人TLR2基因啟動(dòng)子活性的研究

李苗，羅恩杰

（中國(guó)醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)教研室，沈陽(yáng)110001）

人TLR2基因啟動(dòng)子活性的研究

李苗，羅恩杰

（中國(guó)醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)教研室，沈陽(yáng)110001）

目的鑒定TLR2啟動(dòng)子結(jié)構(gòu)，探索調(diào)控TLR2基因高水平轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)片段。方法利用生物信息學(xué)軟件分析TLR2基因啟動(dòng)子結(jié)構(gòu)，構(gòu)建TLR2啟動(dòng)子序列系列截短的螢光素酶報(bào)告基因重組體，脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染分化成熟的U937細(xì)胞，應(yīng)用雙熒光素酶活性檢測(cè)系統(tǒng)檢測(cè)啟動(dòng)子的活性。結(jié)果-403～+20 bp和-190～+20 bp具有高轉(zhuǎn)錄活性，-140～+20 bp和-88～+20 bp啟動(dòng)子活性最低。結(jié)論人TLR2基因-190～-140 bp是主要的轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)，是進(jìn)一步研究DNA結(jié)合蛋白的調(diào)控靶序列。

TLR2基因；轉(zhuǎn)錄；啟動(dòng)子

Toll樣受體（Toll-like receptor，TLR）2是目前研究認(rèn)為與免疫及炎性反應(yīng)關(guān)系最為密切的TLR家族成員。TLR2具有相對(duì)廣泛的配體特異性，可識(shí)別多種病原體相關(guān)分子模式，如革蘭陽(yáng)性菌肽聚糖、脂胞壁酸、脂蛋白，還包括某些病毒、螺旋體屬、支原體屬及分支桿菌屬微生物等的病原體［1］。TLR2不但具有促進(jìn)細(xì)胞因子的合成與釋放、促進(jìn)免疫細(xì)胞成熟、分化和功能化等作用，還在調(diào)節(jié)機(jī)體對(duì)入侵病原體的免疫應(yīng)答水平方面有不容忽視的作用［2～4］。目前，對(duì)于TLR2的研究主要集中在其功能方面，而TLR2基因的啟動(dòng)子結(jié)構(gòu)及上游調(diào)控因子尚不十分明確。本研究擬對(duì)TLR2基因上游5′側(cè)翼區(qū)-403～+20 bp的片段進(jìn)行啟動(dòng)調(diào)控活性分析，尋找調(diào)控人TLR2基因高啟動(dòng)活性片段，為闡明TLR2基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)機(jī)制奠定分子基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng)及分化

用含10%胎牛血清的RPIM1640培養(yǎng)液培養(yǎng)U937細(xì)胞，將細(xì)胞置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，無(wú)抗生素培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度至106個(gè)；轉(zhuǎn)種至4塊6孔板，每孔加入PMA（美國(guó)Sigma Aldrich公司）100 ng/mL，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)孵育24 h。

1.2 TLR2基因啟動(dòng)子序列的克隆及載體構(gòu)建

以人類基因組DNA為模板，分別擴(kuò)增TLR2啟動(dòng)子區(qū)-403～+20 bp、-230～+20 bp和-190～+20 bp、-140～+20 bp、-88～+20 bp片段。引物序列如下：上游引物：5′-AGAAAATACTGGTTGGG-3′（-403 bp）、5′-TGTCGCAGCCTAGCTCAC-3′（-230 bp）、5′-GGAAGCACGGCCGCGGG-3′（-190 bp）、5′-GCGAG GTCCAGAGTTCCC-3′（-140 bp）、5′-TTCCCGCACC CCAGAAGG-3′（-88 bp）；下游引物：5′-GGAGGCAG CGAGAAAGCG-3′。按常規(guī)方法進(jìn)行PCR，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)割膠小量柱純化回收后，用pMD18-T載體經(jīng)T4DNA連接酶（大連TaKaRa公司）連接，連接混和物轉(zhuǎn)染至感受態(tài)大腸桿菌JM109并篩選，SacⅠ和HindⅢ雙酶切后，T4DNA連接酶連接至pGL3 basic載體，鑒定正確后，經(jīng)測(cè)序（北京華大基因公司），最后大量擴(kuò)增陽(yáng)性克隆，抽提、純化質(zhì)粒重組體，紫外分光光度計(jì)（Du2600，德國(guó)Beckman公司）測(cè)質(zhì)粒純度。

