類透明質(zhì)酸殼聚糖微乳增加大鼠血腫瘤屏障通透性的研究

解輝，陸威成，丁曉慧，楊智航，楊志強，薛一雪

（1.沈陽醫(yī)學院組織胚胎學教研室，沈陽110034；2.中國醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院神經(jīng)外科，沈陽110001；3.沈陽醫(yī)學院生理學教研室，沈陽110034；4.沈陽醫(yī)學院2013級臨床醫(yī)學專業(yè)2班，沈陽110034，5.中國醫(yī)科大學神經(jīng)生物學教研室，沈陽110001）

類透明質(zhì)酸殼聚糖微乳增加大鼠血腫瘤屏障通透性的研究

解輝1，陸威成2，丁曉慧1，楊智航3，楊志強4，薛一雪5

（1.沈陽醫(yī)學院組織胚胎學教研室，沈陽110034；2.中國醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院神經(jīng)外科，沈陽110001；3.沈陽醫(yī)學院生理學教研室，沈陽110034；4.沈陽醫(yī)學院2013級臨床醫(yī)學專業(yè)2班，沈陽110034，5.中國醫(yī)科大學神經(jīng)生物學教研室，沈陽110001）

目的研究類透明質(zhì)酸殼聚糖微乳（（HAC?ME）對腦膠質(zhì)瘤大鼠血腫瘤屏障（BTB）通透性的作用效果及機制。方法采用伊文氏蘭（EB）滲透評估HAC?ME作用后BTB通透性的變化。應(yīng)用Western blot方法觀察HAC?ME作用后大鼠腦膠質(zhì)瘤微血管中緊密連接相關(guān)蛋白（Claudin）?5的表達情況。結(jié)果EB滲透評估結(jié)果表明HAC?ME（＜5 mg/mL）可引起腦膠質(zhì)瘤大鼠血腫瘤屏障通透性發(fā)生變化，灌注0.25 h后血腫瘤屏障通透性開始增加，灌注1 h時達高峰，而后有所下降，16 h時基本恢復(fù)至灌注前水平，同時Western blot結(jié)果表明大鼠腦膠質(zhì)瘤微血管中Claudin?5蛋白的表達水平，從HAC?ME作用后0.25 h后開始減少，作用后1 h表達最少，而后有所上升，16 h時基本恢復(fù)至作用前水平。結(jié)論HAC?ME能夠增加腦膠質(zhì)瘤大鼠血腫瘤屏障的通透性，其作用機制與Claudin?5表達水平下調(diào)相關(guān)。

類透明質(zhì)酸殼聚糖微乳；血腫瘤屏障；緊密連接

透明質(zhì)酸是大分子直鏈糖胺多糖，由重復(fù)的二糖單元組成，其廣泛存在于生物體內(nèi)，不僅作為一種主要的結(jié)締組織細胞外基質(zhì)成分，同時也是一種生物調(diào)節(jié)分子，具有多種生物學活性。殼聚糖是一種天然的高分子陽離子集合物，具有良好的生物可降解性及生物相容性，成為藥物載體的研究熱點［1］。微乳是目前研究極其廣泛的新型藥物載體系統(tǒng)［2］，其具有血腦屏障（blood?brain barrier，BBB）開放作用，但由于微乳進入血液循環(huán)后易被網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)巨噬細胞吞噬，從而限制了其向腦部的選擇性分布，故腦靶向性不強［3～5］。已經(jīng)有研究者將透明質(zhì)酸、殼聚糖和微乳進行組裝，成功制備了類透明質(zhì)酸殼聚糖微乳（HAC?ME），其親水性增加，并抑制了巨噬細胞的吞噬作用，提高了腦靶向性。研究發(fā)現(xiàn)大部分實體腫瘤組織外周的透明質(zhì)酸增高，然而透明質(zhì)酸易為機體代謝，留存時間短［6，7］，同時腫瘤細胞表面的透明質(zhì)酸受體CD44表達上調(diào)［8～11］，研究已經(jīng)證實在人腦膠質(zhì)瘤及大鼠C6來源的膠質(zhì)瘤中均存在CD44分子的表達［12，13］，這提示透明質(zhì)酸與細胞表面的CD44受體結(jié)合而參與調(diào)解腫瘤細胞的生長、轉(zhuǎn)移等，利用透明質(zhì)酸/CD44受體介導(dǎo)作用可以提高抗腫瘤藥物的主動靶向性［14，15］。因此，我們推測外源性HAC?ME具有開放BTB的潛能。

