腫瘤靶向特異性光學(xué)分子探針的結(jié)構(gòu)與設(shè)計(jì)策略

劉杰昊等

【摘要】 腫瘤是目前嚴(yán)重影響人類健康的疾病之一，傳統(tǒng)的檢查方法難以從分子水平早期診斷腫瘤。光學(xué)分子成像技術(shù)是一種采用光學(xué)成像，通過(guò)分子熒光標(biāo)記靶向目標(biāo)，形成光學(xué)分子影像進(jìn)行腫瘤早期非侵入診斷的方法。光學(xué)分子探針是光學(xué)分子成像技術(shù)的核心，如何設(shè)計(jì)出具有靶向性和高度親和力的理想探針成為當(dāng)今研究的熱點(diǎn)。同時(shí)隨著新型成像儀器的開(kāi)發(fā)和光學(xué)分子探針的不斷發(fā)展，光學(xué)成像技術(shù)將不斷完善，成為臨床分子水平早期診斷腫瘤的重要方法。

【關(guān)鍵詞】 光學(xué)分子成像； 分子探針； 分子探針設(shè)計(jì)

1 概述

腫瘤是目前嚴(yán)重危害人類健康的疾病之一，雖然隨著科技的進(jìn)步，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)對(duì)腫瘤的診斷水平不斷提高，但是腫瘤患者的5年生存率和生活質(zhì)量仍不太理想，其中最重要的原因之一是缺乏從分子水平獲得早期腫瘤診斷信息的方法。目前，臨床上對(duì)腫瘤的診斷主要依賴于臨床癥狀、血清學(xué)檢查、常規(guī)影像學(xué)檢測(cè)等方法，如X線、X線計(jì)算機(jī)斷層攝影（CT）、放射性核素顯像、磁共振成像（MRI）和超聲診斷（US），但是腫瘤發(fā)病的早期癥狀隱匿，血清學(xué)檢測(cè)特異性較差，常規(guī)的影像學(xué)檢查手段雖然有許多優(yōu)點(diǎn)，但從分子水平進(jìn)行早期診斷還存在許多不足之處，因此，如何從分子水平對(duì)腫瘤的發(fā)生發(fā)展進(jìn)行早期診斷就成為目前研究的熱點(diǎn)。

最新研究表明，光學(xué)分子成像技術(shù)（Optical Molecular Imaging）將成為未來(lái)診療技術(shù)發(fā)展的新方向，是繼傳統(tǒng)的分子成像方式之后，又一新的影像技術(shù)，將成為臨床醫(yī)生的好助手。其原理是利用生物發(fā)光、熒光蛋白或熒光染料，標(biāo)記在體生命大分子，進(jìn)行定性和定量研究，與磁共振、核素成像等技術(shù)相比，具有無(wú)創(chuàng)性、高敏感性、成像價(jià)格低、特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)[1]。光學(xué)分子成像技術(shù)主要分為以下幾大類：熒光成像（Fluorescence Imaging，F(xiàn)MI）、生物發(fā)光成像（Bioluminescence Imaging，BLI），拉曼成像（Raman Imaging，RI），光聲成像（Photoacoustic Imaging，PAI），活體顯微鏡（Intravital Microscopy，IVM）和光頻域成像等（Optical Frequency Domain Imaging，OFDI），其中目前應(yīng)用最為廣泛的是FMI和BLI[2]。

光學(xué)分子探針是光學(xué)分子成像技術(shù)的核心理論和方法，是進(jìn)行分子影像學(xué)研究的先決條件。廣義的分子探針是指能在機(jī)體內(nèi)某些部位聚集，并產(chǎn)生影像學(xué)信號(hào)可供體外設(shè)備檢測(cè)的物質(zhì)。理想的分子探針具有的生物學(xué)特性有[3]：（1）與靶向分子有高特異性和親和力；（2）分子量較小，容易穿過(guò)機(jī)體內(nèi)的生理屏障，并能反映體內(nèi)靶向分子的數(shù)量及空間分布；（3）無(wú)毒副作用及免疫排斥反應(yīng)、性質(zhì)穩(wěn)定和血液清除速度快；（4）容易制備合成。

2 光學(xué)分子探針的分類與結(jié)構(gòu)

根據(jù)探針的作用原理，光學(xué)分子探針?lè)譃椋悍翘禺愋怨鈱W(xué)分子探針、可激活光學(xué)分子探針和特異性光學(xué)分子探針[4]。

