去氫駱駝蓬堿通過下調(diào)COX?2表達抑制胃癌細胞遷移和侵襲

孫坤 李曉林 張皓 張凱 龐珊珊 孫為豪

去氫駱駝蓬堿通過下調(diào)COX?2表達抑制胃癌細胞遷移和侵襲

孫坤 李曉林 張皓 張凱 龐珊珊 孫為豪

目的探討去氫駱駝蓬堿對人胃癌MKN?45細胞環(huán)氧化酶?2（cyclooxygenase?2，COX?2）表達、遷移和侵襲的影響。方法MKN?45細胞接種于含10%胎牛血清的RPMI?1640培養(yǎng)液中，常規(guī)培養(yǎng)24 h后加去氫駱駝蓬堿（2、4、8、16、32μg／ml），同時設(shè)置對照組不加藥物，空白組只加培養(yǎng)液不含細胞，分別培養(yǎng)24 h、48 h、72 h，MTT法檢測細胞增殖率；western blot法檢測COX?2表達；劃痕損傷愈合實驗及Transwell小室基質(zhì)侵襲實驗檢測胃癌細胞體外遷移和侵襲。結(jié)果去氫駱駝蓬堿劑量依賴性抑制MKN?45細胞COX?2表達（P＜0.01）；與對照組相比，去氫駱駝蓬堿組MKN?45細胞遷移和侵襲能力明顯下降（P＜0.01）。結(jié)論去氫駱駝蓬堿可能通過下調(diào)COX?2表達抑制胃癌細胞遷移和侵襲。

去氫駱駝蓬堿；胃癌；環(huán)氧化酶?2；遷移；侵襲

胃癌是常見的消化道惡性腫瘤之一，在世界范圍內(nèi)其發(fā)病率及死亡率一直居高不下。在我國，胃癌的發(fā)病率及死亡率居各類惡性腫瘤之首［1］。侵襲和轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤最顯著的生物學特性之一，也是惡性腫瘤患者的主要死亡原因。近年來，中草藥及其提取物的抗癌作用越來越受到國內(nèi)外學者的重視。駱駝蓬堿是從蒺藜科多年生草本植物駱駝蓬的種子中提取的主要活性成分，具有抗腫瘤、抗氧化、抗炎等作用，已成為腫瘤防治研究的熱點［2］。Hamsa等［3］研究發(fā)現(xiàn)，去氫駱駝蓬堿在體外能有效抑制黑色素瘤B16F?10細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。然而，去氫駱駝蓬堿對胃癌細胞遷移和侵襲的影響尚不清楚。

環(huán)氧化酶（cyclooxygenase，COX）是前列腺素合成過程中一個重要的限速酶，已知COX至少有2種同工酶，即環(huán)氧化酶?1（COX?1）和環(huán)氧化酶?2（COX?2）。COX?2是誘導型酶，在正常生理狀態(tài)下多數(shù)組織內(nèi)幾乎不表達或很少表達，但在胃癌等多種腫瘤細胞內(nèi)表達明顯增加。研究表明，過度表達的COX?2參與胃癌的發(fā)生、發(fā)展過程，并且與胃癌的侵襲轉(zhuǎn)移以及預后密切相關(guān)［4?5］。本研究探討去氫駱駝蓬堿對人胃癌MKN?45細胞COX?2表達、遷移和侵襲的影響，旨在明確去氫駱駝蓬堿的抗腫瘤作用及機制。

1 材料和方法

1.1 細胞株、藥物及主要試劑 人胃腺癌低分化細胞株MKN?45購自中國科學院上海細胞生物研究所。去氫駱駝蓬堿、3?（4，5二甲基噻唑?2）2，5?二苯基四氮唑溴鹽（MTT）、二甲基亞砜（DMSO）購自美國Sigma公司；RPMI?1640培養(yǎng)液和胎牛血清購自美國Gibcol BRL公司；兔抗人COX?2多克隆抗體、GAPDH多克隆抗體及辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG抗體均購自美國Cell Signaling Technology公司；PVDF膜和ECL發(fā)光試劑盒為英國Amersham公司產(chǎn)品；X線膠片為日本柯達公司產(chǎn)品。Matrigel膠購自美國Becton Dick?inson公司；Transwell小室購自美國Corning公司。

