為骨結(jié)合素（osteonectin，ON）及基膜40蛋白（basement membrane protein-40，BM40），與細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）蛋白相互作用，促進(jìn)細(xì)胞黏附，誘導(dǎo)細(xì)胞遷移［2，3］。SPARC蛋白也被認(rèn)為在組織重塑、血管生成、胚胎形成及腫瘤形成中起重要作用［4，5］。但目前關(guān)于SPARC蛋白在腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)、與ECM相互作用的具體機(jī)制及對預(yù)后的影響仍不十分清楚。本研究應(yīng)用組織芯片制作（tissuemicroarray，TMA）和免疫組化方法（immunohistochemistry，IHC）檢測乳腺癌組織中SPARC蛋白的表達(dá)，并分析SPARC蛋白與臨床病理特征之間的相互關(guān)系及其與患者預(yù)后的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 病例來源

1.1.1 入選標(biāo)準(zhǔn)：患者來源于我院接受改良根治術(shù)或保乳術(shù)的乳腺癌術(shù)后于腫瘤內(nèi)科治療的患者，病理診斷為浸潤性癌，年齡≥18歲，TNM分期為Ⅰ～Ⅲ期，術(shù)前均未行任何放療及化療治療，無嚴(yán)重、未控制的內(nèi)科疾病及感染，無病生存時間（disease-free survival，DFS）≥6個月。

1.1.2 排除標(biāo)準(zhǔn)：既往或同時患有其他惡性腫瘤的患者，標(biāo)本有限無法做進(jìn)一步分析的患者。

本研究共納入255例患者，均為女性，手術(shù)時間為1997年1月至2008年7月?；颊吣挲g最小為26歲，最大76歲，平均年齡50歲。采用手術(shù)石蠟病理標(biāo)本進(jìn)行組織芯片制作，組織芯片制備委托上海芯超生物科技有限公司完成。

1.2 試劑

鼠抗人SPARC單克隆抗體（工作濃度為1∶500）購自英國Abcam公司；免疫組化SP試劑盒、生物素標(biāo)記的羊抗鼠/兔IgG（二抗）、DAB試劑盒及檸檬酸修復(fù)液（100倍）均購自福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司；二甲苯、無水乙醇、0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液、蒸餾水、蘇木素、中性樹脂等均為國產(chǎn)試劑。

1.3 檢測方法

采用SP免疫組化法。實(shí)驗(yàn)步驟嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行操作，用PBS代替一抗作陰性對照，用已知的胃組織SPARC陽性片作陽性對照。

1.4 結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)

采用半定量積分法判定結(jié)果，SPARC陽性著色表現(xiàn)為胞質(zhì)和間質(zhì)呈棕黃色染色。先按染色強(qiáng)度計(jì)分：0分，無色；1分，淺黃色；2分，棕黃色；3分，棕褐色。在高倍鏡下（×40）取5個不同視野，各計(jì)數(shù)100個細(xì)胞，再按陽性細(xì)胞所占百分比計(jì)分：0分，陰性；1分，陽性細(xì)胞≤10%；2分，11%～50%；3分，51%～75%；4分，＞75%。染色強(qiáng)度與陽性細(xì)胞百分比的計(jì)分乘積≥3分為免疫反應(yīng)陽性，否則為陰性［6］。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。不同組間比較用χ2檢驗(yàn)及Fisher確切概率法；生存率的比較采用Kaplan-Meier法，組間比較采用Log-rank檢驗(yàn)，采用Cox比例風(fēng)險回歸分析進(jìn)行預(yù)后因素分析。Cox比例風(fēng)險回歸模型分析中規(guī)定拒絕H0的水準(zhǔn)α=0.1，其余分析設(shè)定P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 SPARC蛋白在浸潤性乳腺癌組織的表達(dá)及其與浸潤性乳腺癌臨床病理因素的關(guān)系

SPARC蛋白主要在乳腺癌組織的胞質(zhì)和間質(zhì)中表達(dá)，陽性表達(dá)率為76.1%，免疫組化染色見圖1。

圖1 乳腺癌中SPARC蛋白的表達(dá)SP×400Fig.1 Expression of SPARC protein in breast cancer SP×400

