小兒健脾散中黃芪甲苷、歐前胡素和異歐前胡素的含量測定方法探索*

郭 琪，李向陽，宋漢敏

(河南省食品藥品檢驗(yàn)所，河南 鄭州450003)

小兒健脾散(曾用名:娃娃寶)為中華人民共和國衛(wèi)生部藥典委員會(huì)于1991 年出版發(fā)行的《中華人民共和國衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn):中藥成方制劑》第三冊(cè)收載品種。該方是由黨參、石蓮子、木香、廣藿香、茯苓、白芷、黃芪、白扁豆、六神曲和甘草等10 味藥材組成的復(fù)方散劑，有益氣健脾、和胃運(yùn)中之功效，臨床多用于脾胃虛弱、脘腹脹滿、嘔吐泄瀉、不思飲食的兒童。該方原質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中僅有顯微鑒別和理化鑒別等定性質(zhì)控方法。為全面控制該藥的內(nèi)在質(zhì)量和保障用藥安全，本研究采用高效液相法對(duì)小兒健脾散中的重要藥物——黃芪、白芷分別以主要成分黃芪甲苷［1-2］和歐前胡素、異歐前胡素［3］為指標(biāo)，進(jìn)行了含量測定研究。

1 藥品、試劑與儀器

小兒健脾散，廣西來賓金錢草藥業(yè)有限公司產(chǎn)品，批號(hào)090902。黃芪甲苷對(duì)照品(批號(hào)110781 -200613)、歐前胡素(批號(hào)110826 -200511)、異歐前胡素(批號(hào)110827 -200407)，均由中國食品藥品檢定研究院提供;乙腈、甲醇，均為色譜純，德國Merck公司產(chǎn)品;超純水為自制水。Waters 高效液相色譜儀(2695 溶劑管理系統(tǒng)，2996 二極管陣列檢測器，美國Waters 柱溫箱，Empower 2 工作站)，產(chǎn)地美國;ELSD 2000ES 蒸發(fā)光散射檢測器，美國Alltech 公司產(chǎn)品;AE240 十萬分之一電子分析天平，瑞士METTLER 公司產(chǎn)品;Advantage A10 超純水凈化儀，美國MILLIPORE 公司產(chǎn)品。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液的制備

2.1.1 對(duì)照品溶液的制備

對(duì)照品溶液Ⅰ的制備:取黃芪甲苷對(duì)照品適量，加甲醇制成每毫升含99 μg 的溶液，即得。對(duì)照品溶液Ⅱ的制備:取歐前胡素、異歐前胡素對(duì)照品適量，加甲醇制成每毫升含歐前胡素30.4 μg、異歐前胡素27.5 μg 的混合溶液，即得。

2.1.2 供試品溶液的制備

供試品溶液Ⅰ的制備(用以分析黃芪甲苷):取本品約5 g，精密稱定，置索氏提取器中;加甲醇適量，加熱回流提取5 h;提取液回收甲醇并濃縮至干;殘?jiān)铀?0 mL，微熱使溶解;用乙醚振搖洗滌2 次，每次20 mL;棄去乙醚液，水溶液再用水飽和的正丁醇振搖提取4 次，每次20 mL;合并正丁醇提取液，用氨試液洗滌2 次，每次10 mL;棄去氨液，正丁醇液再用正丁醇飽和的水振搖洗滌2 次，每次10 mL;正丁醇液回收溶劑至干;殘?jiān)蛹状既芙猓D(zhuǎn)移至10 mL 量瓶中，加甲醇至刻度;搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

供試品溶液Ⅱ的制備(用以分析歐前胡素、異歐前胡素):取本品約5 g，精密稱定，置索氏提取器中;加乙醚適量;加熱回流提取5 h;提取液低溫回收乙醚并濃縮至干;殘?jiān)蛹状既芙猓D(zhuǎn)移至5 mL 量瓶中，加甲醇至刻度;搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.1.3 陰性樣品溶液的制備

