熱刺激介導(dǎo)兔關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞凋亡的實驗研究

張振雨，葉偉，王軍義，盧延霆，陳輝

(1.河南省濮陽市人民醫(yī)院骨科，河南 濮陽 457000；2.中山大學(xué)附屬第二醫(yī)院骨科，廣東 廣州 510120)

熱刺激療法是殺死惡性骨腫瘤細(xì)胞一種有效方便的方法。這種方法曾被報道，用巴斯消毒液在60℃ 30 min可以殺死腫瘤細(xì)胞并且被處理的骨的機械強度幾乎與新鮮骨一樣[1]，此外，臨床上的調(diào)查顯示用這種方法進行骨骼重建取得了很好的效果[2]。

當(dāng)用微波介導(dǎo)的熱療法處理膝關(guān)節(jié)附近惡性骨腫瘤時，也能損傷骺板[3]，在這一發(fā)現(xiàn)的基礎(chǔ)上，熱刺激可能破壞關(guān)節(jié)軟骨包括軟骨細(xì)胞的加速凋亡、壞死以及細(xì)胞基質(zhì)的衰變，并隨著軟骨細(xì)胞減少和細(xì)胞基質(zhì)的衰變最終出現(xiàn)骨關(guān)節(jié)炎。

熱刺激對關(guān)節(jié)軟骨的療效還沒有充分的研究清楚，軟骨細(xì)胞的凋亡是細(xì)胞死亡的一種形式，是骨關(guān)節(jié)炎發(fā)病的機制之一。軟骨細(xì)胞凋亡在骨關(guān)節(jié)炎動物模型和人的骨性關(guān)節(jié)炎中被證實[4，5]。根據(jù)目前的研究，我們設(shè)計了熱刺激后兔關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞對熱刺激的反應(yīng)。

1 資料與方法

1.1 關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞的獲取與分離 新西蘭大白兔4只，未分雌雄，體重2～2.5 kg，備皮后，空氣栓塞處死。術(shù)野碘伏消毒、鋪無菌手術(shù)巾后取出關(guān)節(jié)軟骨。放入無菌取材盒內(nèi)，轉(zhuǎn)移到超凈臺操作。小心剪碎軟骨，放入盛有無血清培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中，用含有50 μg/mL慶大霉素及100 μg/mL制霉菌素雙抗液的PBS緩沖液沖洗3次，將軟骨剪至1 mm3大小的碎塊，轉(zhuǎn)移到25 mL的離心管中，加入0.25%胰蛋白酶5 mL，37℃攪拌下培養(yǎng)30 min，去除胰酶，5 mL PBS沖洗2次；加入0.2% Ⅱ型膠原酶2 mL，5 min后去除上清，再加入4 mL 0.2% Ⅱ型膠原酶4 mL 37℃振蕩培養(yǎng)30 min，去除上清，再加入4 mL 0.2% Ⅱ型膠原酶37℃振蕩培養(yǎng)90 min，收集上清，將上清液600 g離心8 min，去除上清液加入8 mL DMEM/F-12培養(yǎng)基吹打均勻，180 g離心1 min去除雜質(zhì)，將上清液移至另一離心管中600 g離心10 min得到關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞，去除上清，再加入8 mL DMEM/F-12培養(yǎng)基吹打均勻后轉(zhuǎn)移到75 cm2培養(yǎng)瓶中在37℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。原代關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞大概1周左右貼壁，之后每3天換液1次，按時在倒置顯微鏡觀察、拍照。細(xì)胞增殖融合為單層幾乎覆蓋瓶底時用0.25%胰蛋白酶消化并進行細(xì)胞傳代。

1.2 熱刺激處理 將體外培養(yǎng)的關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞接種到放有蓋玻片的六孔培養(yǎng)板中在相同的條件下培養(yǎng)，105/mL密度接種，細(xì)胞貼壁后分成兩組：對照組6孔，實驗組6孔，實驗組放到(48.0±0.1)℃水浴箱中孵育10 min，同時對照組在(37.0±0.1)℃水浴箱中孵育10 min。熱刺激和對照處理后立即換液，然后放回到含95%空氣、5%CO2、37℃的孵育箱中培養(yǎng)，在0.5 h、1 h、3 h、5 h取出蓋玻片固定并作細(xì)胞分析。未處理組6孔，不作任何處理。