SPARC蛋白的表達(dá)在不同的雌激素受體（estrgen receptor，ER）表達(dá)患者中有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P= 0.040）。SPARC的表達(dá)在不同年齡、月經(jīng)狀態(tài)、TNM分期、腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、病理組織學(xué)分級、孕激素受體（progesterone receptor，PR）、HER-2狀態(tài)中無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。見表1。

2.2 SPARC蛋白與浸潤性乳腺癌患者復(fù)發(fā)和生存的關(guān)系

255例患者按照腫瘤分期及免疫組化情況，術(shù)后接受輔助化療、內(nèi)分泌治療及放療，術(shù)后每年1次隨訪生存數(shù)據(jù)。末次隨訪日期為2013年12月31日，終止日期為死亡日期或末次隨訪日期。隨訪期限從11～164個月不等，中位隨訪時間為92.00個月。復(fù)發(fā)患者72例，死亡患者47例，均為復(fù)發(fā)后死亡患者。Kaplan-Meier生存分析中，SPARC蛋白對乳腺癌患者的DFS（Log rank檢驗(yàn)P=0.451）、總生存時間（overall survival，OS）無統(tǒng)計(jì)學(xué)差別（Log rank檢驗(yàn)P=0.562）。見圖2、圖3。

亞組分析顯示，診斷時絕經(jīng)前的患者中，SPARC陰性患者的DFS優(yōu)于SPARC陽性患者的DFS，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Log rank檢驗(yàn)P=0.013）；但在OS分析中，SPARC陰性患者的OS優(yōu)于SPARC陽性患者的OS，有統(tǒng)計(jì)學(xué)趨勢，但差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Log rank檢驗(yàn)P=0.068）。見圖4、圖5。

表1 SPARC的表達(dá)與浸潤性乳腺癌臨床病理因素的關(guān)系Tab.1 Relationship between the expression of SPARC protein and clinical pathology of breast cancer

圖2 SPARC陽性與陰性患者的DFS曲線Fig.2 DFS curves of patients with positive and negative SPARC expression

圖3 SPARC陽性與陰性患者的OS曲線Fig.3 OS curves of patients with positive and negative SPARC expression

圖4 診斷時未絕經(jīng)患者的DFSFig.4 DFS curves of premenopausal patients when diagnosis

圖5 診斷時未絕經(jīng)患者的OSFig.5 OS curves of premenopausal patients when diagnosis

2.3 浸潤性乳腺癌復(fù)發(fā)及死亡的Cox比例風(fēng)險回歸模型分析

2.3.1 浸潤性乳腺癌復(fù)發(fā)的Cox比例風(fēng)險回歸模型分析：結(jié)果如表2所示，對患者復(fù)發(fā)有顯著影響的因子為TNM分期（P=0.000）、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（P=0.001）、HER-2狀態(tài)（P=0.050）、放射治療（P=0.041），均為危險因子。而SPARC蛋白、診斷時年齡、診斷時月經(jīng)狀態(tài)、腫瘤大小、病理組織學(xué)分級、ER、PR、標(biāo)準(zhǔn)化療、內(nèi)分泌治療對浸潤性乳腺癌患者的復(fù)發(fā)均無明顯影響。

表2 浸潤性乳腺癌復(fù)發(fā)的單因素Cox比例風(fēng)險回歸模型分析Tab.2 Univariate Cox proportional hazard regression model analysis of invasive breast cancer for recurrence

將表2中初步篩選出的因子（協(xié)變量）統(tǒng)一引入多因素Cox比例風(fēng)險回歸模型分析，結(jié)果顯示TNM分期是浸潤性乳腺癌影響復(fù)發(fā)的獨(dú)立危險預(yù)后因素（P=0.001，RR=2.838）。

2.3.2 浸潤性乳腺癌死亡的Cox比例風(fēng)險回歸模型分析

單因素Cox比例風(fēng)險回歸模型分析結(jié)果顯示對患者死亡有顯著影響的因子為TNM分期（P＜0.001）、腫瘤大?。≒=0.071）、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（P= 0.001）、PR（P=0.037）、內(nèi)分泌治療（P=0.012）。TNM分期、腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是危險因子；PR狀態(tài)及內(nèi)分泌治療是保護(hù)因子。而SPARC、診斷時年齡、診斷時月經(jīng)狀態(tài)、病理組織學(xué)分級、ER、HER-2、標(biāo)準(zhǔn)化療、放射治療對浸潤性乳腺癌患者的死亡均無明顯影響，見表3。