缺黃芪陰性樣品溶液的制備(用以分析黃芪甲苷):依處方量制備缺黃芪的陰性樣品，按供試品溶液Ⅰ的制備方法制成相應(yīng)的陰性樣品溶液Ⅰ，備用。

缺白芷陰性樣品溶液的制備(用以分析歐前胡素、異歐前胡素):依處方量制備缺白芷的陰性樣品，按供試品溶液Ⅱ的制備方法制成相應(yīng)的陰性樣品溶液Ⅱ，備用。

2.2 色譜條件

2.2.1 色譜條件Ⅰ

此色譜條件用以分析黃芪甲苷。采用Phenomenex Luna C18柱(4.6 mm ×250 mm，5 μm)，柱溫35 ℃，流動(dòng)相為乙腈- 水 (35 ∶65)，流速1.0 mL/min，載氣流速2.3 L/min，蒸發(fā)光散射檢測器漂移管溫度105 ℃。

2.2.2 色譜條件Ⅱ

此色譜條件用以分析歐前胡素、異歐前胡素。采用Phenomenex Luna C18柱(4. 6 mm ×250 mm，5 μm)，柱溫30℃，流動(dòng)相為甲醇-水(60∶40)，流速1.0 mL/min，檢測波長310 nm。

2.3 專屬性考察

分別精密吸取上述溶液適量注入液相色譜儀，記錄色譜圖。結(jié)果見圖1、圖2。結(jié)果表明:供試品色譜中，在與對(duì)照品色譜峰相應(yīng)的位置上，均具有相同保留時(shí)間的色譜峰，而相應(yīng)的陰性溶液在相應(yīng)保留時(shí)間處無干擾，方法的專屬性良好。

圖1 小兒健脾散黃芪甲苷項(xiàng)HPLC-ELSD 色譜圖

圖2 小兒健脾散歐前胡素、異歐前胡素HPLC 色譜圖

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線與線性范圍

分別精密吸取黃芪甲苷對(duì)照品溶液和歐前胡素、異歐前胡素混合對(duì)照品溶液各2，5，10，15，20 μL，分別在色譜條件Ⅰ、Ⅱ依次進(jìn)樣，記錄色譜圖。黃芪甲苷以峰面積(Y)的自然對(duì)數(shù)為縱坐標(biāo)，以對(duì)照品進(jìn)樣量(X)的自然對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線;歐前胡素、異歐前胡素以峰面積(Y)為縱坐標(biāo)，以對(duì)照品進(jìn)樣量(X)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果見表1。

表1 3 個(gè)成分的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程、相關(guān)系數(shù)和線性范圍

2.5 精密度試驗(yàn)

精密吸取供試品溶液Ⅰ、Ⅱ各10 μL，分別在色譜條件Ⅰ、Ⅱ下，連續(xù)進(jìn)樣6 次，記錄峰面積。結(jié)果:黃芪甲苷、歐前胡素、異歐前胡素的RSD 值(n =6)分別為0.17%、0.59%、0.88%。結(jié)果表明:儀器精密度良好。

2.6 重復(fù)性試驗(yàn)

選取同一批次小兒健脾散，分別參照供試品溶液Ⅰ、Ⅱ的制備方法平行制備6 份供試品溶液，分別在色譜條件Ⅰ、Ⅱ下進(jìn)樣10 μL，記錄峰面積，計(jì)算含量及RSD 值。黃芪甲苷、歐前胡素、異歐前胡素的平均含量(n=6)依次為0.120 ，0.059，0.037 mg/g，RSD 值分別為1.80%、1.24%、1.62%。

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取供試品溶液Ⅰ、Ⅱ各1 份，分別在色譜條件Ⅰ、Ⅱ下，在第0，2，4，6，10 h 注入液相色譜儀，每次進(jìn)樣10 μL，測定各待測成分的峰面積并計(jì)算RSD值。結(jié)果:黃芪甲苷、歐前胡素、異歐前胡素的RSD值分別為0.43%、0.69%、0.97%。結(jié)果表明:供試品溶液Ⅰ、Ⅱ在10 h 內(nèi)均穩(wěn)定。

2.8 加樣回收率試驗(yàn)

