食管癌干細(xì)胞放射抗性相關(guān)機制的研究進展

邱琪 于靜萍 孫蘇平

南京醫(yī)科大學(xué)江蘇省常州市第二人民醫(yī)院放療科，江蘇 常州 213000

食管癌（esophageal cancer，EC）是最常見的致命癌癥之一，其5年總體生存率不到20%，我國尤為高發(fā)[1]。雖然在世界范圍內(nèi)大量基礎(chǔ)和臨床研究已經(jīng)開展，而且腫瘤分子生物學(xué)在食管癌中的研究近年來已取得突破性進展，但食管癌的診斷水平和治療療效目前仍無明顯提高，晚期食管癌的死亡率總體持平，常規(guī)治療后腫瘤的復(fù)發(fā)與轉(zhuǎn)移仍然是現(xiàn)今需要面對的嚴(yán)峻問題。較多的臨床研究發(fā)現(xiàn)，放射治療的失敗是食管癌預(yù)后不良的主要原因之一，由于腫瘤對放療產(chǎn)生了抗拒性，存活腫瘤干細(xì)胞再增殖，最終導(dǎo)致腫瘤復(fù)發(fā)或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移或[2]。

1 腫瘤干細(xì)胞生物特性及其鑒定

Reya等[3]于2001年提出了“腫瘤干細(xì)胞”學(xué)說。在腫瘤細(xì)胞中，一些細(xì)胞具有類似干細(xì)胞的特性，包括自我更新、多向分化的能力、廣泛增殖的潛能、高致瘤性和耐藥性等，被稱為腫瘤干細(xì)胞（cancer stem cell，CSC）。在腫瘤學(xué)中，腫瘤干細(xì)胞已成為一個重要的研究領(lǐng)域，腫瘤干細(xì)胞理論認(rèn)為腫瘤干細(xì)胞來源于組織干細(xì)胞的突變或者祖細(xì)胞通過基因突變重新獲得自我更新能力，在大多數(shù)類型的腫瘤組織中都有一定數(shù)量的細(xì)胞表現(xiàn)出干細(xì)胞特性，可能具有與干細(xì)胞相同的表型和標(biāo)記。CD133是目前為止已證實的最常見的一種腫瘤干細(xì)胞標(biāo)志物，最早在白血病干細(xì)胞中被發(fā)現(xiàn)[4]。此后發(fā)現(xiàn)在許多不同類型的腫瘤細(xì)胞中均有CD133的表達(dá)，包括肺癌、膠質(zhì)瘤、結(jié)/直腸癌、胰腺癌、乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、肝癌[5]。利用Hoechst染料和流式細(xì)胞術(shù)進行造血干/祖細(xì)胞分離時發(fā)現(xiàn)一群特殊細(xì)胞，既具有類似干細(xì)胞的自我更新和多向分化潛能，還具有獨特的表型標(biāo)記和生物學(xué)特征，代表了一種新的干細(xì)胞類型，被稱為側(cè)群細(xì)胞（side population cell，SPcell）[6]。

2 食管癌干細(xì)胞生物特性及其鑒定

2003年，Okumura等[7]應(yīng)用低親和性神經(jīng)營養(yǎng)素受體（p75 neurotrophin receptor，P75NTR）為表面標(biāo)記對人食管鱗狀上皮細(xì)胞進行了分選，并證明正常食管上皮細(xì)胞中的P75NTR陽性細(xì)胞具有增殖、自我更新及多向分化能力，經(jīng)鑒定為食管上皮干細(xì)胞。自此，食管癌干細(xì)胞的分離鑒定就有了基本的標(biāo)準(zhǔn)，為研究其生物學(xué)特性奠定了基礎(chǔ)。研究表明，Oct-4、Sox-2、Bmi-1、Notch和β-catenin是腫瘤的“干細(xì)胞基因”，Huang等[8]在食管鱗癌SP細(xì)胞分選中發(fā)現(xiàn)，“干細(xì)胞基因”O(jiān)ct-4、Sox-2、Bmi-1和Zfx在SP細(xì)胞中的表達(dá)比非SP細(xì)胞更高。另一常見的干細(xì)胞標(biāo)志物CD44是Wnt/βcatenin通路的下游作用分子，最早從乳腺癌細(xì)胞中分選出具有CD44（＋）CD24（－/low）Lineage（－）表型的細(xì)胞時被確定[9]，后又發(fā)現(xiàn)肺癌、肝癌、結(jié)腸癌、卵巢癌、前列腺癌中都有表達(dá)并用于干細(xì)胞的分選[10]。在食管鱗狀細(xì)胞癌中發(fā)現(xiàn)CD44＋細(xì)胞具有自我更新、致瘤性等干細(xì)胞的特性，并且與食管癌的不良預(yù)后密切相關(guān)，為食管癌干細(xì)胞的鑒定和研究提供了一定的依據(jù)，但更多的表型和標(biāo)志尚有待進一步的探索。