表3 浸潤性乳腺癌死亡的單因素Cox比例風(fēng)險回歸模型分析Tab.3 Univariate Cox proportional hazard regression model analysis of invasive breast cancer for death

將表3中初步篩選出的因子（協(xié)變量）統(tǒng)一引入多因素Cox比例風(fēng)險回歸模型分析，結(jié)果顯示TNM分期是浸潤性乳腺癌影響死亡的獨(dú)立危險預(yù)后因素（P=0.001，RR=3.179），PR狀態(tài)是浸潤性乳腺癌影響死亡的獨(dú)立保護(hù)預(yù)后因素（P=0.060，RR= 0.529）。

3 討論

SPARC蛋白是一種高度保守的細(xì)胞外間質(zhì)蛋白，它的主要功能為破壞細(xì)胞黏附、調(diào)節(jié)細(xì)胞分化、阻止細(xì)胞播散、抑制細(xì)胞對某些生長因子的反應(yīng)、調(diào)節(jié)胞外基質(zhì)和基質(zhì)金屬蛋白酶的產(chǎn)生以及影響新生血管生成［7］。本研究顯示：SPARC蛋白主要在乳腺癌組織的胞質(zhì)和間質(zhì)中表達(dá)，陽性表達(dá)率為76.1%。SPARC蛋白在腫瘤間質(zhì)中高表達(dá)，可能通過影響腫瘤細(xì)胞微環(huán)境促進(jìn)腫瘤細(xì)胞生長、侵襲及轉(zhuǎn)移。已有研究證明：SPARC蛋白與浸潤性導(dǎo)管癌的間質(zhì)重塑、CD34及α-SMA表達(dá)缺失明顯相關(guān)，并干擾TGFβ1信號系統(tǒng)，在腫瘤進(jìn)展中發(fā)揮作用［8］。

本研究顯示：ER陰性組SPARC蛋白陽性表達(dá)率明顯高于ER陽性組，2組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.040）。Graham等［10］曾報(bào)道SPARC mRNA表達(dá)水平與ER表達(dá)水平之間，有明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)負(fù)相關(guān)性（P=0.009 5），認(rèn)為ER抑制SPARC基因表達(dá)，從而減少受體陽性腫瘤的侵襲性，推測ER表達(dá)缺失可能導(dǎo)致SPARC蛋白過表達(dá)，與細(xì)胞低分化、更具侵襲性有關(guān)。本研究首次在蛋白水平發(fā)現(xiàn)SPARC蛋白與ER表達(dá)之間的關(guān)系，從而證明：ER陰性乳腺癌預(yù)后差可能與SPARC蛋白過表達(dá)有關(guān)。Helleman等［11］研究認(rèn)為：轉(zhuǎn)移性乳腺癌中含SPARC蛋白的細(xì)胞外基質(zhì)基因簇與一線他莫西芬治療抵抗相關(guān)。我們的研究未發(fā)現(xiàn)SPARC的表達(dá)與內(nèi)分泌治療療效的關(guān)系。SPARC蛋白的表達(dá)與內(nèi)分泌治療耐藥之間的關(guān)系尚需進(jìn)一步研究。

關(guān)于SPARC蛋白與乳腺癌預(yù)后關(guān)系的研究目前尚有爭論。有研究認(rèn)為乳腺癌上皮細(xì)胞中SPARC蛋白表達(dá)增加與生存率降低有關(guān)［12～14］；也有報(bào)道內(nèi)源性SPARC蛋白通過降低細(xì)胞侵襲活性及腫瘤血管內(nèi)血小板聚集阻止MDA-MB-231乳腺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移，SPARC蛋白上調(diào)可能改善乳腺癌預(yù)后［15～17］。Kim等［18］評價了253例乳腺浸潤性導(dǎo)管癌術(shù)后腫瘤組織中SPARC蛋白的表達(dá)，未得出SPARC蛋白對浸潤性乳腺癌有預(yù)測價值的結(jié)論。本研究應(yīng)用Kaplan-Meier生存分析顯示SPARC蛋白陽性患者與SPARC蛋白陰性患者的DFS及OS無統(tǒng)計(jì)學(xué)差別（P＞0.05）。在診斷時未絕經(jīng)的乳腺癌患者中，SPARC蛋白陽性組的DFS明顯劣于SPARC蛋白陰性組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。但在OS分析中無統(tǒng)計(jì)學(xué)差別?？紤]未絕經(jīng)患者多為年輕女性，是否SPARC蛋白在年輕患者中表達(dá)增高預(yù)示著預(yù)后更差，本研究尚未得出具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的結(jié)果?？赡茈S著樣本量的增加及隨訪時間延長，會出現(xiàn)有意義的結(jié)果。