1.2 去氫駱駝蓬堿的配制 先以DMSO溶解，而后以RPMI?1640培養(yǎng)液稀釋至所需濃度，DMSO在培養(yǎng)液中的濃度不超過0.1%，0.22μm的微孔濾膜過濾除菌后4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 細胞培養(yǎng) MKN?45細胞常規(guī)傳代培養(yǎng)于含10%胎牛血清、100 kU／L青霉素和100 mg／L鏈霉素的RPMI?1640培養(yǎng)液中，37℃、5%CO2飽和濕度的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)生長。隔天換液，3 d傳代1次。

1.4 MTT法檢測去氫駱駝蓬堿對胃癌細胞增殖的影響 將傳代后處于對數(shù)生長期的細胞經(jīng)0.25%胰蛋白酶消化，低速離心，制成5×107／L的MKN?45單細胞懸液后接種于96孔細胞培養(yǎng)板，每孔200μl，常規(guī)培養(yǎng)24 h至細胞貼壁，換無血清培養(yǎng)液再培養(yǎng)24 h，分組進行MTT比色實驗。去氫駱駝蓬堿組藥物終濃度為2、4、8、16μg／ml和32μg／ml；對照組：不加藥物；空白組：只加培養(yǎng)液不含細胞。各組細胞分別培養(yǎng)24、48 h和72 h后每孔加入濃度為5mg／ml的MTT液20 μl，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，小心吸棄上清，加入DMSO 150μl終止反應(yīng)。將96孔板移入平板震蕩器，避光水平震蕩10min，使MTT結(jié)晶充分溶解。將96孔板置于酶聯(lián)免疫檢測儀（美國Bio?Rad公司）中，以空白組調(diào)零，波長570 nm處測定各孔的吸光度（A）值（每組設(shè)4個平行孔，獨立重復3次）。細胞增殖率（%）＝實驗組A值／對照組A值×100%。

1.5 細胞蛋白提取和western blot檢測 取對數(shù)生長期MKN?45細胞接種于6 cm培養(yǎng)皿，不同濃度去氫駱駝蓬堿（0、4、8、16μg／ml）干預培養(yǎng)24 h，用預冷的PBS洗滌3次，以100μl細胞裂解液（PBS內(nèi)含：1% Nonidet P?40，脫氧膽酸鈉5 g／L，SDS 1 g／L，PMSF 0.1 g／L和抑肽酶10mg／L）4℃處理60 min。細胞裂解物經(jīng)12 000×g 4℃離心20 min后取上清，BCA試劑盒測定其蛋白濃度。常規(guī)進行SDS?PAGE電泳后轉(zhuǎn)印至PVDF膜，室溫封閉2 h，分別加入一抗（COX?2抗體和GAPDH抗體），4℃孵育過夜，辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG抗體為第二抗體。ECL發(fā)光，X線膠片感光。為評價COX?2蛋白的表達水平，應(yīng)用掃描儀（EPSON GT?8000，Seiko公司，日本）掃描western blot膠片，使用NIH Image圖像分析軟件對蛋白電泳帶的密度進行半定量分析。

1.6 劃痕損傷愈合實驗 1×106個細胞接種于6孔培養(yǎng)板中，常規(guī)培養(yǎng)待細胞長滿單層，棄去培養(yǎng)液，無血清RPMI?1640培養(yǎng)液漂洗1次，用滅菌的200μl移液器滴頭沿培養(yǎng)板底部呈“一”字形劃痕，培養(yǎng)液小心洗去懸浮細胞，并立即拍照，記為0 h。用無血清培養(yǎng)液漂洗2次，去氫駱駝蓬堿實驗組藥物濃度為8μg／m l（此藥物濃度對增殖無明顯影響），對照組只加入無血清培養(yǎng)液，不含藥物。將6孔板置37℃、5%CO2飽和濕度的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，分別在24 h和36 h后置于100倍的相差倒置顯微鏡下拍照。