1.3 TLR2啟動(dòng)子活性檢測(cè)

已分化細(xì)胞鋪板至6孔板，脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染螢光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒0.8 μg，共轉(zhuǎn)染海腎熒光素酶對(duì)照質(zhì)粒0.01 μg作為內(nèi)對(duì)照。Dual-GloTM雙熒光素酶檢測(cè)系統(tǒng)檢測(cè)螢光素酶活性。

2 結(jié)果

2.1 TLR2基因5′側(cè)翼序列結(jié)構(gòu)分析

利用生物信息學(xué)軟件ALiBaba2.1和TRANSFAC TESS，我們分析了TLR2基因5′側(cè)翼序列-403～+20 bp區(qū)域結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)有多個(gè)潛在的順式作用元件。見(jiàn)圖1。

圖1 TLR2啟動(dòng)區(qū)-403至+20 bp序列結(jié)構(gòu)Fig.1 Region from-403 to+20 bp of the TLR2 promoter according to sequence

2.2 TLR2基因5′側(cè)翼序列系列截短的螢光素酶報(bào)告基因重組體的鑒定

為了檢測(cè)各段啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄活性，根據(jù)距離轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)的位置，我們構(gòu)建了系列截短的TLR2啟動(dòng)子螢光素酶報(bào)告基因載體p403-luc、p230-luc、p190-luc、p202-luc、p140-luc和p88-luc。經(jīng)測(cè)序，插入片段與GenBank報(bào)道的序列（Accession NG_ 016229）完全一致。見(jiàn)圖2。

2.3 TLR2基因啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄活性

通過(guò)熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)系統(tǒng)我們檢測(cè)了不同長(zhǎng)度的啟動(dòng)子片段活性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)p190-luc的活性顯著高于其他片段；當(dāng)p190截短至p140之后，p140-luc的活性明顯下降，而且p140-luc和p88-luc的活性幾乎達(dá)到pGL3-Basic（陰性對(duì)照）水平（圖3）。因此，我們認(rèn)為-190～-140 bp是TLR2基因的主要的轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)。

圖2 TLR25′側(cè)翼序列系列截短的螢光素酶報(bào)告基因重組體結(jié)構(gòu)Fig.2 Schematic representation of a series of 5′?flanking deletions of the TLR2promoter luciferase reporter constructs

圖3 TLR2啟動(dòng)子片段的基礎(chǔ)轉(zhuǎn)錄活性Fig.3 Basal activity of TLR2 promoter luciferase reporter constructs in U937 cells

3 討論

真核生物基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制十分復(fù)雜，可以發(fā)生在DNA和染色質(zhì)水平、轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后水平、翻譯和翻譯后水平等，其中轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控是基因表達(dá)調(diào)控最主要的方式［5］。啟動(dòng)子是基因轉(zhuǎn)錄最基本的調(diào)控區(qū)，一般位于基因轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)上游的數(shù)百個(gè)堿基以內(nèi)，含有調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄最基本的也是最重要的DNA順式作用元件［6］。我們利用生物信息學(xué)軟件分析發(fā)現(xiàn)TLR2基因缺乏典型的轉(zhuǎn)錄所需要的起始元件TATA box，但具有Spl、NF-κb、AP-2α和CEBPα等轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)。這些元件都可能對(duì)TLR2表達(dá)起重要的調(diào)控作用。