1.3 細(xì)胞凋亡分析 檢測細(xì)胞的凋亡我們用脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的缺口末端標(biāo)記法(terminal deoxynucleotidyl transferase duTP nick end labeling，TUNEL)，取第二代細(xì)胞爬片用新鮮配制的4%多聚甲醛固定1 h，3% H2O2甲醇溶液滅火內(nèi)源性過氧化物酶10 min，用0.1% Triton X-100溶液4℃浸泡2 min，滴加混合復(fù)合液后37℃避光潮濕的孵育箱孵育1 h，滴加POD 37℃孵育30 min，DAB顯色劑，鏡下控制顯色，蘇木素輕度復(fù)染，并設(shè)對照。梯度脫水、中性樹脂封片。

1.4 電鏡分析 試驗組和對照組的細(xì)胞用含2.5%戊二醛0.2M PBS pH=7.6的溶液中4℃固定2 h，0.1M PBS沖洗，再放置于1%四氧化鋨0.2M PBS的溶液中2 h，乙醇梯度脫水包埋與多聚四氧化鋨中。做1 μm厚的切片，甲苯胺藍(lán)染色后在光學(xué)顯微鏡下辨別關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞區(qū)，制備超薄切片60 μm，在透射電鏡觀察前用醋酸雙氧鈾和枸櫞酸鉛染色。

1.5 免疫細(xì)胞化學(xué)染色 將細(xì)胞爬片用4%的多聚甲醛固定20 min，0.01% PBS溶液沖洗，0.3%過氧化氫溶液浸泡切片10 min滅火內(nèi)源性過氧化物酶，用0.03% PBS溶液沖洗，正常山羊血清室溫封閉20 min，滴加1∶150稀釋的caspase-3多克隆抗體，4℃孵育過夜，滴加生物素化二抗，室溫孵育20 min，滴加SABC室溫20 min，滴加DAB顯色劑，鏡下控制顯色。沖洗、脫水、封片，最后檢測關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞caspase-3的表達(dá)情況。

1.6 圖像及統(tǒng)計學(xué)分析 我們用MacintoshⅡ圖像分析系統(tǒng)對免疫細(xì)胞化學(xué)染色圖片進行分析。公式：PU=100×|GA-Ga|/Gmax。式中PU所選區(qū)域的陽性單位，GA、Ga分別為待測結(jié)構(gòu)A和背景色a的平均灰度；Gmax=255為檢測儀器的最大灰度[6]。各組之間采用非配對資料t檢驗統(tǒng)計分析。

2 結(jié) 果

2.1 TUNEL分析結(jié)果 染色法觀察關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞凋亡，實驗組中，關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞凋亡明顯，細(xì)胞核被染成棕褐色，染色質(zhì)濃縮，細(xì)胞核縮小，偶爾可見到凋亡小體，在熱刺激后不同的時間點細(xì)胞凋亡程度不同，3 h左右呈現(xiàn)一個細(xì)胞凋亡高峰，凋亡率為(72.17±3.06)%(見圖1)，對照組3 h圖(見圖2)。熱刺激后不同時間點關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞凋亡率見表1。

在熱刺激誘導(dǎo)關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞凋亡的模型中caspase-3隨著細(xì)胞的凋亡增加表達(dá)水平升高，其表達(dá)的水平基本與凋亡的程度一致，其表達(dá)高峰在熱刺激后3 h左右(見表2)；在正常的細(xì)胞中存在無活性的或者活性弱的caspase-3，免疫細(xì)胞化學(xué)染色染色弱，在熱刺激48℃ 10 min后的免疫細(xì)胞化學(xué)染色capase-3蛋白檢測顯示染色的強度增加，與對照組和未處理組之間進行t檢驗，P<0.01；而對照組與未處理組免疫反應(yīng)則無明顯的改變。