將已知含量的樣品(廣西來賓金錢草藥業(yè)有限公司，批號(hào)090902，黃芪甲苷、歐前胡素和異歐前胡素含量分別為0.120 ，0.059 ，0. 037 mg/g)分為2 組，每組6 份，每份約2.5 g，精密稱定;第1 組置索氏提取器中，精密加入含黃芪甲苷對(duì)照品溶液(99 mg/L)3 mL，按供試品溶液Ⅰ制備方法制備加樣供試品溶液;第2 組亦置索氏提取器中，精密加入歐前胡素對(duì)照品溶液(30.4 mg/L)5 mL 及異歐前胡素對(duì)照品溶液(27.5 mg/L)3 mL(回流提取前先蒸去甲醇)，按供試品溶液Ⅱ制備方法制備加樣供試品溶液。精密吸取對(duì)照品溶液與供試品溶液，分別在色譜條件Ⅰ、Ⅱ下依次注入液相色譜儀，測定黃芪甲苷、歐前胡素及異歐前胡素的含量，計(jì)算回收率。結(jié)果見表2。

表2 黃芪甲苷、歐前胡素、異歐前胡素回收率試驗(yàn)結(jié)果

2.9 檢測限和定量限的測定

取對(duì)照品溶液，分別在色譜條件Ⅰ、Ⅱ下按濃度稀釋法進(jìn)樣分析，測定色譜系統(tǒng)基線噪音。以信噪比3∶1為檢測限，信噪比10∶1為定量限。經(jīng)檢測，黃芪甲苷檢測限為0.09 ng，定量限為0.29 ng;歐前胡素檢測限為0.1 ng，定量限為0.3 ng;異歐前胡素檢測限為0.28 ng，定量限為0.82 ng。

2.10 耐用性試驗(yàn)

取2.1.2 項(xiàng)下供試品溶液Ⅰ、Ⅱ，分別按照色譜條件Ⅰ、Ⅱ，依次使用Phenomenex Luna C18柱、CHROM-MATRIX C18柱和Agilent ZORBAX SB-C18柱，測定供試品溶液中黃芪甲苷、歐前胡素和異歐前胡素的含量。結(jié)果:三者的RSD 值分別為1.9%、1.1%、2.3%。結(jié)果表明:不同品牌的色譜柱對(duì)該方法耐用性良好。

3 討 論

3.1 黃芪供試品溶液的制備方法研究

黃芪藥材在處方中所占比例較低，需要較大取樣量，因此選擇索氏提取法制備供試品溶液。在實(shí)驗(yàn)中，比較了不同的提取時(shí)間和萃取次數(shù)，結(jié)果索氏提取5 h、正丁醇萃取4 次即可將黃芪甲苷提取完全，回收率符合規(guī)定，而乙醚洗滌除雜效果明顯優(yōu)于三氯甲烷，因此選用乙醚洗滌除雜的方法制備黃芪甲苷含測供試品溶液。試驗(yàn)中也嘗試通過D101 大孔樹脂柱除雜，但發(fā)現(xiàn)黃芪甲苷含量下降明顯，而萃取除雜也可取得較為理想的結(jié)果。在供試品提取過程中，氨試液洗滌的靜置時(shí)間長短對(duì)黃芪甲苷含量有較大的影響，通過實(shí)驗(yàn)確定每次氨洗后靜置時(shí)間在2 h 以上時(shí)，黃芪甲苷可提取完全且含量穩(wěn)定［4-5］。

3.2 白芷供試品溶液的制備方法研究

預(yù)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn):乙醚提取物中含有白芷的特征成分歐前胡素和異歐前胡素，且雜質(zhì)明顯少于甲醇超聲提取物。有研究發(fā)現(xiàn):小兒健脾散由乙醚索氏提取5 h 后，濃縮后制成白芷含測的供試品溶液，進(jìn)樣測定，可取得滿意結(jié)果［6-7］。

黃芪甲苷是黃芪的主要有效成分和質(zhì)控指標(biāo)，由于黃芪甲苷紫外吸收較弱，本文采用與2010 版《中國藥典》(一部)黃芪含測項(xiàng)下一致的HPLCELSD 法對(duì)小兒健脾散中黃芪甲苷含量進(jìn)行檢測。歐前胡素和異歐前胡素是白芷的特征成分。本研究利用高效液相色譜法以此3 個(gè)成分在小兒健脾散中的含量為指標(biāo)進(jìn)行測定，結(jié)果表明，該法操作簡便、測定結(jié)果精確、重復(fù)性好、特征性強(qiáng)，能夠有效控制該藥的質(zhì)量，并為保障用藥的合理性及保證臨床用藥的有效性提供了一定的科學(xué)依據(jù)。

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