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    堿性裂解液提取DNA法在環(huán)氧化酶亞型基因敲除小鼠基因型鑒定中的應(yīng)用

    2014-03-20 10:16:42李振華等

    李振華等

    【摘要】 目的:應(yīng)用堿性裂解液法提取的DNA鑒定環(huán)氧化酶(COX)亞型基因敲除小鼠,為鑒定純合子小鼠提供一種方便快捷、低成本、可靠的實(shí)驗(yàn)方法。方法:取子代小鼠耳緣組織于EP管中,用堿性裂解液提取基因組DNA,PCR擴(kuò)增COX-1和COX-2基因片段,通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳對(duì)小鼠基因型作出鑒定。結(jié)果:堿性裂解液法提取的DNA能應(yīng)用于子代小鼠的不同基因型的鑒定,即野生型(COX-1+/+;COX-2+/+)、雜合子(COX-1+/-;COX-2+/-)和純合子(COX-1-/-;COX-2-/-)。結(jié)論:建立了堿性裂解液提取DNA法,并將該法成功應(yīng)用于環(huán)氧化酶亞型基因敲除小鼠基因型鑒定中。

    【關(guān)鍵詞】 堿性裂解液; 環(huán)氧化酶; 基因敲除小鼠

    環(huán)氧化酶(COX)催化花生四烯酸(arachidonic acid,AA)產(chǎn)生前列腺素類物質(zhì),其中在心血管系統(tǒng)主要是前列環(huán)素(PGI2)和血栓烷A2(TxA2),COX作為AA代謝中主要的關(guān)鍵限速酶之一,在心血管方面發(fā)揮重要的病理生理作用[1]。COX主要包括COX-1和COX-2兩種亞型,由于現(xiàn)階段COX亞型選擇性抑制劑存在著非特異性作用,因此基因敲除小鼠對(duì)進(jìn)一步明確COX亞型的生理及病理生理功能具有重要作用,進(jìn)而建立COX亞型基因敲除小鼠的鑒定方法也就尤為重要[2]。目前,國(guó)內(nèi)基因敲除小鼠鑒定中DNA的提取主要有兩種方法,第一種即采用蛋白酶K消化后用經(jīng)典酚氯仿提取法:通過(guò)有機(jī)溶劑抽提,去除蛋白、多糖、酚類等雜質(zhì),再加入乙醇即可使DNA分離出來(lái);第二種即基因組DNA試劑盒提取法:通過(guò)裂解細(xì)胞釋放出基因組DNA,然后加入核糖核酸酶A去除RNA,接著選擇性沉淀去除蛋白,最后通過(guò)異丙醇沉淀并重溶解于DNA溶解液[3-4]。堿性裂解液提取DNA法鮮見(jiàn)報(bào)道。因此,本實(shí)驗(yàn)將建立一種用堿性裂解液提取DNA的方法,為COX亞型基因敲除小鼠鑒定提供更為方便、經(jīng)濟(jì)、快速的方法[5]。

    1 資料與方法

    1.1 一般資料 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物:COX亞型基因敲除小鼠引進(jìn)于北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部生理系,基因背景為COX-1+/-的雜合子小鼠2雌1雄,基因背景為COX-2+/-的雜合子小鼠2雌1雄,共6只。試劑:PCR試劑盒、DNA marker購(gòu)自大連寶生物工程有限公司;PCR引物由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成;重要溶液地配制:溶液A,即NaOH溶液,成分為25 mmol/L NaOH、2 mmol/L EDTA,溶液B的成分為40 mmol/L Tris·HCl,pH值為8.0。儀器:干式恒溫器(奧盛儀器有限公司,中國(guó)),PCR擴(kuò)增儀(ABI公司,美國(guó)),電泳儀(北京六一儀器廠,中國(guó))。

    1.2 方法

    1.2.1 基因組DNA提取 COX基因敲除小鼠按照SPF級(jí)動(dòng)物飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行飼養(yǎng)。溫度控制在22 ℃,光照周期為12 h黑暗,12 h光照;籠具、墊料、飼料和飲水均經(jīng)過(guò)高溫高壓滅菌處理后使用;自由取食和飲水,墊料一周更換兩次。采用1雄和2雌合籠方式進(jìn)行繁殖。在子代小鼠斷乳打耳號(hào)進(jìn)行標(biāo)記時(shí),留取小鼠耳緣組織于1.5 mL EP管中,加入100 μL溶液A,于干式恒溫器100 ℃孵育30 min。再加入100 μL溶液B,充分震蕩混勻、離心,放入4 ℃冰箱備用。