多因素Cox比例風(fēng)險回歸分析顯示SPARC不是浸潤性乳腺癌復(fù)發(fā)及死亡的獨(dú)立預(yù)后因素。TNM分期是復(fù)發(fā)及死亡的獨(dú)立危險因素。PR是死亡的獨(dú)立保護(hù)因素。提示TNM分期越晚，預(yù)后越差，臨床可能需要多種治療手段結(jié)合，尤其對激素受體陽性的患者應(yīng)用內(nèi)分泌治療，都可能起到良好的效果。

本研究納入255例患者，例數(shù)較少，TNMⅠ～Ⅱ期占74.9%，病理組織學(xué)分級1級～2級占60.8%，由于樣本多為早期患者，復(fù)發(fā)及死亡事件數(shù)量較少，因此在復(fù)發(fā)及生存分析中未得出具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的結(jié)果。

總之，本研究顯示SPARC蛋白在人體乳腺癌組織的胞質(zhì)和間質(zhì)中高表達(dá)，與激素受體表達(dá)密切相關(guān)，SPARC蛋白表達(dá)可能是絕經(jīng)前乳腺癌生存的重要預(yù)后指標(biāo)，未來需進(jìn)一步探索SPARC蛋白的表達(dá)調(diào)控及其分子機(jī)制與乳腺癌的關(guān)系，臨床研究進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量為乳腺癌的預(yù)后研究提供依據(jù)。

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（編輯 武玉欣）

Expression and ClinicalSignificance of SPARCProtein in Breast Cancer

XUDong-xu，XULu，LIYan-jun，LIZhao-hui，LIZhi，TENGYue-e
（DepartmentofOncology，The FirstHospital，China MedicalUniversity，Shenyang 110001，China）

ObjectiveTo study the expression of secreted protein acidic and rich in cysteine（SPARC）in breast cancer，and explore its clinical significance.MethodsA total of 255 tumor specimens of radical operation for breast cancer were collected in the First Hospital of China Medical University from 1997 to 2008.The expression of SPARC protein in breast cancer tissues was detected by tissue chips and immunohistochemical，and its relationship with clinicopathological factors was analyzed.ResultsThe expression rate of SPARC was 76.1%in breast cancer tissues.The positive expression of SPARC protein was related to invasive ductal carcinoma（P=0.007），hormone receptor state（P=0.034），and ER state（P= 0.040）.There was no significant difference of the disease-free survival（DFS）（P=0.451）or overall survival（OS）（P=0.562）between breast cancer patients with/without SPARC expression.Subgroup analysis showed that premenopausal DFS is significantly better than that of SPARC positive patients with SPARC negative group DFS（P=0.013）.Multivariate Cox proportionalhazard regression analysisshowed thatSPARCisnotrecurrence and mortality of independent prognostic factors invasive breast cancer.ConclusionSPARC protein played an important role in the genesis and development of breast cancer，and was closely related with the expression of estrogen receptor，which could be an important index in premenopausalbreastcancerprognosis.

breast cancer；secreted protein acidic and rich in cysteine protein；immunohistochemistry；prognosis

R737.9

A

0258-4646（2014）06-0493-06

國家自然科學(xué)基金（81172535）；遼寧省科學(xué)技術(shù)計(jì)劃（2010225032）；遼寧省教育廳高?？蒲杏?jì)劃（L2010698）

徐東旭（1984-），女，醫(yī)師，碩士研究生.

滕月娥，E-mail：tengyuee0517@163.com.cn

2014-04-04

網(wǎng)絡(luò)出版時間：