本研究應(yīng)用HAC?ME灌注腦膠質(zhì)瘤大鼠，測定大鼠BTB通透性的變化，同時檢測大鼠腦膠質(zhì)瘤微血管中緊密連接相關(guān)蛋白（Claudin）?5的表達，明確HAC?ME對于大鼠血腫瘤屏障通透性的作用和機制。

1 材料與方法

1.1 材料

動物：健康成年Wistar大鼠，體質(zhì)量180～220 g，（沈陽醫(yī)學院實驗動物中心提供）；Cremophor EL（德國BASF公司）；Cradamol GTCC（medium?chain fatty acid triglyceride，英國CRODA公司）；注射用茶油（BA，龍游縣田雨山茶油開發(fā)有限公司）；類透明質(zhì)酸殼聚糖（hyaluronic acid chitosan，HAC，浙江新復(fù)大醫(yī)藥化工有限公司）；伊文氏蘭（美國Fluka公司進口分裝），Claudin?5（美國Invitrogen公司）。

1.2 方法

1.2.1 HAC?ME的制備：取Cremophor EL，BA及Cradamol GTCC等的混合液（質(zhì)量比為4.5∶1∶1）置配液容器中，加入處方量20%HAC水溶液，攪拌孵化15 min后，混合均勻得到HAC?ME溶液，放置過夜備用。

1.2.2 動物腦膠質(zhì)瘤模型的制備：常規(guī)培養(yǎng)大鼠C6膠質(zhì)瘤細胞系，用DMEM培養(yǎng)基制備濃度為1×106/μL的C6膠質(zhì)瘤細胞懸液。腹腔注射10%水合氯醛（3.5 mL/kg）將大鼠麻醉后，將大鼠頭部固定在立體定位儀上，將制備好的細胞懸液10 μL用微量注射器注入頭部右側(cè)尾狀核，靶點為前囟前1 mm，矢狀縫旁開3 mm，深4.5 mm。腫瘤移植14 d后備用。

1.2.3 給藥方法和實驗分組：用10%水合氯醛麻醉腫瘤移植大鼠，經(jīng)腹側(cè)頸部正中切口分離右側(cè)頸總動脈和頸外動脈，結(jié)扎頸外動脈遠端和頸總動脈的近端，用微量注射器在1 min內(nèi)向頸總動脈的近端灌注HAC?ME，同時監(jiān)測大鼠的體溫和血壓情況。選擇HAC?ME灌注后0、0.25、0.5、1、2、4、8和16 h時間點進行研究。本研究將大鼠隨機分為8組（n=8每組）：HAC?ME 0 h、HAC?ME 0.25 h、HAC?ME 0.5 h、HAC?ME 1 h、HAC?ME 2 h、HAC?ME 4 h、HAC?ME 8 h和HAC?ME 16 h組。

1.2.4 血腫瘤屏障通透性的測定：腫瘤細胞移植14 d后，大鼠BTB的通透性可用伊文氏蘭（Evans blue，EB）的滲出量定量估計。用生理鹽水配制2%EB。麻醉的大鼠經(jīng)HAC?ME灌注，在不同作用時間點，經(jīng)大鼠股靜脈給予2%EB溶液作用2 h，之后暴露大鼠胸腔經(jīng)左心室灌注肝素化生理鹽水，直至右心耳處流出無色液體為止。大鼠經(jīng)斷頭后沿矢狀縫分離兩側(cè)大腦半球并稱質(zhì)量，再放入甲酰胺（1 mL/100 mg）中60℃孵育24 h。在分光光度計上測定620 nm處的吸光度值，根據(jù)用一系列稀釋度EB的光密度值制作的標準曲線計算EB含量。