    1.2.2 基因組DNA擴(kuò)增 (1)COX-1引物序列:WT-S:

    5-AGGAGATGGCTGCTGAGTTGG-3,KO-S:5-GCAGCCTCTGTTCCACATACAC-3,WT/KO-AS:5-AATCTGACTTTCTGAGTTGCC-3。目的基因片段長(zhǎng)度為601 bp。各種基因型小鼠擴(kuò)增片段為:COX-1-/-:646 bp;COX-1+/-:601 bp和646 bp;COX-1+/+:601 bp。COX-2引物序列:WT-S:5-ACACACTCTATCACTGGCACC-3,KO-S:5-ACGCGTCACCTTAATATGCG-3,WT/KO-AS:5-ATCCCTTCACTAAATGCCCTC-3。目的基因片段長(zhǎng)度為905 bp。各種基因型小鼠擴(kuò)增片段為:COX-2-/-:905 bp;COX-2+/-:760 bp和905 bp;COX-2+/+:760 bp。(2)PCR體系:2× Go Taq Green Master Mix 12.5 μL,引物WT-S(10 μmol/L)2.5 μL,引物KO-S(10 μmol/L)2.5 μL,引物WT/KO-AS(10 μmol/L)2.5 μL, 耳緣DNA模板樣品1.5 μL,ddH2O補(bǔ)足25 μL。(3)COX-1反應(yīng)條件:①預(yù)變性94 ℃,5 min;②變性94 ℃,30 s;③退火56 ℃,30 s;④延伸72 ℃,30 s,重復(fù)步驟②~④40次循環(huán);⑤最后延伸72 ℃,7 min;⑥4 ℃保存。(4)COX-2反應(yīng)條件:①預(yù)變性94 ℃,5 min;②變性94 ℃,45 s;③退火56 ℃,45 s;④延伸72 ℃,45 s,重復(fù)步驟②~④35次循環(huán);

    ⑤最后延伸72 ℃,7 min;⑥4 ℃保存。

    1.2.3 瓊脂糖凝膠電泳 用TBE緩沖液配制1.2%瓊脂糖凝膠,待60 ℃左右加入溴化乙啶 (EB) 2 μL (10 mg/mL),混勻后,倒入凝膠板鋪板,室溫放置30 min,待凝膠完全凝固后放入電泳槽,加入PCR產(chǎn)物10 μL于點(diǎn)樣孔,調(diào)節(jié)電泳電壓為100 V,電泳40 min后,觀察結(jié)果。

    2 結(jié)果

    COX-1子代基因鑒定部分結(jié)果如圖1所示,凝膠最左側(cè)為Marker,編號(hào)2、5、6可見(jiàn)大小為646 bp左右的條帶,為純合子;編號(hào)1、3、4、7可見(jiàn)大小為646 bp和601 bp左右的條帶,為雜合子;編號(hào)8可見(jiàn)大小為601 bp左右的條帶,為野生型。

    COX-2子代基因鑒定部分結(jié)果如圖2所示,凝膠最左側(cè)為Maker,編號(hào)3可見(jiàn)大小為905 bp左右的條帶,為純合子;編號(hào)1、2、4可見(jiàn)大小為905 bp和760 bp左右的條帶,為雜合子;編號(hào)5可見(jiàn)大小為760 bp左右的條帶,為野生型。

    3 討論

    小鼠基因敲除技術(shù)是研究整體動(dòng)物水平基因功能的一種直接有效方法,通過(guò)基因敲除動(dòng)物,可以直接分析被敲除基因的功能和作用[6]。目前,心血管系統(tǒng)中COX亞型的生理功能及其在病理狀態(tài)下的變化尚需進(jìn)一步明確。一般認(rèn)為,COX-1為結(jié)構(gòu)型,主要表達(dá)于正常組織,在維持腎臟血流和調(diào)節(jié)血小板聚集中具有重要作用[7]。COX-2為誘導(dǎo)型,又稱“炎癥反應(yīng)基因”,正常生理狀態(tài)下幾乎不表達(dá)或少表達(dá),當(dāng)受到刺激后便迅速表達(dá)合成,參與多種病理生理過(guò)程[8]。深入研究COX在心血管系統(tǒng)的作用機(jī)制,有助于明確各種心血管疾病的發(fā)生發(fā)展機(jī)制[9]。

