血中可溶性白細胞分化抗原40配體對內(nèi)皮細胞損傷的影響

史麗，尹潔，馬靜，王娟，姜秉芬

（河北醫(yī)科大學第四醫(yī)院婦產(chǎn)科，石家莊050011）

血中可溶性白細胞分化抗原40配體對內(nèi)皮細胞損傷的影響

史麗，尹潔，馬靜，王娟，姜秉芬

（河北醫(yī)科大學第四醫(yī)院婦產(chǎn)科，石家莊050011）

目的研究血中可溶性白細胞分化抗原40配體（sCD40L）對人臍靜脈內(nèi)皮細胞（HUVEC）的損傷并探討其發(fā)生機制。方法應用不同濃度人重組CD40L（r?CD40L）刺激HUVEC 24 h，建立單核細胞（THP?1）滲出模型，評價內(nèi)皮細胞通透性。應用不同濃度r?CD40L刺激HUVEC 24 h，逆轉錄PCR技術檢測HUVEC中TNF?αmRNA水平，觀察不同濃度r?CD40L對內(nèi)皮細胞功能的影響（以TNF?αmRNA水平表示）。采用ELISA法測定不同濃度r?CD40L刺激HUVEC后上清液中TNF?α蛋白水平。應用25 μg/L r?CD40L刺激HUVEC不同時間，流式細胞技術檢測HUVEC凋亡情況。結果隨著r?CD40L刺激濃度的增加，單核細胞透膜數(shù)逐漸升高，HUVEC中TNF?αmRNA表達水平逐漸升高，HUVEC上清液中TNF?α的濃度逐漸增加。應用25 μg/L r?CD40L刺激HUVEC不同時間，未誘導出細胞凋亡。結論sCD40L對臍靜脈內(nèi)皮細胞通透性的影響呈濃度依賴性，其機制可能是通過上調(diào)內(nèi)皮細胞核內(nèi)TNF?αmRNA表達并促進其分泌TNF?α實現(xiàn)的。sCD40L對HUVEC功能的影響明顯早于細胞的凋亡。

子癇前期；可溶性白細胞分化抗原40配體；腫瘤壞死因子α；內(nèi)皮細胞通透性；人臍靜脈內(nèi)皮細胞

子癇前期是一種以高血壓、蛋白尿、水腫為主要臨床表現(xiàn)的妊娠晚期特發(fā)性疾病。研究證明，子癇前期患者體內(nèi)過度的炎性反應是導致血管內(nèi)皮細胞損傷的重要因素之一［1］，而內(nèi)皮細胞損傷是引起該病一系列臨床癥狀的病理生理基礎?？扇苄园准毎只乖?0（soluble cluster of differentiation 40，sCD40）/可溶性白細胞分化抗原40配體（soluble cluster of differentiation 40 ligand，sCD40L）是一對廣泛分布于內(nèi)皮細胞的信號系統(tǒng)，活化的血中sCD40L具有很強的生物活性，是導致血栓形成的重要炎性介質(zhì)，可能導致內(nèi)皮細胞的損傷。近年來研究發(fā)現(xiàn)，sCD40L在子癇前期患者血漿中明顯增高，且與疾病嚴重程度呈正相關［2，3］，但其在子癇前期發(fā)病機制中的作用至今鮮見報道。本研究應用不同濃度人重組CD40L（recombinant CD40L，r?CD40L）刺激人臍靜脈內(nèi)皮細胞（human umbilical vein endothelial cell，HUVEC）來模仿子癇前期患者血漿中高水平sCD40L對內(nèi)皮細胞的刺激，通過檢測對內(nèi)皮細胞通透性、內(nèi)皮細胞功能的影響［以腫瘤壞死因子α（tu?mor necrosis factor?α，TNF?α）mRNA水平表示］、細胞培養(yǎng)上清液中TNF?α蛋白水平以及能否誘導細胞凋亡，探討sCD40L對內(nèi)皮細胞的損傷，從而闡述sCD40L在子癇前期發(fā)病機制中的作用，以期為子癇前期的治療尋找新的突破點。