根據(jù)反應(yīng)元件的位置，我們采用雙熒光素酶報(bào)告基因分析系統(tǒng)及構(gòu)建系列截短熒光素酶報(bào)告基因載體的方法，克隆并分析鑒定了人類TLR2基因啟動(dòng)子區(qū)域403 bp內(nèi)調(diào)控元件。熒光素酶的結(jié)果提示，TLR2基因-190～-140 bp區(qū)域?qū)υ摶虻幕A(chǔ)轉(zhuǎn)錄非常重要。經(jīng)預(yù)測(cè)，該區(qū)域可能存在Spl、AP-2α、myoD等轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合位點(diǎn)。Spl是體內(nèi)普遍表達(dá)的鋅指蛋白轉(zhuǎn)錄因子，對(duì)轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)GC盒有很強(qiáng)的親和力，Spl通過(guò)結(jié)合基因調(diào)控區(qū)的GC/GT盒以及與其他蛋白相互作用，發(fā)揮對(duì)基因轉(zhuǎn)錄的增強(qiáng)或抑制作用，幾乎參與細(xì)胞的所有功能。轉(zhuǎn)錄因子Spl能幫助起動(dòng)無(wú)TATA盒的啟動(dòng)子活化，TLR2基因的啟動(dòng)子區(qū)域就含有多個(gè)推測(cè)的Spl結(jié)合位點(diǎn)。有研究［7］證實(shí)，位于TLR2啟動(dòng)子-64 bp存在Spl反應(yīng)元件，但其他的轉(zhuǎn)錄因子以及對(duì)TLR2基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控的確切機(jī)制還不清楚，還有待于進(jìn)一步研究。

綜上所述，本研究成功構(gòu)建了TLR2啟動(dòng)子區(qū)系列截短熒光素酶報(bào)告基因載體，預(yù)測(cè)了啟動(dòng)子區(qū)域含有的多個(gè)潛在的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合序列，為以后研究相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子對(duì)TLR2基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控以及確認(rèn)其核心啟動(dòng)子區(qū)奠定了分子基礎(chǔ)。

［1］Vives PM，Somoza N，F(xiàn)ernandez Alvarez J，et al.Evidence of expression of endotoxin receptors CD14，Toll-like receptors TLR4 and TLR2 and associated molecule MD22 and of sensitivity to endotoxin（LPS）in islet beta cells［J］.J Clin Exp Immunol，2003，133（2）：208-218.

［2］Hertz CJ，Kiertscher SM，Godowski PJ，et al.Microbial lipopeptides stimulate dendritic cell maturation via Toll like receptor 2［J］.J Immunol，2001，166（4）：2444-2450.

［3］Druszczynska M，Wlodarczyk M，Janiszewska-Drobinska B，et al. Monocyte signal transduction receptors in active and latent tuberculosis［J］.Clin Dev Immunol，2013，2013：851452.

［4］Sasai M，Yamamoto M.Pathogen recognition receptors：ligands and signaling pathways by toll-like receptors［J］.Int Rev Immunol，2013，32（2）：116-133.

［5］李英慧，陳芳杰，李春義，等.神經(jīng)細(xì)胞中乙?；瘜?duì)NOS1基因啟動(dòng)子活性的調(diào)節(jié)［J］.中國(guó)醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2011，40（3）：204-205.

［6］Juven-Gershon T，Kadonaga JT.Regulation of gene expression via the core promoter and the basal transcriptional machinery［J］.Dev Biol，2010，339（2）：225-229.

［7］Haehnel V，Schwarzfischer L，F(xiàn)enton MJ，et al.Transcriptional regulation of the human toll-like receptor 2 gene in monocytes and macrophages［J］.J Immunol，2002，168（11）：5629-5637.

（編輯 陳姜）

Analysisof Promoter Activity for Human Toll-like Receptor2 Gene

LIMiao，LUOEn-jie
（DepartmentofMicrobiology，College ofBasic MedicalScience，China MedicalUniversity，Shenyang 110001，China）

ObjectiveTo identify the promoter structure of Toll-like receptor 2（TLR2）gene and explore the fragment with high promoter activity in TLR2gene.MethodsThe TLR2gene promoter was analyzed using bioinformatics software.A series of truncated luciferase reporter constructs were generated and assayed using Dual-Glo luciferase system.ResultsThe highest transcriptional activity was observed in the construction driven by the regions from-403 to+20 bp and-190 to+20 bp，the lowest transcriptional activity was observed in construction driven by the regions from-140 to+20 bp and-88 to+20 bp.ConclusionThe region of-190 to-140 bp within TLR2promoter is a key transcriptional regulatory region ofthe gene，which could be idealtargetsequencesforthe furtherstudy ofDNAbinding protein.

TLR2gene；transcription；promoter

R394.3

A

0258-4646（2014）06-0485-03

國(guó)家自然科學(xué)基金（81201333）

李苗（1981-），女，講師，博士.

羅恩杰，E-mail：enjie359@yahoo.com.cn

2014-04-03

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