2.1 非特異性光學(xué)分子探針 非特異性光學(xué)分子探針通常是指一些小分子游離熒光基團(tuán)，經(jīng)血管裂隙分布于細(xì)胞外組織中，由于病變和正常組織的灌注率或血管通透性不同，非特異性探針進(jìn)入病變組織和正常組織的數(shù)量明顯不同，因而可根據(jù)不同的光學(xué)分子影像進(jìn)行靶向目標(biāo)的識(shí)別，但這種探針對(duì)靶向目標(biāo)缺乏特異性，導(dǎo)致目標(biāo)-背景信噪比低，成像效果差[5]。

2.2 可激活光學(xué)分子探針 可激活光學(xué)分子探針也稱作智能探針，其在初始狀態(tài)下不發(fā)出光學(xué)信號(hào)，而一旦達(dá)到靶向目標(biāo)被特定的生化或物理因子激活后即可發(fā)出強(qiáng)烈的光學(xué)信號(hào)而被檢測(cè)[6]。

2.3 特異性光學(xué)分子探針 特異性光學(xué)分子探針又稱為靶向性探針，是指與靶向目標(biāo)具有親和性的配體經(jīng)過(guò)特定方法與生物素和熒光素等對(duì)比劑連接而組成。特異性光學(xué)分子探針由三部分組成：報(bào)告基團(tuán)（Reporter Group）、連接基團(tuán)（Spacer）和識(shí)別基團(tuán)（Receptor），部分探針可不含有連接基團(tuán)，且連接基團(tuán)和識(shí)別基團(tuán)連接后不應(yīng)當(dāng)影響識(shí)別基團(tuán)的生物活性[7]。

2.3.1 報(bào)告基團(tuán) 也稱作信號(hào)基團(tuán)，其作用是可以快速地富集在體內(nèi)某一部位而被光學(xué)成像設(shè)備檢測(cè)到信號(hào)。光學(xué)分子探針常見(jiàn)的報(bào)告基團(tuán)有熒光素、熒光染料和量子點(diǎn)（Quantum Dots，QDs）等。

2.3.2 連接基團(tuán) 也稱作連接體，是指連接報(bào)告基團(tuán)和識(shí)別基團(tuán)的部分，因報(bào)告基團(tuán)和識(shí)別基團(tuán)一般結(jié)構(gòu)較為復(fù)雜，兩者如相距太近可能會(huì)導(dǎo)致彼此生物活性的改變，因此連接體可以減少信號(hào)基團(tuán)和識(shí)別基團(tuán)之間的相互反應(yīng)。更為重要的是，連接體可以優(yōu)化探針的藥物代謝動(dòng)力學(xué)特性。連接基團(tuán)通常會(huì)對(duì)探針和靶向目標(biāo)蛋白的結(jié)合產(chǎn)生重要影響，其長(zhǎng)度、親水性及所帶電荷等方面都是影響探針活性的關(guān)鍵因素[8]。常用的連接基團(tuán)有長(zhǎng)鏈烷基和聚乙二醇等。長(zhǎng)鏈烷基可以改善分子探針的脂溶性，有利于探針進(jìn)入細(xì)胞；聚乙二醇則可改善分子探針的水溶性，有利于減少探針和非靶向目標(biāo)蛋白的非特異性結(jié)合。脂溶性好的分子探針一般經(jīng)過(guò)肝膽系統(tǒng)代謝，而水溶性好的分子探針一般通過(guò)泌尿系統(tǒng)清除[9]。

2.3.3 識(shí)別基團(tuán) 也稱作靶向基團(tuán)，是指可以識(shí)別靶向目標(biāo)蛋白并與之緊密結(jié)合，形成蛋白-探針復(fù)合物，是整個(gè)探針的核心部分。目前，科學(xué)家已經(jīng)開(kāi)發(fā)出多種靶向基團(tuán)，包括抗體、多肽和小分子化合物等[10]。