1.2.5 Western bolt法檢測大鼠腦膠質(zhì)瘤微血管中Claudin?5蛋白的表達：腫瘤細胞移植14 d，經(jīng)HAC?ME灌注不同時間后，大鼠斷頭取腦，提取各組大鼠腦膠質(zhì)瘤微血管段，勻漿離心、測定蛋白濃度；蛋白分離采用15%SDS?PAGE電泳，然后轉(zhuǎn)印到硝酸纖維素膜上，孵育一抗Claudin?5（1∶500）4℃過夜；再孵育相應(yīng)二抗室溫作用2 h；以β?actin作為內(nèi)對照，經(jīng)ECL發(fā)光后，膠片條帶用薄層掃描儀進行灰度掃描，F(xiàn)luor Chem 2.0圖像分析儀對條帶積分光密度進行定量分析。

1.3 統(tǒng)計學方法

2 結(jié)果

2.1 HAC?ME對BTB通透性的影響

EB滲透評估證明HAC?ME可引起腦膠質(zhì)瘤大鼠BTB通透性發(fā)生變化，在灌注HAC?ME 0.25 h后BTB通透性開始增加，灌注1 h時達高峰，而后有所下降，灌注16 h時基本恢復(fù)至灌注前水平，見圖1。

2.2 HAC?ME對大鼠腦膠質(zhì)瘤微血管中Claudin?5蛋白表達的影響

Western blot法檢測HAC?ME作用后大鼠腦膠質(zhì)瘤微血管中Claudin?5蛋白表達的變化，結(jié)果顯示HAC?ME灌注后，Claudin?5蛋白表達水平從0.25 h開始減少，在1 h表達最少，之后有所增加，在16 h基本恢復(fù)到灌注前水平，見圖2。

3 討論

腦膠質(zhì)瘤是臨床上顱內(nèi)腫瘤中最常見的一種，起源于神經(jīng)外胚層細胞，國內(nèi)統(tǒng)計占顱內(nèi)腫瘤的35.12%～61.10%，平均49.17%。大多數(shù)膠質(zhì)瘤患者惡性程度高，侵襲性強，手術(shù)不易切除完全，術(shù)后化療是腦膠質(zhì)瘤治療的主要手段之一，但由于血腦屏障和血腫瘤屏障的存在限制了化療藥物進入中樞神經(jīng)系統(tǒng)，化療療效并不理想［16］。為了將化療藥物轉(zhuǎn)運到腦腫瘤組織，選擇性地增加BTB的通透性是一個理想的方法。

圖1 EB實驗測定HAC?ME作用后BTB通透性變化Fig.1 Change of HAC?ME on the permeability of BTB determined by EB method

圖2 Western blot法檢測HAC?ME對大鼠腦膠質(zhì)瘤微血管中Claudin?5蛋白表達的影響Fig.2 Effect of HAC?ME on the protein expression of Claudin?5 in microvessel of rat brain glioma determined by Western blot method