1 材料與方法

1.1 材料

HUVEC、5氯甲基二乙酸熒光素（5?chlorometh?ylfluorescein diacetate，CMFDA）、人急性單核細胞白血病細胞株THP?1、胎牛血清、培基、培養(yǎng)皿、消化胰酶、二甲基亞砜等購自上海迪奧生物科技有限公司。r?CD40L購自于美國PeproTech公司；Transwell小室購自美國Corning Costar公司。TNF?α的引物由上海賽百盛基因技術有限公司設計合成。ELISA試劑盒購自美國R&D System公司。

1.2 HUVEC的培養(yǎng)及分組

將HUVEC接種在含20%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中，置于37℃、5%CO2孵育箱培養(yǎng)。取3～4代細胞，以1×105/mL的濃度接種于6孔板中，根據(jù)r?CD40L的不同刺激濃度分為以下5組：0、15、25、35、45 μg/L組，刺激HUVEC 24 h。

1.3 單核細胞滲出模型的建立及內(nèi)皮細胞通透性的測定

將上述應用不同濃度r?CD40L（0、15、25、35、45 μg/L）刺激后的HUVEC以1×105/cm2接種到Tran?swell小室上室，加含20%胎牛血清高糖DMEM培養(yǎng)基，待HUVEC融合成單層。工作液的配置：將50 μg CMFDA靜置至室溫，加入10 μL的二甲基亞砜，終濃度為10 mmol/L。工作液濃度為5 μmol/L，4 μL的原液加入2 mL的無血清培基。將生長狀態(tài)良好的THP?1細胞饑餓24 h，離心并去掉上清，應用上述工作液重懸THP?1細胞，培養(yǎng)45 min后離心，PBS沖洗。去掉HUVEC融合成單層的上室中培基，將處理后的THP?1細胞應用無血清培基重懸后，以1× 105/孔、100 μL加入Transwell小室上室。下室加入含20%胎牛血清的培基，37℃、5%CO2孵育箱中培養(yǎng)3 h。計數(shù)：熒光顯微鏡計數(shù)下室THP?1細胞數(shù)，每組隨機選擇5個視野并求得平均值。

1.4 內(nèi)皮細胞TNF?αmRNA表達水平的檢測

將上述各組處理后的HUVEC應用逆轉錄PCR技術檢測細胞中TNF?αmRNA水平。常規(guī)提取總mRNA并檢測總RNA濃度及純度，將總mRNA逆轉錄為cDNA后進行PCR擴增。TNF?α的上游引物為5′?AGCTCCAGTGGCTGAACCG?3′；下游引物為5′?CAGGGCAATGATCCCAAAGTA?3′，擴增片段為長度398 bp。內(nèi)參為GAPDH，上游引物為5′?ACCAG CCCCAGCAAGAGCACAAG?3′，下游引物為5′?TTCAAGGGGTCTACATGGCAACTG?3′，擴增片段為長度123 bp。反應參數(shù)為95℃預變性5 min；94℃變性30 s，61℃退火45 s，72℃延伸30 s，共35個循環(huán)；72℃終末延伸5 min，擴增產(chǎn)物以1.6%瓊脂糖凝膠電泳，將凝膠成像系統(tǒng)進行半定量分析。重復3次取均值。TNF?αmRNA表達水平用TNF?αmRNA密度值/GAPDH mRNA密度值表示。

1.5 細胞上清液中TNF?α水平的檢測

取上述5組刺激后HUVEC上清液以1 500 r/ min離心力離心5 min，再取上清液100 μL，應用ELISA法檢測細胞上清液中TNF?α蛋白水平。同時每組均設相應未干預組。檢測均由同一人在同一實驗室按照試劑盒說明書操作。