2.3.3.1 抗體 抗體因?yàn)榭梢援a(chǎn)生理想的配體-受體結(jié)合反應(yīng)，且對(duì)靶向目標(biāo)有極高的特異性及親和性，作用機(jī)制明確，因此被廣泛批準(zhǔn)應(yīng)用于臨床。如前列腺特異性膜抗原（Prostate-specific Membrane Antigen，PMSA）在前列腺癌的診斷、治療及預(yù)后評(píng)估等方面都發(fā)揮著重要作用，Liu等[11]應(yīng)用PMSA抗原抗體成功制備了Cy5.5-CTT-54.2特異性近紅外熒光探針，經(jīng)實(shí)驗(yàn)表明可被用于前列腺腫瘤的靶向體外光學(xué)成像。但是抗體分子量較大，影響了探針的組織穿透力，異種抗體容易誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生不良的免疫反應(yīng)，并且體內(nèi)代謝緩慢，這些缺點(diǎn)限制了其在臨床上的應(yīng)用[12]。為了改善上述不利因素，抗體片段被開(kāi)發(fā)應(yīng)用，大大改善了探針的藥代動(dòng)力學(xué)特性，但此類探針相對(duì)于完整的抗體，其制備工藝更加復(fù)雜，價(jià)格昂貴，目前臨床上應(yīng)用較少[13-14]。endprint

2.3.3.2 多肽 多肽是多個(gè)氨基酸殘基組成的肽段。小分子多肽有許多優(yōu)點(diǎn)：（1）易于化學(xué)合成，克服了抗體異源性問(wèn)題；（2）制備技術(shù)可控，能夠保證探針的物理化學(xué)及生物性能；（3）具有高度親和力；（4）分子量小，可以較容易地通過(guò)生理屏障，血液清除速度快[15-16]。因此小分子多肽可以作為理想的探針應(yīng)用于光學(xué)成像。有些腫瘤可以高表達(dá)某些受體，而表皮生長(zhǎng)因子（EGF）、奧曲肽等天然多肽能夠與這些受體特異性的結(jié)合，可用于腫瘤的檢測(cè)。王可錚等[17]用近紅外熒光染料Cy5.5標(biāo)記EGF合成了探針（Cy5.5-EGF），對(duì)乳腺癌裸鼠移植瘤模型進(jìn)行活體光學(xué)成像，表明探針Cy5.5-EGF可以與乳腺癌細(xì)胞表面的表皮生長(zhǎng)因子受體（EDFR）特異性結(jié)合而用于乳腺癌的靶向診斷。Lanzardo等[18]應(yīng)用近紅外熒光染料標(biāo)記RGD環(huán)肽作為光學(xué)探針，用來(lái)評(píng)價(jià)整合素αvβ3受體高表達(dá)的U87MG膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞移植裸鼠模型，體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)都證實(shí)，在U87MG細(xì)胞中RGD環(huán)肽與αvβ3整合素受體具有較高的特異性和親和力，表明NIRF-RGD能靈敏而特異地探測(cè)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤。但是隨著研究的深入，天然多肽已經(jīng)無(wú)法滿足分子影像學(xué)的需求，因此開(kāi)發(fā)針對(duì)不同腫瘤、不同表面抗原更具特異性的多肽已成為當(dāng)今研究的熱點(diǎn)。

Smith等[19]于1985年報(bào)道了外源多肽在單鏈?zhǔn)删w表面表達(dá)的現(xiàn)象，從而使噬菌體展示文庫(kù)技術(shù)成為篩選腫瘤特異性多肽重要的工具并迅速應(yīng)用。Chen等[20]應(yīng)用噬菌體展示文庫(kù)技術(shù)篩選得到惡性神經(jīng)膠質(zhì)瘤U87MG細(xì)胞系導(dǎo)向肽CGNSNPKSC九肽序列，命名為GX1，并用近紅外熒光染料Cy5.5標(biāo)記此多肽制備成了Cy5.5-CGNSNPKSC特異性光學(xué)分子探針，經(jīng)體內(nèi)體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)，該探針能特異性的與U87MG腫瘤結(jié)合，可用于惡性神經(jīng)膠質(zhì)瘤的靶向診斷。小分子多肽雖有許多優(yōu)點(diǎn)，但其在體內(nèi)易降解，部分靶點(diǎn)未知等缺點(diǎn)也是目前亟待解決的問(wèn)題。