3 腫瘤干細(xì)胞放射抗拒性的相關(guān)機制

腫瘤干細(xì)胞與非腫瘤干細(xì)胞相比具有自我更新、多向分化的潛能，在腫瘤的發(fā)生、轉(zhuǎn)移和放化療耐受中扮演著重要的角色。研究表明從不同類型的腫瘤細(xì)胞中分選出的腫瘤干細(xì)胞，在放化療后生存能力比普通腫瘤細(xì)胞生存能力更強[11]，具有放射抵抗的潛能。腫瘤干細(xì)胞產(chǎn)生放射抗性的機制可能與細(xì)胞周期時相再分布[12]、較高的自由基清除水平[13]、高效的DNA損傷修復(fù)機制[13]、細(xì)胞凋亡和增殖等信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的改變[13]有關(guān)。

3.1 細(xì)胞周期時相再分布

細(xì)胞處于不同的細(xì)胞周期時放射敏感性不同，M期細(xì)胞對射線特別敏感，而G0期細(xì)胞對射線最為抗拒，正常組織干細(xì)胞和腫瘤干細(xì)胞通常處于細(xì)胞周期的靜止?fàn)顟B(tài)，即G0期。Wnt/βcatenin途徑可能參與腫瘤干細(xì)胞周期再分布[14]，Kendziorra等[15]發(fā)現(xiàn)Wnt轉(zhuǎn)錄因子（T cell factor-4，TCF-4）在直腸癌細(xì)胞系的過度表達(dá)導(dǎo)致了細(xì)胞的耐藥性和放射抗拒性，沉默的TCF-4誘導(dǎo)G2/M期阻滯，使細(xì)胞對放射的敏感性顯著增加。

3.2 較高的自由基清除水平

腫瘤細(xì)胞常處于缺氧的環(huán)境中，使細(xì)胞中的ROS水平降低，同時缺氧誘導(dǎo)因子（hypoxia inducible factors，HIF）的水平升高，與腫瘤的放射抗拒密切相關(guān)[16]。腫瘤干細(xì)胞具有更高的活性氧基團（reactive oxygen species，ROS）清除水平，產(chǎn)生的ROS較少，DNA的損傷較非腫瘤干細(xì)胞小。研究發(fā)現(xiàn)中樞神經(jīng)系統(tǒng)干細(xì)胞和造血干細(xì)胞的ROS水平比普通體細(xì)胞低，這種差異對維持干細(xì)胞功能至關(guān)重要。Diehn等[17]發(fā)現(xiàn)人和小鼠乳腺腫瘤干細(xì)胞與非腫瘤干細(xì)胞相比含有更低濃度的ROS，而低水平的ROS與較強的自由基清除能力有關(guān)，放射所致的DNA損傷明顯少于非腫瘤干細(xì)胞，因此更具有放射抗拒性。組蛋白H2A磷酸化被認(rèn)為是DNA損傷修復(fù)的標(biāo)志[18]，乳腺癌干細(xì)胞受到照射后會產(chǎn)生更少的γ-H2AX，而且在小鼠乳腺癌干細(xì)胞的研究中發(fā)現(xiàn)，腫瘤干細(xì)胞中γ-H2AX的清除速度較非腫瘤干細(xì)胞更快[5]。

3.3 高效的D NA損傷修復(fù)機制

電離輻射的生物有效性取決于細(xì)胞不可修復(fù)的DNA損傷，主要是DNA雙鏈斷裂，其次是累積的亞致死DNA損傷，正常組織與腫瘤組織之間往往有不同的修復(fù)能力。Bao等[19]認(rèn)為腫瘤干細(xì)胞具有更強的DNA損傷檢查點和損傷修復(fù)能力，因此導(dǎo)致細(xì)胞的放射抗拒。檢查點激酶（checkpoint kinase，Chk）——Chk1和Chk2在腫瘤干細(xì)胞的放射抗性中起重要作用[20]，通過抑制Chk1和Chk2的活性，可削弱腦膠質(zhì)瘤干細(xì)胞對照射的抵抗能力，恢復(fù)其對放射的敏感性[19]。同時還發(fā)現(xiàn)腦膠質(zhì)瘤CD133＋細(xì)胞和CD133－細(xì)胞在受到相同劑量照射后DNA的損傷程度相同，但CD133＋細(xì)胞能更有效地激活對DNA損傷的應(yīng)答，修復(fù)照射所致的DNA損傷，使細(xì)胞凋亡率顯著降低[21]。