1.6 流式細胞技術檢測HUVEC凋亡

將上述刺激后各組HUVEC制備單細胞懸液，計數(shù)細胞（1～5）×106加入3 mL PBS離心5 min，去上清后加入預冷的無水乙醇，終濃度70%，4℃過夜。離心去除固定液3 mL PBS 5 min，900目篩網(wǎng)過濾，離心區(qū)PBS。加入1 mL碘化丙錠（PI）染料，避光孵浴30 min，上機檢測凋亡細胞百分率。結果判斷：在PI熒光直方圖上凋亡細胞在G1/G0期前出現(xiàn)一亞二倍體。內(nèi)參對照：采用雞血紅細胞作為內(nèi)參對照，觀察紅細胞PI熒光強度為正常二倍體細胞的35%。

1.7 統(tǒng)計學方法

使用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計學分析，計量資料采用表示，多組間比較采用完全隨機設計的方差分析，兩兩比較采用SNK?q檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 各組THP?1細胞透膜數(shù)

隨著r?CD40L刺激濃度的增加，透過Transwell小室濾膜的THP?1細胞數(shù)目逐漸增加，0、15、25、35、45 μg/L組分別為5.60±2.13、22.73±2.18、58.27± 5.27、101.67±9.74、149.00±7.31，各組比較差異均有統(tǒng)計學意義（F=138.9，P＜0.01）。見圖1。

2.2 HUVEC中TNF?αmRNA表達水平

不同濃度r?CD40L刺激HUVEC 24 h后，0、15、25、35、45 μg/L組HUVEC中TNF?αmRNA水平分別為1.01±0.11、1.11±0.37、1.29±0.13、1.57±0.09、1.82±0.12、2.22±0.06，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見圖2。

圖1 不同濃度r?CD40L刺激HUVEC后對THP?1細胞透膜個數(shù)的影響×200Fig.1 Migrated THP?1 cells after incubation of HUVEC conditional medium induced by r?CD40L×200

圖2 不同濃度r?CD40L刺激后HUVEC中TNF?αmRNA表達水平Fig.2 Expressions of TNF?αmRNA in HUVEC after treatment with different concentrations of r?CD40L

2.3 HUVEC培養(yǎng)上清液中TNF?α的濃度

應用不同濃度r?CD40L（0、15、25、35、45 μg/L）刺激HUVEC 24 h后，隨著刺激濃度的增加，內(nèi)皮細胞分泌到上清液中TNF?α蛋白水平逐漸增加，各組間比較差異有統(tǒng)計學意義（F=128.74，P＜0.01）。各組中干預后與干預前比較，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見表2。

表2 r?CD40L刺激HUVEC分泌TNF?α的影響Tab.2 Effect of r?CD40L on TNF?α concentration in HUVEC

2.4 r?CD40L刺激HUVEC的凋亡

應用25 μg/L r?CD40L刺激HUVEC 0、6、12、24、 48 h，均未誘導出HUVEC凋亡。見圖3。

3 討論

3.1 子癇前期患者血中sCD40L與內(nèi)皮細胞通透性的關系

近年來研究證明，子癇前期患者體內(nèi)過多炎性反應引起的血管內(nèi)皮細胞通透性增高是導致子癇前期發(fā)病的機制之一［4］。sCD40/sCD40L是一對廣泛分布于內(nèi)皮細胞及激活血小板的信號系統(tǒng)，并可通過多種信號通路引起后續(xù)效應。CD40L是CD40的天然配體，主要表達于血小板、單核細胞、CD4+T淋巴細胞、內(nèi)皮細胞等。當細胞被二磷酸腺苷、凝血酶及膠原等物質(zhì)激活后，細胞表面的CD40L被切下來產(chǎn)生一個具有生物活性、可溶性的三聚體片段sCD40L進入血液循環(huán)。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，孕婦血漿中sCD40L水平升高與子癇前期發(fā)病有關［2，3］。本研究應用不同濃度r?CD40L對內(nèi)皮細胞的刺激來模仿子癇前期患者血漿中高水平sCD40L，利用CMF?DA標記的THP?1細胞株透膜細胞數(shù)反映內(nèi)皮細胞通透性。結果顯示，隨著r?CD40L刺激濃度的升高，各組THP?1細胞透膜數(shù)逐漸增加，提示sCD40L能使內(nèi)皮細胞的通透性增加，且呈濃度依賴性。