2.3.3.3 小分子化合物 某些小分子化合物如葉酸、雙磷酸鹽等能夠和腫瘤細(xì)胞膜表面一些特異性受體靶向結(jié)合，可以作為特異性靶向探針的識(shí)別基團(tuán)。如葉酸受體（FR）可在大部分惡性腫瘤，如卵巢癌、子宮癌、睪丸癌、腎癌、結(jié)腸癌等表面過(guò)量表達(dá)，葉酸（FA）可與葉酸受體特異性結(jié)合從而用于檢測(cè)相關(guān)惡性腫瘤。鄧大偉等[21]成功制備了葉酸-PEG-ICG-Der-01近紅外熒光靶向探針，并與過(guò)度表達(dá)葉酸受體的腫瘤靶向結(jié)合，定位準(zhǔn)確，說(shuō)明該探針具有腫瘤靶向的特性，對(duì)腫瘤的早期診斷有十分重要的意義。但小分子化合物易受體內(nèi)原有分子的影響，顯像基團(tuán)標(biāo)記化合物后藥代動(dòng)力學(xué)可能會(huì)有改變。

3 靶向光學(xué)分子探針設(shè)計(jì)的基本原則

光學(xué)分子成像探針可以看作是藥物的一個(gè)亞類，因此傳統(tǒng)藥物設(shè)計(jì)時(shí)所用到的知識(shí)和經(jīng)驗(yàn)，可以用于光學(xué)分子成像探針的設(shè)計(jì)。分子探針的理化性質(zhì)，如電離常數(shù)（pKa值），脂溶性的和穩(wěn)定性，被普遍認(rèn)為是影響探針在體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)的關(guān)鍵因素，包括探針的吸收、分布、代謝和排泄。因此在成像探針的設(shè)計(jì)和開(kāi)發(fā)初期應(yīng)當(dāng)認(rèn)真考慮這些問(wèn)題。分子探針的電離作用和溶解度與細(xì)胞膜的通透性密切相關(guān)。許多分子成像探針含有不同的離子基團(tuán)，在生理pH值范圍內(nèi)帶有不同的電荷，分子探針的總電荷或電荷分布會(huì)影響其在體內(nèi)的溶解度，滲透性以及與活性位點(diǎn)的親和性。

3.1 生物特異性與生物活性策略 為了設(shè)計(jì)出靶向特異性光學(xué)分子探針，識(shí)別基團(tuán)應(yīng)當(dāng)能夠與靶向目標(biāo)特異性結(jié)合，而不與背景組織結(jié)合[22]。而且由于分子探針結(jié)構(gòu)中既包括核心部分識(shí)別基團(tuán)，也包括連接基團(tuán)和報(bào)告基團(tuán)，合成后得到的分子探針其生物學(xué)特性可能發(fā)生改變。因此在合成探針以前，應(yīng)當(dāng)對(duì)探針結(jié)構(gòu)的各個(gè)組成部分與生物活性之間進(jìn)行構(gòu)效關(guān)系研究，在不改變探針各部分生物學(xué)活性的情況下再進(jìn)行探針的合成[7]。

3.2 藥代動(dòng)力學(xué)策略 傳統(tǒng)的靶向分子探針無(wú)論是否與靶向目標(biāo)結(jié)合均能發(fā)出信號(hào)，導(dǎo)致目標(biāo)-背景信噪比較低，成像效果不佳，必須經(jīng)過(guò)一段時(shí)間的代謝，大部分未結(jié)合的游離探針被機(jī)體清除后，目標(biāo)-背景信噪比增強(qiáng)，才能達(dá)到最佳成像效果[6]。應(yīng)用此類探針需要設(shè)法盡快洗去未結(jié)合的探針，使游離探針的清除時(shí)間盡量縮短，但在實(shí)際操作中并不容易做到。新型的“可激活”靶向分子探針只有與靶向目標(biāo)特異性結(jié)合之后才發(fā)出信號(hào)，因此可以有更長(zhǎng)的清除時(shí)間，使探針在靶向組織或細(xì)胞中充分富集，目標(biāo)-背景信噪比可增加數(shù)百倍。例如，利用單克隆抗體IgG合成傳統(tǒng)的靶向分子探針，其清除時(shí)間較長(zhǎng)，導(dǎo)致了高背景信號(hào)和低目標(biāo)-背景信噪比。然而，應(yīng)用同樣的單克隆抗體IgG，與可激活信號(hào)載體結(jié)合后，即使未結(jié)合的探針仍然在循環(huán)中卻依然可以達(dá)到高目標(biāo)-背景信噪比。