BTB是存在于血液和腦腫瘤組織之間的一層屏障系統(tǒng)，腦腫瘤微血管內(nèi)皮細胞之間的緊密連接（tight junction，TJ）是構(gòu)成BTB結(jié)構(gòu)和功能的基礎(chǔ)。TJ主要由跨膜蛋白和胞質(zhì)附著蛋白兩種成分組成，其中Occludin和claudin?5是構(gòu)成TJ的主要跨膜蛋白，是維持TJ結(jié)構(gòu)和功能的重要組成部分。胞質(zhì)附著蛋白Zonaoccludens家族中的ZO?1同樣是構(gòu)成TJ的一個主要蛋白，ZO?1可以作為連接跨膜蛋白oc? cludin和claudin?5以及細胞骨架蛋白F?actin的橋梁蛋白，ZO?1的分布和表達的變化同樣影響TJ的結(jié)構(gòu)和功能［17，18］。目前，ZO?1、Occludin、Claudin?5是TJ的標志蛋白，這些蛋白的表達和分布的變化是BTB開放的途徑之一。

本研究結(jié)果表明HAC?ME使腦膠質(zhì)瘤大鼠BTB通透性發(fā)生變化，灌注HAC?ME0.25 h后BTB通透性開始增加，灌注1 h時達高峰，而后有所下降，16 h時基本恢復(fù)至灌注前水平，同時HAC?ME作用后大鼠腦膠質(zhì)瘤微血管中Claudin?5蛋白表達發(fā)生變化，其表達從HAC?ME灌注0.25 h開始減少，在1 h表達最少，之后有所增加，在16 h基本恢復(fù)到灌注前水平。我們發(fā)現(xiàn)HAC?ME作用后，BTB通透性變化與腦膠質(zhì)瘤微血管中Claudin?5蛋白表達變化同步，這些結(jié)果初步證明HAC?ME能夠增加腦膠質(zhì)瘤大鼠血腫瘤屏障的通透性，其機制與TJ開放的細胞旁途徑相關(guān)，本研究結(jié)果可能為人腦膠質(zhì)瘤的化療提供新途徑，但其具體機制還有待進一步深入研究。

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（編輯 裘孝琦）

Study of Hyaluronic Acid Chitosan?based Microemulsion on the Permeability of Blood Tumor Barrier in Rat

XIE Hui1，LU Wei?cheng2，DING Xiao?hui1，YANG Zhi?hang3，YANG Zhi?qiang4，XUE Yi?xue5
（1.Department of Histology and Embryology，Shengyang Medical College，Shengyang 110034，China；2.Department of Neurosurgery，The First Affiliated Hospital，China Medical University，Shenyang 110001，China；3.Department of Physiology，Shenyang Medical College，Shenyang 110034，China；4.Class 2，Grade 2013，Shenyang Medical College，Shenyang 110034，China；5.Department of Neurobiology，China Medical University，Shenyang 110001，China）

ObjectiveTo investigate the effect of hyaluronic acid chitosan?based microemulsion（HAC?ME）on the permeability of blood tumor barrier（BTB）in brain glioma rat models，and explore the mechanism.MethodsThe permeability of BTB after HAC?ME infusion was measured by Evans blue（EB）assay.Western bolt method was used to measure the expression of tight junction protein claudin?5 after HAC?ME infusion in mi?crovessel of rat brain glioma.ResultsThe EB extravasation showed that HAC?ME could change the BTB permeability in brain glioma rats.The per?meability of BTB started to increase at0.25 h，reached a peak at1 h，then gradually decreased and restored to the level before administration of HAC?ME at 16 h.In addition，the results of Western blot showed that protein expression of Claudin?5 started to decrease at 0.25 h，reached the lowest at 1 h，then gradually increased and restored to the level before administration of HAC?ME at16 h in microvessel of rat brain glioma.ConclusionHAC?ME could increase the permeability of BTB in brain glioma rats，the mechanism may be related with the down?regulation of tight junction protein Claudin?5 expression.

hyaluronic acid chitosan?based microemulsion；blood tumor barrier；tight junction

R739.41

A

0258-4646（2014）08-0703-03

遼寧省科技廳博士啟動基金項目（20131114）；沈陽醫(yī)學院科技基金項目（20133053）

解輝（1982-），女，講師，博士. E-mail：symcxiehui@163.com

2014-05-02

網(wǎng)絡(luò)出版時間：