    為了進(jìn)一步確定COX-1和COX-2基因在心血管病理生理方面的功能和作用,本實(shí)驗(yàn)室引進(jìn)了COX-1和COX-2基因敲除小鼠雜合子,嚴(yán)格按照SPF級(jí)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行小鼠的飼養(yǎng)和繁殖,由于雜合子交配所產(chǎn)生的子代可能出現(xiàn)3種基因型,即野生型(COX-1+/+;COX-2+/+)、雜合子(COX-1+/-;COX-2+/-)和純合子(COX-1-/-;COX-2-/-),故必須對(duì)其子代進(jìn)行基因鑒定,從而分辨出純合子用于實(shí)驗(yàn)研究。經(jīng)典酚氯仿提取法雖然用的都是實(shí)驗(yàn)室常用試劑,但是較堿性裂解液提取法費(fèi)時(shí)費(fèi)力,而且苯酚和氯仿還有一定毒性作用;試劑盒提取法提純效率和純度都比較高,但相比堿性裂解液提取法而言費(fèi)用較高,且過(guò)程較之復(fù)雜。因此,本實(shí)驗(yàn)所采用的堿性裂解液提取法相比于經(jīng)典酚氯仿提取法、試劑盒提取法具有處理過(guò)程簡(jiǎn)單、快捷、省時(shí)且經(jīng)濟(jì)等優(yōu)點(diǎn)。通過(guò)對(duì)不同亞型的COX基因的鑒定,驗(yàn)證了該方法的可靠性。同時(shí),在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中筆者亦觀察到:COX-1-/-雌鼠能懷孕但不能夠分娩,而COX-2-/-雌鼠不能夠受孕,與之前報(bào)道的結(jié)果一致[10]。故在COX基因亞型敲除小鼠繁殖過(guò)程中應(yīng)采用雜合子雌鼠作為母鼠,才能得到純合子的子鼠用于實(shí)驗(yàn)。

    綜上所述,堿性裂解液提取DNA法能很好地應(yīng)用在不同基因型的COX基因亞型敲除小鼠的鑒定中,為基因敲除小鼠鑒定提供了一種便捷、可靠的方法。通過(guò)一段時(shí)間的繁育及鑒定,得到較多純合子小鼠,為本實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行COX亞型對(duì)心血管疾病發(fā)生發(fā)展機(jī)制的研究提供了必要的條件。

    參考文獻(xiàn)

    [1] Félétou M, Huang Y, Vanhoutte P M. Endothelium-mediated control of vascular tone: COX-1 and COX-2 products[J]. Br J Pharmacol, 2011, 164(3):894-912.

    [2]張子房,唐煒,尹江濤.環(huán)氧化酶-2、p53和Bcl-2在胃癌組織中的表達(dá)及其意義[J].中國(guó)醫(yī)學(xué)創(chuàng)新,2009,6(17):12-15.

    [3]董子龍,莊然,張宇絲,等.PTA-1-/-/ApoE-/-雙基因敲除小鼠的繁育及基因型鑒定[J].實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué),2012,29(5):6-8.

    [4]杜智勇,粟永萍,楊天德,等.類固醇受體輔活化子-1基因敲除小鼠的繁殖與篩選[J].重慶醫(yī)學(xué),2007,36(4):326-327.

    [5] Zhang Y H,Huang B L,Eastman K,et al.Mouth cell collection device for newborn mice[J]. Mol Genet Metab,2006,89(12):164-167.

    [6]趙國(guó)陽(yáng),李光飛,徐又佳.基因敲除技術(shù)在骨質(zhì)疏松相關(guān)基因研究中的應(yīng)用[J].中國(guó)骨質(zhì)疏松雜志,2011,17(8):748-752.

    [7]王燕杰.環(huán)氧合酶及其抑制劑與宮頸癌的關(guān)系[J].中國(guó)臨床醫(yī)學(xué),2012,19(6):703-704.