圖3 25μg/L r?CD40L刺激HUVEC不同時間的細胞凋亡情況Fig.3 The apoptosis of HUVEC by 25μg/L r?CD40L injury for different times

3.2 sCD40L、TNF?α與子癇前期的關系

在子癇前期發(fā)病過程中，sCD40L可能通過以下途徑介導體內(nèi)炎性反應并引起內(nèi)皮細胞通透性增加：體外研究已證實sCD40L可刺激巨噬細胞、內(nèi)皮細胞、血管平滑肌細胞表達和釋放基質(zhì)金屬蛋白酶、白細胞介素6和白細胞介素8［5～7］；通過核因子κB（nuclear factor?kappa B，NF?κB）信號通路引起下游細胞因子表達增加，如TNF?α。Takacs等［8］研究發(fā)現(xiàn)，子癇前期孕婦血漿可使培養(yǎng)的臍靜脈內(nèi)皮細胞中NF?κB的活化提高2.5倍。NF?κB對內(nèi)皮細胞透性的影響可能是由NF?κB上調(diào)其下游炎性因子如TNF?α、白細胞介素1等直接增加內(nèi)皮細胞通透性從而造成對內(nèi)皮細胞的損傷［9］。TNF?α是一個具有多種生物學效應的炎性因子。在炎性與免疫反應發(fā)生發(fā)展中，TNF?α起著始動作用［10，11］，是細胞因子瀑布效應的關鍵點。在全身各種炎性反應中，TNF?α水平均明顯升高，且與血管內(nèi)皮細胞功能密切相關。既往研究表明，經(jīng)TNF?α共培養(yǎng)的細胞從形態(tài)上會出現(xiàn)壞死、脫落，殘存細胞稀疏失去正常形態(tài)、細胞間連接少進而完全壞死脫落。TNF?α造成內(nèi)皮細胞損傷可通過減少分泌舒血管活性因子（氧化氮）、增加腎素—血管緊張素的分泌、趨化炎性細胞、促進炎性因子表達實現(xiàn)［12，13］。近年來研究證明，TNF?α在子癇前期發(fā)病中有很重要的作用，TNF?α的表達異常與子癇前期的發(fā)病及嚴重程度密切相關［14］?；谝陨侠碚摶A，我們檢測了不同濃度r?CD40L對臍靜脈內(nèi)皮細胞刺激后細胞中TNF?αmRNA表達水平及細胞上清液中HUVEC分泌TNF?α的水平。結果顯示，r?CD40L呈濃度依賴性地增加了臍靜脈內(nèi)皮細胞細胞上清液中TNF?α的表達水平，雖然TNF?α主要由巨噬細胞及中性粒細胞產(chǎn)生，但作為炎癥啟動子的TNF?α也可由內(nèi)皮細胞始動分泌并參與機體炎癥級聯(lián)反應從而通過以上機制導致內(nèi)皮細胞通透性增加并損傷；同時，r?CD40L呈濃度依賴性增加內(nèi)皮細胞中TNF?αmRNA水平進而影響細胞功能。因此，我們推測sCD40L使內(nèi)皮細胞通透性增高可能是通過上調(diào)內(nèi)皮細胞核內(nèi)TNF?α mRNA表達并促進其分泌TNF?α實現(xiàn)的。