1.7 Transwell小室基質(zhì)侵襲實驗 將Matrigel膠用無血清RPMI?1640培養(yǎng)液按1∶1.5稀釋后取100μl，加入Transwell小室的上室中，室溫下干燥1 h，并用無血清RPMI?1640培養(yǎng)液沖洗2次，將小室置入預先加入750μl含10%胎牛血清的RPMI?1640培養(yǎng)液的24孔板內(nèi)；取不同濃度去氫駱駝蓬堿（0、4、8、16μg／m l）作用24 h的MKN?45細胞，以無血清的RPMI?1640培養(yǎng)液制成單細胞懸液，分別取200μl加入上室內(nèi)，含細胞數(shù)為1×105個，置37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)培育24 h后取出，以棉簽小心刮除濾膜上面的細胞，侵襲并黏附到濾膜下的細胞以甲醇固定，結(jié)晶紫染色計數(shù)，每張濾膜在光學顯微鏡（×200）下隨機取9個視野計數(shù)侵襲的細胞數(shù)。實驗重復3次，計算平均值。

2 結(jié)果

2.1 去氫駱駝蓬堿對MKN?45細胞增殖的影響MTT結(jié)果表明，隨著去氫駱駝蓬堿濃度的增加及作用時間的延長，MKN?45細胞的增殖率逐漸降低。2、4、8 μg／ml去氫駱駝蓬堿作用24 h及2μg／ml去氫駱駝蓬堿作用48 h，對MKN?45細胞增殖抑制作用與對照組（0μg／ml）作用相同時間后比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表1。

2.2 去氫駱駝蓬堿對MKN?45細胞COX?2蛋白表達的影響 western blot結(jié)果顯示，與對照組（0μg／m l）相比，不同濃度去氫駱駝蓬堿抑制MKN?45細胞COX?2蛋白的表達水平具有劑量依賴性。見表2。

表1 去氫駱駝蓬堿抑制MKN?45細胞增殖率（±s，%）

表1 去氫駱駝蓬堿抑制MKN?45細胞增殖率（±s，%）

注：與0μg／ml比較，?P＜0.05，??P＜0.01

去氫駱駝蓬堿用量（μg／m l）24 h細胞增殖率48 h細胞增殖率72 h細胞增殖率0 100.00±0.00 100.00±0.00 100.00±0.00 96.83±3.89 89.62±3.12 63.93±3.84??4 91.65±4.62 79.21±4.98?55.09±4.71??8 89.53±6.88 68.73±4.69??36.67±5.08??16 76.01±5.14?52.36±1.93??27.81±2.62??32 65.54±4.28??48.44±2.78??18.48±4.38??2

表2 不同濃度去氫駱駝蓬堿抑制MKN?45細胞COX?2蛋白表達（±s）

表2 不同濃度去氫駱駝蓬堿抑制MKN?45細胞COX?2蛋白表達（±s）

注：與0μg／ml比較，??P＜0.01

指標去氫駱駝蓬堿0μg／ml去氫駱駝蓬堿4μg／m l去氫駱駝蓬堿8μg／ml去氫駱駝蓬堿16μg／m l COX?2（灰度值）999.77±211.46 662.57±110.41 424.00±42.42 271.83±41.38 GAPDH（灰度值）443.33±30.65 466.00±24.66 478.33±17.44 464.00±24.12 COX?2／GAPDH 2.23±0.35 1.43±0.27??0.89±0.11??0.59±0.12??

2.3 去氫駱駝蓬堿對MKN?45細胞遷移的影響 在劃痕損傷愈合實驗中，經(jīng)過劃痕處理，隨時間的延長，MKN?45細胞逐漸向痕跡內(nèi)部生長、遷移，去氫駱駝蓬堿作用后遷移速率較對照組（0μg／ml）顯著降低，而且隨著藥物作用時間的延長，抑制效果更加明顯（圖1）。

圖1 去氫駱駝蓬堿對MKN?45細胞遷移能力的影響（劃痕損傷愈合實驗，×100）

2.4 去氫駱駝蓬堿對MKN?45細胞侵襲的影響 Tr?answell小室基質(zhì)侵襲實驗結(jié)果顯示，與對照組（0μg／ml）相比，不同濃度去氫駱駝蓬堿組（4、8、16 μg／ml）均顯著抑制胃癌細胞的侵襲能力，穿膜細胞數(shù)隨著去氫駱駝蓬堿濃度的增加逐漸減少，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）（表3）。