    [8]張一弛,牟艷玲,解硯英.COX-2與糖尿病并發(fā)癥關(guān)系[J].研究進(jìn)展生命科學(xué),2012,24(1):63-68.

    [9]蔣躍絨,殷惠軍,陳可冀.環(huán)氧合酶與心血管疾病[J].心血管病學(xué)進(jìn)展,2006,27(5):627-630.

    [10] St-Louis I, Singh M, Brasseur K,et al.Expression of COX-1 and COX-2 in the endometrium of cyclic,pregnant and in a model of pseudopregnant rats and their regulation by sex steroids[J]. Reprod Biol Endocrinol,2010,24(8):103.

    (收稿日期:2013-11-13) (本文編輯:黃新珍)

    COX-2子代基因鑒定部分結(jié)果如圖2所示,凝膠最左側(cè)為Maker,編號(hào)3可見(jiàn)大小為905 bp左右的條帶,為純合子;編號(hào)1、2、4可見(jiàn)大小為905 bp和760 bp左右的條帶,為雜合子;編號(hào)5可見(jiàn)大小為760 bp左右的條帶,為野生型。

    3 討論

    小鼠基因敲除技術(shù)是研究整體動(dòng)物水平基因功能的一種直接有效方法,通過(guò)基因敲除動(dòng)物,可以直接分析被敲除基因的功能和作用[6]。目前,心血管系統(tǒng)中COX亞型的生理功能及其在病理狀態(tài)下的變化尚需進(jìn)一步明確。一般認(rèn)為,COX-1為結(jié)構(gòu)型,主要表達(dá)于正常組織,在維持腎臟血流和調(diào)節(jié)血小板聚集中具有重要作用[7]。COX-2為誘導(dǎo)型,又稱“炎癥反應(yīng)基因”,正常生理狀態(tài)下幾乎不表達(dá)或少表達(dá),當(dāng)受到刺激后便迅速表達(dá)合成,參與多種病理生理過(guò)程[8]。深入研究COX在心血管系統(tǒng)的作用機(jī)制,有助于明確各種心血管疾病的發(fā)生發(fā)展機(jī)制[9]。

    為了進(jìn)一步確定COX-1和COX-2基因在心血管病理生理方面的功能和作用,本實(shí)驗(yàn)室引進(jìn)了COX-1和COX-2基因敲除小鼠雜合子,嚴(yán)格按照SPF級(jí)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行小鼠的飼養(yǎng)和繁殖,由于雜合子交配所產(chǎn)生的子代可能出現(xiàn)3種基因型,即野生型(COX-1+/+;COX-2+/+)、雜合子(COX-1+/-;COX-2+/-)和純合子(COX-1-/-;COX-2-/-),故必須對(duì)其子代進(jìn)行基因鑒定,從而分辨出純合子用于實(shí)驗(yàn)研究。經(jīng)典酚氯仿提取法雖然用的都是實(shí)驗(yàn)室常用試劑,但是較堿性裂解液提取法費(fèi)時(shí)費(fèi)力,而且苯酚和氯仿還有一定毒性作用;試劑盒提取法提純效率和純度都比較高,但相比堿性裂解液提取法而言費(fèi)用較高,且過(guò)程較之復(fù)雜。因此,本實(shí)驗(yàn)所采用的堿性裂解液提取法相比于經(jīng)典酚氯仿提取法、試劑盒提取法具有處理過(guò)程簡(jiǎn)單、快捷、省時(shí)且經(jīng)濟(jì)等優(yōu)點(diǎn)。通過(guò)對(duì)不同亞型的COX基因的鑒定,驗(yàn)證了該方法的可靠性。同時(shí),在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中筆者亦觀察到:COX-1-/-雌鼠能懷孕但不能夠分娩,而COX-2-/-雌鼠不能夠受孕,與之前報(bào)道的結(jié)果一致[10]。故在COX基因亞型敲除小鼠繁殖過(guò)程中應(yīng)采用雜合子雌鼠作為母鼠,才能得到純合子的子鼠用于實(shí)驗(yàn)。

    綜上所述,堿性裂解液提取DNA法能很好地應(yīng)用在不同基因型的COX基因亞型敲除小鼠的鑒定中,為基因敲除小鼠鑒定提供了一種便捷、可靠的方法。通過(guò)一段時(shí)間的繁育及鑒定,得到較多純合子小鼠,為本實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行COX亞型對(duì)心血管疾病發(fā)生發(fā)展機(jī)制的研究提供了必要的條件。

    參考文獻(xiàn)

    [1] Félétou M, Huang Y, Vanhoutte P M. Endothelium-mediated control of vascular tone: COX-1 and COX-2 products[J]. Br J Pharmacol, 2011, 164(3):894-912.