3.3 sCD40L與內(nèi)皮細胞的凋亡

sCD40L是否能誘導內(nèi)皮細胞凋亡目前尚無報道，本研究結果提示r?CD40L呈濃度依賴性增加臍靜脈內(nèi)皮細胞中TNF?αmRNA及細胞上清液中TNF?α表達水平。TNF?α生物學效應是通過腫瘤壞死因子受體1而產(chǎn)生，其產(chǎn)生的信號傳導途徑有2條：一是fas相關蛋白死亡域介導的細胞凋亡；二是通過TNF受體相關死亡域—TNF受體相關因子激活核轉錄因子NF?κB抑制凋亡，腫瘤壞死因子受體2則通過不同于腫瘤壞死因子受體1但在某些環(huán)節(jié)可發(fā)生交叉反應的信號傳導途徑激活NF?κB，使細胞增殖分化。本實驗應用流式細胞技術檢測經(jīng)r?CD40L（25 μg/L）刺激不同時間后（0、6、12、24、48 h）HUVEC凋亡情況，結果發(fā)現(xiàn)在48 h內(nèi)r?CD40L并未誘導出細胞凋亡。這可能是通過產(chǎn)物TNF?α的自動調(diào)節(jié)網(wǎng)絡完成的，也可能是由于sCD40/sCD40L信號直接激活細胞內(nèi)抗凋亡基因、活化抗凋亡蛋白、抑制凋亡基因表達所致，具體機制尚需進一步研究。

總之，sCD40L能夠呈濃度依賴性增加臍靜脈內(nèi)皮細胞的通透性，其機制可能是通過上調(diào)內(nèi)皮細胞核內(nèi)TNF?αmRNA表達并促進其分泌TNF?α實現(xiàn)的。在一些炎性疾病動物模型中，通過給予CD40/ CD40L單抗治療后，產(chǎn)生了較好的抑制炎癥發(fā)生、發(fā)展的效果，這為臨床改善子癇前期臨床癥狀及治療提供了新思路。

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（編輯 陳姜）

Effect of Soluble Cluster of Differentiation 40 Ligand on the Injury in Human Umbilical Vein Endothelial Cells

SHI Li，YIN Jie，MA Jing，WANG Juan，JIANG Bing?fen
（Department of Obstetrics and Gynecology，The Fourth Clinical Medical College，Hebei Medical University，Shijiazhuang 050011，China）

ObjectiveTo investigate the effect of soluble cluster of differentiation 40 ligand（sCD40L）on human umbilical vein endothelial cell（HUVEC）and explore its underlying mechanisms.MethodsThe THP?1 leakage model was established by stimulating HUVEC with different con?centration of r?CD40L for24 hours.The permeability of endothelial cell was evaluated.The level of tumor necrosis factor?α（TNF?α）mRNA in HU?VEC cell was examined 24 hours after stimulation by different concentration of r?CD40L using RT?PCR technology.The concentration of TNF?α in supernatant was measured by ELISA.The apoptosis of HUVEC after r?CD40L stimulation（25 μg/L）was detected by flow.ResultsThe number of THP?1 has been shown to gradually increase with the concentration of r?CD40L.Along with the increase of r?CD40L concentration，TNF?α mRNA in HUVEC expression level increased gradually.TNF?αconcentration of HUVEC in supernatant gradually increased with the increase of r?CD40L concentration.No apoptosis was observed in HUVEC with 25 μg/L r?CD40L stimulation.ConclusionThe permeability of endothelial cells was depended on the concentration of sCD40L，the mechanism may rely on the induced expression of TNF?αmRNA and increased the secretion of TNF?α.The effect of sCD40L on the function of HUVEC was observed much earlier than cell apoptosis.

preeclampsia；soluble cluster of differentiation 40 ligand；tumor necrosis factor?α；endothelial permeability；human um?bilical vein endothelial cell

R714.24

A

0258-4646（2014）08-0698-05

河北省科技支撐計劃（11276145）

史麗（1978-），女，主治醫(yī)師，碩士. E-mail：shili11927@163.com

2014-06-08

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