表3 去氫駱駝蓬堿對MKN?45細胞侵襲力的影響

3 討論

3.1 侵襲和轉(zhuǎn)移是影響胃癌預后的重要因素 胃癌是威脅人類生命健康最常見的惡性腫瘤之一，是癌癥死亡的主要原因。侵襲和轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤的主要生物學行為，也是影響治療效果和預后的重要因素。研究胃癌侵襲和轉(zhuǎn)移的機制并采取有效的措施進行干預，對降低胃癌死亡率具有重要意義。侵襲與轉(zhuǎn)移是一個復雜的多步驟連續(xù)過程，至少包含以下步驟：原發(fā)部位腫瘤細胞脫離原發(fā)瘤，侵襲穿越基底膜并向周圍間質(zhì)浸潤性生長，穿越局部毛細血管或淋巴管壁進入管腔，隨血液或淋巴液運輸?shù)竭_靶器官，并與該部位的血管或淋巴管內(nèi)皮細胞發(fā)生粘附，穿越管壁和基底膜進入周圍間質(zhì)，不斷增殖形成轉(zhuǎn)移瘤。近年來中醫(yī)藥的抗腫瘤、抗侵襲與轉(zhuǎn)移研究備受關(guān)注，已有大量研究表明某些中草藥及其提取物具有抑制腫瘤侵襲與轉(zhuǎn)移的作用［6?9］。本研究在體外觀察了去氫駱駝蓬堿對胃癌細胞遷移和侵襲的影響，旨在探討去氫駱駝蓬堿的抗侵襲與轉(zhuǎn)移的作用及機制。

3.2 COX?2表達與胃癌侵襲、轉(zhuǎn)移的相關(guān)性 COX?2在多種胃癌細胞株內(nèi)高表達，且對胃癌細胞的存活和增殖是必要的［10］。過度表達的COX?2參與胃癌的發(fā)生、發(fā)展過程，尤其與胃癌侵襲性密切相關(guān)。目前認為，COX?2催化花生四烯酸合成的前列腺素可通過多種途徑增強多種基質(zhì)金屬蛋白酶活性，增加CD44表達以及降低上皮鈣黏素表達，從而增強腫瘤的侵襲力［11］。研究發(fā)現(xiàn)，胃癌組織中COX?2蛋白表達與患者年齡、性別、腫瘤大小、腫瘤部位及腫瘤的組織學類型無關(guān)，與病變的浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及遠處轉(zhuǎn)移有關(guān)，可作為反映胃癌侵襲轉(zhuǎn)移的生物學指標［12］。據(jù)報道，應(yīng)用選擇性COX?2抑制劑或基因干擾技術(shù)降低COX?2的表達，能顯著抑制多種惡性腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移［13?14］。本研究證實，去氫駱駝蓬堿可有效抑制胃癌細胞COX?2的表達。

3.3 去氫駱駝蓬堿抑制胃癌細胞遷移和侵襲 為評價去氫駱駝蓬堿對胃癌MKN?45細胞侵襲與轉(zhuǎn)移的影響，本研究采用劃痕損傷愈合實驗及Transwell小室基質(zhì)侵襲實驗來模擬體外胃癌細胞侵襲、轉(zhuǎn)移的過程。研究發(fā)現(xiàn)，去氫駱駝蓬堿能有效抑制胃癌細胞的遷移和侵襲。因此，我們推測去氫駱駝蓬堿可能通過下調(diào)COX?2表達抑制胃癌侵襲、轉(zhuǎn)移，為臨床應(yīng)用中藥去氫駱駝蓬堿治療胃癌提供理論和實驗依據(jù)。

［1］ 黃海，史冬梅，于曉峰，等.老年人胃癌癌前變化的隨訪研究［J］.實用老年醫(yī)學，2012，26（5）：404?407.

［2］ Cao MR，LiQ，Liu ZL，et al.Harmine induces apoptosis in HepG2 cells viamitochondrial signaling pathway［J］.Hepa?tobiliary Pancreat Dis Int，2011，10（6）：599?604.

［3］ Hamsa T，Kuttan G.Studies on anti?metastatic and anti?inva?sive effects of harmine using highlymetastatic murine B16F?10 melanoma cells［J］.J Environ Pathol Toxicol Oncol，2011，30（2）：123?137.