    [2]張子房,唐煒,尹江濤.環(huán)氧化酶-2、p53和Bcl-2在胃癌組織中的表達(dá)及其意義[J].中國(guó)醫(yī)學(xué)創(chuàng)新,2009,6(17):12-15.

    [3]董子龍,莊然,張宇絲,等.PTA-1-/-/ApoE-/-雙基因敲除小鼠的繁育及基因型鑒定[J].實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué),2012,29(5):6-8.

    [4]杜智勇,粟永萍,楊天德,等.類固醇受體輔活化子-1基因敲除小鼠的繁殖與篩選[J].重慶醫(yī)學(xué),2007,36(4):326-327.

    [5] Zhang Y H,Huang B L,Eastman K,et al.Mouth cell collection device for newborn mice[J]. Mol Genet Metab,2006,89(12):164-167.

    [6]趙國(guó)陽(yáng),李光飛,徐又佳.基因敲除技術(shù)在骨質(zhì)疏松相關(guān)基因研究中的應(yīng)用[J].中國(guó)骨質(zhì)疏松雜志,2011,17(8):748-752.

    [7]王燕杰.環(huán)氧合酶及其抑制劑與宮頸癌的關(guān)系[J].中國(guó)臨床醫(yī)學(xué),2012,19(6):703-704.

    [8]張一弛,牟艷玲,解硯英.COX-2與糖尿病并發(fā)癥關(guān)系[J].研究進(jìn)展生命科學(xué),2012,24(1):63-68.

    [9]蔣躍絨,殷惠軍,陳可冀.環(huán)氧合酶與心血管疾病[J].心血管病學(xué)進(jìn)展,2006,27(5):627-630.

    [10] St-Louis I, Singh M, Brasseur K,et al.Expression of COX-1 and COX-2 in the endometrium of cyclic,pregnant and in a model of pseudopregnant rats and their regulation by sex steroids[J]. Reprod Biol Endocrinol,2010,24(8):103.

    (收稿日期:2013-11-13) (本文編輯:黃新珍)

    COX-2子代基因鑒定部分結(jié)果如圖2所示,凝膠最左側(cè)為Maker,編號(hào)3可見(jiàn)大小為905 bp左右的條帶,為純合子;編號(hào)1、2、4可見(jiàn)大小為905 bp和760 bp左右的條帶,為雜合子;編號(hào)5可見(jiàn)大小為760 bp左右的條帶,為野生型。

    3 討論

    小鼠基因敲除技術(shù)是研究整體動(dòng)物水平基因功能的一種直接有效方法,通過(guò)基因敲除動(dòng)物,可以直接分析被敲除基因的功能和作用[6]。目前,心血管系統(tǒng)中COX亞型的生理功能及其在病理狀態(tài)下的變化尚需進(jìn)一步明確。一般認(rèn)為,COX-1為結(jié)構(gòu)型,主要表達(dá)于正常組織,在維持腎臟血流和調(diào)節(jié)血小板聚集中具有重要作用[7]。COX-2為誘導(dǎo)型,又稱“炎癥反應(yīng)基因”,正常生理狀態(tài)下幾乎不表達(dá)或少表達(dá),當(dāng)受到刺激后便迅速表達(dá)合成,參與多種病理生理過(guò)程[8]。深入研究COX在心血管系統(tǒng)的作用機(jī)制,有助于明確各種心血管疾病的發(fā)生發(fā)展機(jī)制[9]。