3.4 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的改變

腫瘤干細(xì)胞在腫瘤各個階段發(fā)揮作用與眾多的基因改變和信號通路有關(guān)，如Wnt/β-catenin、Notch、PI3-K、MAPK、NF-κB。Wnt/β-catenin可以賦予CSC耐輻射的能力，Chen等[22]發(fā)現(xiàn)鼠乳腺癌細(xì)胞系COMMA-Dβ-geo中的CSC群體Sca+細(xì)胞能耐受2 Gy的照射劑量，細(xì)胞內(nèi)β-catenin和Survivin處于高表達(dá)水平，產(chǎn)生的γ-H2AX較少，DNA損傷也較少。研究發(fā)現(xiàn)Notch通路也涉及腫瘤干細(xì)胞生物特性的調(diào)控，Wang等[23]采用Notch抑制劑——γ分泌酶抑制劑（GSI）后發(fā)現(xiàn)，膠質(zhì)瘤干細(xì)胞通過降低Akt的活性和Mcl-1的水平發(fā)揮其放射增敏效應(yīng)，提高了放射誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡率。同時Notch-1或Notch-2基因的敲除也會提高神經(jīng)膠質(zhì)瘤干細(xì)胞對放射的敏感性，減少異種移植瘤的形成。磷脂酰肌醇激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3-K）廣泛涉及腫瘤組織的各種異常生物學(xué)特征，如無限復(fù)制能力、維持細(xì)胞在惡性環(huán)境下的生存、腫瘤易于向周邊組織浸潤及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移[24]，與放射治療后的腫瘤局部控制情況密切相關(guān)，同時PI3-K基因的敲除則通過抑制RAS途徑增強腫瘤細(xì)胞的放射反應(yīng)。PTEN作為一種可能的腫瘤抑制基因，通過作用于PI3-K抑制腫瘤的增殖轉(zhuǎn)移，提高細(xì)胞的放射敏感性[25]。絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）參與調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的多種生物學(xué)過程，受酪氨酸激酶受體或突變的通路分子激活，在一些常見的腫瘤干細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)MAPK分子異常激活。在H-Ras誘導(dǎo)的細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移中，p38/MAPK活性的抑制降低了細(xì)胞的運動能力，對于腫瘤細(xì)胞的發(fā)生、凋亡、轉(zhuǎn)移具有重要作用。核因子κB（nuclear factor kappa B，NF-κB）信號途徑參與腫瘤發(fā)生、侵襲、誘導(dǎo)輻射耐受性和耐藥性，研究表明NF-κB信號通路的選擇性抑制劑可以提高放射治療的療效[26]。

4 食管癌干細(xì)胞放射抗拒性的相關(guān)機制

在包括中國在內(nèi)的東亞國家，食管癌的主要組織學(xué)類型是食管鱗狀細(xì)胞癌（esophageal squamous cell carcinoma，ESCC），該型對放射治療有較強的敏感性，因此放射治療是食管癌的主要治療手段之一，而放射抗拒被認(rèn)為是食管癌局部復(fù)發(fā)和放療失敗的重要原因。Smit等[27]研究發(fā)現(xiàn)食管癌組織中部分細(xì)胞具有CD44＋/CD24－表型，在體外實驗中食管癌CD44＋/CD24－細(xì)胞表現(xiàn)出與干細(xì)胞相似的特性，更具有侵襲擴散的潛能和放射抗性。食管腫瘤組織在放射治療過程中激活了各種信號分子，導(dǎo)致無法修復(fù)的DNA損傷，最終引起細(xì)胞凋亡。然而由于放射所致的DNA損傷常常被擾亂，如抗凋亡程序的激活、干細(xì)胞基因的高表達(dá)、細(xì)胞周期的異常調(diào)控，使腫瘤細(xì)胞對放射產(chǎn)生抗拒性。

4.1 抗凋亡程序的激活

食管癌干細(xì)胞受到電離輻射刺激時，特殊的調(diào)節(jié)機制就會啟動，同時PI3-K、MAPK、NF-κB通路會隨之級聯(lián)激活，抗凋亡蛋白Mcl-1的表達(dá)增加，使細(xì)胞凋亡率降低。Fulda等[28]發(fā)現(xiàn)異常激活的抗凋亡程序，高表達(dá)的抗凋亡蛋白（inhibitor of apoptosis protein，IAP）能夠降低放射治療的效果。而其中XIAP發(fā)揮的抗凋亡作用最強，通過激活NF-κB參與誘導(dǎo)腫瘤的放射抗性和耐藥性，還可以通過細(xì)胞周期阻滯、自我更新和缺氧環(huán)境影響放射治療的效果。