表1 熱刺激后不同時間點關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞凋亡率(凋亡細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100%)%，n=6)

表2 熱刺激后各時間點關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞中Caspase-3含量分析

2.2 關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu) 在體外培養(yǎng)的關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞的凋亡變化可以被透射電鏡檢測到，37℃處理10 min后比較典型的圖像(見圖3)，核染色質(zhì)輕度染色，細(xì)胞核成寬大的橢圓形，細(xì)胞膜完整無破裂；48℃熱刺激處理10 min后的典型細(xì)胞，核染色質(zhì)聚集、深染，并且關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞皺縮(見圖4)，有些凋亡的細(xì)胞殘核被細(xì)胞膜包裹，也就是所謂的凋亡小體。這一發(fā)現(xiàn)證實，熱刺激處理10 min能刺激關(guān)節(jié)軟骨的關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞凋亡。

圖1 實驗組TUNEL染色，關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞凋亡明顯，細(xì)胞核被染成棕褐色，染色質(zhì)濃縮，細(xì)胞核縮小，偶爾可見到凋亡小體。

圖2 對照組TUNEL染色，細(xì)胞核很少被染成棕褐色，細(xì)胞形態(tài)正常。

圖3 37℃處理10 min后，核染色質(zhì)輕度染色，細(xì)胞核成寬大的橢圓形，細(xì)胞膜完整無破裂。

圖4 48℃熱刺激處理10 min后的典型細(xì)胞，核染色質(zhì)聚集、深染，并且關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞皺縮，有些凋亡的細(xì)胞殘核被細(xì)胞膜包裹。

3 討 論

我們成功設(shè)計了熱刺激48℃介導(dǎo)關(guān)節(jié)軟骨的關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞的凋亡模型。用TUNEL方法有效的鑒定了凋亡細(xì)胞的DNA碎片[7]。近來，這一方法被廣泛的用來檢測動物、人類關(guān)節(jié)和肥大軟骨細(xì)胞的凋亡[8]。在我們的研究中，對照組中TUNEL反應(yīng)陽性的關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞數(shù)目很少；而在熱刺激組關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞大量存在。這說明熱刺激能夠誘導(dǎo)關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞凋亡。用TUNEL方法可以見到凋亡小體，小體可能是大量退變的DNA聚合而成[9，10]。因此，用透射電鏡凋亡是細(xì)胞死亡的一種方式是必要的。我們發(fā)現(xiàn)熱刺激后的關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞的皺縮、染色質(zhì)破裂，與關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞的凋亡死亡過程一致。

Caspase-3在凋亡過程中起著關(guān)鍵的作用，受上游蛋白酶的切割活化[11]。溫和熱刺激誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞凋亡過程中Caspase-3表達(dá)上調(diào)[12]。在本實驗中，熱刺激后Caspase-3含量表達(dá)升高，在實驗組中其染色程度深，圖像分析中其輝度明顯高于對照組，Caspase-3表達(dá)峰值在熱刺激后3 h，與關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞凋亡率基本一致。細(xì)胞凋亡的中樞啟動系統(tǒng)是caspase蛋白家族的介入，研究表明caspase-3與OA動物模型關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞凋亡有著很密切的關(guān)系[13]。在我們的研究中，很多caspase-3陽性的關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞在熱刺激組被檢測到，這進一步支持熱刺激48℃能介導(dǎo)關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞的凋亡這一假說。

總之，熱刺激48℃介導(dǎo)關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞的凋亡，我們提供了形態(tài)學(xué)和生物化學(xué)方面的證據(jù)。在我們的試驗?zāi)Ｐ椭校P(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞的凋亡從熱刺激后0.5 h逐漸增多，第3小時達(dá)到高峰，之后又呈下降趨勢。這一發(fā)現(xiàn)提示熱刺激48℃可能最終導(dǎo)致延緩關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞的凋亡。

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