    為了進(jìn)一步確定COX-1和COX-2基因在心血管病理生理方面的功能和作用,本實(shí)驗(yàn)室引進(jìn)了COX-1和COX-2基因敲除小鼠雜合子,嚴(yán)格按照SPF級(jí)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行小鼠的飼養(yǎng)和繁殖,由于雜合子交配所產(chǎn)生的子代可能出現(xiàn)3種基因型,即野生型(COX-1+/+;COX-2+/+)、雜合子(COX-1+/-;COX-2+/-)和純合子(COX-1-/-;COX-2-/-),故必須對(duì)其子代進(jìn)行基因鑒定,從而分辨出純合子用于實(shí)驗(yàn)研究。經(jīng)典酚氯仿提取法雖然用的都是實(shí)驗(yàn)室常用試劑,但是較堿性裂解液提取法費(fèi)時(shí)費(fèi)力,而且苯酚和氯仿還有一定毒性作用;試劑盒提取法提純效率和純度都比較高,但相比堿性裂解液提取法而言費(fèi)用較高,且過(guò)程較之復(fù)雜。因此,本實(shí)驗(yàn)所采用的堿性裂解液提取法相比于經(jīng)典酚氯仿提取法、試劑盒提取法具有處理過(guò)程簡(jiǎn)單、快捷、省時(shí)且經(jīng)濟(jì)等優(yōu)點(diǎn)。通過(guò)對(duì)不同亞型的COX基因的鑒定,驗(yàn)證了該方法的可靠性。同時(shí),在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中筆者亦觀察到:COX-1-/-雌鼠能懷孕但不能夠分娩,而COX-2-/-雌鼠不能夠受孕,與之前報(bào)道的結(jié)果一致[10]。故在COX基因亞型敲除小鼠繁殖過(guò)程中應(yīng)采用雜合子雌鼠作為母鼠,才能得到純合子的子鼠用于實(shí)驗(yàn)。

    綜上所述,堿性裂解液提取DNA法能很好地應(yīng)用在不同基因型的COX基因亞型敲除小鼠的鑒定中,為基因敲除小鼠鑒定提供了一種便捷、可靠的方法。通過(guò)一段時(shí)間的繁育及鑒定,得到較多純合子小鼠,為本實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行COX亞型對(duì)心血管疾病發(fā)生發(fā)展機(jī)制的研究提供了必要的條件。

    參考文獻(xiàn)

    [1] Félétou M, Huang Y, Vanhoutte P M. Endothelium-mediated control of vascular tone: COX-1 and COX-2 products[J]. Br J Pharmacol, 2011, 164(3):894-912.

    [2]張子房,唐煒,尹江濤.環(huán)氧化酶-2、p53和Bcl-2在胃癌組織中的表達(dá)及其意義[J].中國(guó)醫(yī)學(xué)創(chuàng)新,2009,6(17):12-15.

    [3]董子龍,莊然,張宇絲,等.PTA-1-/-/ApoE-/-雙基因敲除小鼠的繁育及基因型鑒定[J].實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué),2012,29(5):6-8.

    [4]杜智勇,粟永萍,楊天德,等.類固醇受體輔活化子-1基因敲除小鼠的繁殖與篩選[J].重慶醫(yī)學(xué),2007,36(4):326-327.

    [5] Zhang Y H,Huang B L,Eastman K,et al.Mouth cell collection device for newborn mice[J]. Mol Genet Metab,2006,89(12):164-167.

    [6]趙國(guó)陽(yáng),李光飛,徐又佳.基因敲除技術(shù)在骨質(zhì)疏松相關(guān)基因研究中的應(yīng)用[J].中國(guó)骨質(zhì)疏松雜志,2011,17(8):748-752.

    [7]王燕杰.環(huán)氧合酶及其抑制劑與宮頸癌的關(guān)系[J].中國(guó)臨床醫(yī)學(xué),2012,19(6):703-704.

    [8]張一弛,牟艷玲,解硯英.COX-2與糖尿病并發(fā)癥關(guān)系[J].研究進(jìn)展生命科學(xué),2012,24(1):63-68.

    [9]蔣躍絨,殷惠軍,陳可冀.環(huán)氧合酶與心血管疾病[J].心血管病學(xué)進(jìn)展,2006,27(5):627-630.

    [10] St-Louis I, Singh M, Brasseur K,et al.Expression of COX-1 and COX-2 in the endometrium of cyclic,pregnant and in a model of pseudopregnant rats and their regulation by sex steroids[J]. Reprod Biol Endocrinol,2010,24(8):103.

    (收稿日期:2013-11-13) (本文編輯:黃新珍)

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