4.2 干細(xì)胞基因的高表達(dá)

Zhang等[29]通過食管癌連續(xù)分割照射獲得一群具有放射抗性的細(xì)胞，并表現(xiàn)出CSC的特性，如高水平的端粒酶活性、SPcell的富集、β-catenin、Oct-3/4和β1-integrin的高表達(dá)以及凋亡基因的下調(diào)。經(jīng)過病毒載體轉(zhuǎn)染后表達(dá)凋亡基因Ad/TRAIL-E1的腫瘤細(xì)胞尤其是腫瘤干細(xì)胞對照射有更高的敏感性。Che等[30]經(jīng)過分次照射獲得具有放射抗性的食管癌干細(xì)胞（Eca109R50Gy），與普通放射敏感的腫瘤細(xì)胞相比，Eca109R50Gy細(xì)胞的干細(xì)胞特性和腫瘤形成的潛能顯著增強。βcatenin的表達(dá)與放射劑量有一定的相關(guān)性，隨著放射劑量增加，β-catenin的表達(dá)也增強。同時發(fā)現(xiàn)Wnt拮抗劑Dkk-1和COX-2抑制劑NS398能通過抑制β-catenin的表達(dá)增強Eca109R50Gy細(xì)胞的放射敏感性。Bmi-1基因是PcG家族中的核心成員之一，在腫瘤細(xì)胞中Bmi-1呈高表達(dá)狀態(tài)，使腫瘤細(xì)胞不斷更新成為腫瘤干細(xì)胞，其表達(dá)水平與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、侵襲、預(yù)后等相關(guān)。Wang等[31]采用分次照射獲得具有放射抗性的食管癌干細(xì)胞中，Bmi-1表達(dá)顯著高于親本細(xì)胞。而經(jīng)過Bmi-1耗損后，腫瘤細(xì)胞通過誘導(dǎo)凋亡程序，提高ROS、氧化酶和γ-H2AX水平，明顯增強腫瘤細(xì)胞的放射反應(yīng)。

4.3 細(xì)胞周期的異常調(diào)控

p27KIP1是周期蛋白依賴性激酶（cyclin-dependent kinase，CDK）抑制劑，具有限制性調(diào)節(jié)細(xì)胞周期進程的作用，使細(xì)胞停滯在G1期，細(xì)胞生長停止，可能是一種腫瘤抑制物。Tong等[32]發(fā)現(xiàn)低表達(dá)的p27KIP1改變了細(xì)胞周期狀態(tài)，導(dǎo)致食管癌細(xì)胞的放射抗拒。細(xì)胞周期性蛋白（S phase kinase protein 2，Skp2）參與p27KIP1泛素化降解過程，使其在許多惡性腫瘤中處于低表達(dá)水平，并正性調(diào)控G1/S期的轉(zhuǎn)換。Wang等[33]研究發(fā)現(xiàn)在ESCC組織中Skp2的表達(dá)升高，通過作用于p27KIP1促進了細(xì)胞的放射抗性，而Skp2基因的敲除可提高腫瘤細(xì)胞的放射敏感性。

5 展望

腫瘤干細(xì)胞對腫瘤的形成和進展具有重要作用，是促進食管癌發(fā)生、發(fā)展、侵襲轉(zhuǎn)移、耐藥性和放射抗性的重要機制之一，腫瘤干細(xì)胞的再增殖分化導(dǎo)致食管癌治療的失敗，成為預(yù)后不良的重要因素，為新的治療提供了靶標(biāo)。凋亡基因的調(diào)控、DNA損傷修復(fù)能力、多種信號分子通路、細(xì)胞周期狀態(tài)等均參與腫瘤干細(xì)胞對放射敏感性的調(diào)節(jié)，各種因素及分子之間相互協(xié)調(diào)共同發(fā)揮對放射抗性的影響。相比其他實體瘤干細(xì)胞，食管癌干細(xì)胞尚缺少特異性的標(biāo)志物，對其生物學(xué)特性和分選鑒定方法以及腫瘤干細(xì)胞在食管癌發(fā)生發(fā)展、侵襲轉(zhuǎn)移、放化療抵抗中的詳細(xì)機制仍研究甚少。因此，有必要對其進行深入的研究，這樣新的治療方法才有可能解決食管癌放射治療失敗的問題，從而降低腫瘤的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移幾率。

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