光學(xué)分子探針在進(jìn)行體外實(shí)驗(yàn)時(shí)通常具有較好的靶向性，但是在體內(nèi)應(yīng)用往往效果不佳，這是因?yàn)闄C(jī)體是一個(gè)非常精密的系統(tǒng)，許多復(fù)雜的防御機(jī)制會(huì)阻礙外源性分子在體內(nèi)發(fā)揮作用。因此，理想的光學(xué)分子探針必須能夠穿過(guò)生理或藥理學(xué)屏障，以合適的濃度到達(dá)特定靶向目標(biāo)并滯留一定的時(shí)間，以便在體外被光學(xué)成像手段檢測(cè)到。首先，探針必須在體內(nèi)循環(huán)中保持活性并避免被網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)（RES）攝??；其次，探針必須能夠到達(dá)靶組織內(nèi)并在此富集；最后，如果探針的作用靶點(diǎn)在細(xì)胞內(nèi)部，那么探針必須能夠穿透細(xì)胞膜。

4 靶向光學(xué)分子探針的結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)

靶向光學(xué)分子探針的結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)可以用（圖1）來(lái)表示。最常見(jiàn)的方式是識(shí)別基團(tuán)通過(guò)一個(gè)連接基團(tuán)與報(bào)告基團(tuán)相連（圖1a），而且一種識(shí)別基團(tuán)可以同時(shí)連接幾個(gè)報(bào)告基團(tuán)形成分子探針進(jìn)行多模態(tài)分子成像[23]。另外，多個(gè)識(shí)別基團(tuán)與一個(gè)或多個(gè)報(bào)告基團(tuán)連接后能與多個(gè)靶向目標(biāo)特異性結(jié)合，此類探針可用于多靶向分子成像[24]。此外，許多有機(jī)或無(wú)機(jī)的納米顆?？梢酝瑫r(shí)作為識(shí)別基團(tuán)和運(yùn)輸載體來(lái)行使功能[25]。最新研究證實(shí)，碳納米管經(jīng)表面功能化處理后，具有可以攜帶蛋白質(zhì)、核酸片段及小肽段等生物分子進(jìn)入細(xì)胞的能力，是一種非常有前途的運(yùn)載工具。周非凡等[26]以單壁碳納米管（SWNT）作為載體和光吸收劑，制備了SWNT-PEG-mAb靶向性光熱轉(zhuǎn)換探針，經(jīng)體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證實(shí)該探針可以進(jìn)入靶細(xì)胞內(nèi)，從而達(dá)到靶向殺傷腫瘤細(xì)胞，降低正常組織損傷的目的。此外，識(shí)別基團(tuán)和報(bào)告基團(tuán)還可以被耦合到納米顆粒表面或內(nèi)部來(lái)改善探針的信號(hào)敏感性和光穩(wěn)定性[27]。第二種方式是兩種報(bào)告基團(tuán)連接一種識(shí)別基團(tuán)（圖1b），可激活探針或智能探針屬于此類探針?lè)懂燵28]，智能探針結(jié)構(gòu)中距離較近的兩個(gè)報(bào)告基團(tuán)可能會(huì)導(dǎo)致自淬滅（Self-quenching），當(dāng)探針到達(dá)靶向目標(biāo)后被相應(yīng)的酶激活才會(huì)發(fā)出熒光信號(hào)。第三種方式是一種報(bào)告基團(tuán)作為核心，兩種或多種識(shí)別基團(tuán)與其連接（圖1c）?？偟膩?lái)說(shuō)，探針設(shè)計(jì)方式的選擇是由多種因素共同決定的，包括具體的靶向目標(biāo)以及所采用的成像方式等，為了合成理想的靶向特異性光學(xué)分子探針，探針的每一個(gè)組成部分都必須認(rèn)真考慮。endprint

5 小結(jié)與展望

光學(xué)分子成像是近些年來(lái)快速發(fā)展的一項(xiàng)新興的技術(shù)，也是未來(lái)影像學(xué)研究的熱點(diǎn)。雖然靶向性探針目前仍然存在著如探針的安全性、穩(wěn)定性及組織相容性等許多問(wèn)題，在臨床上的應(yīng)用尚不多，但隨著新型的光學(xué)分子探針會(huì)不斷設(shè)計(jì)合成，光學(xué)成像技術(shù)一定會(huì)日益成熟，并最終應(yīng)用于臨床，在腫瘤的早期診斷、早期治療和治療效果監(jiān)測(cè)等方面做出巨大貢獻(xiàn)。

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（收稿日期：2013-10-14） （本文編輯：歐麗）endprint

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