［4］ Wallace JL.COX?2：a pivotal enzyme in mucosal protection and resolution of inflammation［J］.Scientific World Journal，2006，25（6）：577?588.

［5］ Sun WH，Sun YL，F(xiàn)ang RN，et al.Expression of cyclooxy?genase?2 and matrixmetalloproteinase?9 in gastric carcinoma and its correlation with angiogenesis［J］.Jpn JClin Oncol，2005，35（12）：707?713.

［6］ 鄭學芝，劉曉霓，孫衛(wèi)，等.姜黃素抗人胃癌SGC?7901細胞侵襲和轉(zhuǎn)移的作用［J］.中國藥師，2008，11（10）：1183?1184.

［7］ 于麗波，王晶，孫文洲，等.熊果酸對卵巢癌細胞黏附、運動和侵襲的影響［J］.中國老年學雜志，2010，30（15）：2169?2170.

［8］ 劉威，沈克平，胡兵，等.夏龍方對人胃癌SGC?7901細胞黏附和侵襲的影響［J］.中國實驗方劑學雜志，2011，17（2）：192?195.

［9］ 黃煒，黃繼群，張東方，等.五環(huán)三萜類化合物抗人肺癌細胞侵襲和誘導細胞凋亡的研究［J］.中國肺癌雜志，2003，6（4）：254?257.

［10］Ma D，Liu M，Wang AP，etal.Cycloxygenase?2 is essential for the survival and proliferation of gastric cancer cells［J］. Cell Biochem Biophys，2011，61（3）：637?641.

［11］羅毅，葉遠良，陳勇.COX?2在腫瘤的侵襲及轉(zhuǎn)移作用研究進展［J］.齊齊哈爾醫(yī)學院學報，2011，32（16）：2632?2633.

［12］馬丹，劉敏，梁平，等.COX?2在人胃癌中的表達及與胃癌臨床病理特征的關(guān)系［J］.重慶醫(yī)學，2009，38（3）：290?292.

［13］方征東，李建生，徐修才.選擇性環(huán)氧化酶?2抑制劑對肝癌細胞侵襲力的影響［J］.世界華人消化雜志，2006，14（3）：293?298.

［14］王軒，韓磊，楊旸，等.靶向AKT1和COX?2的RNAi抑制U251膠質(zhì)瘤細胞侵襲的體外實驗［J］.中國神經(jīng)精神疾病雜志，2010，36（4）：241?245.

Harm ine inhibitsm igration and invasion of human gastric cancer cells through down?regulating COX?2 expression

SUN Kun，LIXiao?lin，ZHANG Hao，ZHANGKai，PANG Shan?shan，SUNWei?hao．Department ofGeriatric Gastroen?terology，the First Affiliated Hospital of Nanjing Medical University，Nanjing 210029，China

ObjectiveTo investigate the effects of harmine on the expression of cyclooxygenase?2（COX?2），and themigration and invasion of a human gastric cancer cell line，MKN?45.M ethodsMKN?45 cellswere seeded in RPMI?1640 medium supplemented with 10%heat?inactivated fetal calf serum and routinely incubated for 24 h.After treatment with harmine at a final concentration of 2，4，8，16 and 32μg／ml for 24，48 and 72 h，the cell proliferation was deter?mined using MTT colorimetric assay.The expression of COX?2 was detected by western blot analysis.In vitro wound?healing and transwell invasion assayswere used to assess the effects of harmine on themigration and invasion of MKN?45 cells.ResultsHarmine significantly suppressed the expression of COX?2 in a dose?dependentmanner（P＜0.01）.Compared with control group，harmine significantly inhibited migration and invasion of MKN?45 cells（P＜0.01）.ConclusionsThis study demonstrates that harmine inhibitsmigration and invasion of human gastric cancer cells through down?regulating COX?2 expression.

harmine；gastric cancer；cyclooxygenase?2；migration；invasion?

R 735.2

A

10.3969／j.issn.1003?9198.2014.02.008

2013?05?30）

210029江蘇省南京市，南京醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院老年消化科

孫為豪，Email：weihaosun＠hotmail.com