優(yōu)良醋酸菌的分離鑒定

徐 佳 劉明珠

(南昌理工學(xué)院，江西 南昌 330045)

果醋是以水果或果品加工的下腳料為主要原料，經(jīng)酒精發(fā)酵、醋酸發(fā)酵釀造而成的一種酸性調(diào)味品或飲料[1]。隨著人們生活水平的不斷提高，果醋的保健功能也越來(lái)越受到人們的重視，正掀起喝果醋的熱潮。

在我國(guó)民間，食醋生產(chǎn)通常采用存在于自然界中的醋酸菌進(jìn)行自然發(fā)酵。在工廠為了提高產(chǎn)量和質(zhì)量，避免雜菌污染，采用人工接種的方式進(jìn)行發(fā)酵。果醋品種是影響果醋品質(zhì)的關(guān)鍵因素之一，用于食醋生產(chǎn)的細(xì)菌有紋膜醋酸菌(A.aceti)、許氏醋桿菌(A.schutzenbachii)、奧爾蘭醋酸酐菌(A.rancens)、巴氏醋酸菌(A.pasteurianus)、巴氏亞種(滬釀1.01)等[2]，但目前使用得最多的是：惡臭醋桿菌、渾濁變種、巴氏醋酸菌、巴氏亞種4種醋酸菌[2]。目前國(guó)內(nèi)外對(duì)醋酸菌優(yōu)質(zhì)菌株的分類鑒定及性能等方面已經(jīng)做了大量的研究工作。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種來(lái)源

市購(gòu)殘次水果，洗凈污垢，打漿，置于實(shí)驗(yàn)室，進(jìn)行自然酒精發(fā)酵和醋酸發(fā)酵。待發(fā)酵醪液形成刺激性醋味時(shí)，開始從中篩選天然的醋酸菌種。

1.1.2 儀器設(shè)備

電子天平AE-100型(梅特勒—托利多上海公司)；離心機(jī)LD5-2A型(北京醫(yī)用離心機(jī)廠)；臺(tái)式干燥箱(中國(guó)重慶)；顯微鏡(江西鳳凰光學(xué)儀器有限公司)；生化培養(yǎng)箱LRH-250A型(廣東省醫(yī)療器械廠)；超凈工作臺(tái)(蘇凈集團(tuán)安泰公司制造)；電熱恒溫水浴鍋(上海精密實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)；LS-B501滅菌鍋(上海華線醫(yī)用核子儀器有限公司)；ZHWY-2112B恒溫?fù)u床(上海智城分析儀器制造有限公司)等。

1.1.3 培養(yǎng)基

增殖培養(yǎng)基[1]、分離培養(yǎng)基[2、斜面培養(yǎng)基[3]、休和利夫森二氏培養(yǎng)基[4]、乙醇氧化培養(yǎng)基[4]、牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基[4]、Hoyer-Frateur培養(yǎng)基[4]、牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基[4]、產(chǎn)硫化氫培養(yǎng)基[4]、生酮實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)基[4]、葡萄糖培養(yǎng)基[4]、產(chǎn)葡萄糖酸實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)基[4]、明膠液化培養(yǎng)基[4]、葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基[4]。

1.1.4 試劑

溴百里酚藍(lán)1%(g/v)水溶液[4]、溴酚藍(lán)0.04%(g/v)水溶液[4]、pH7.2 1/15M磷酸緩沖溶液[5]、菲林試劑[4]、甲基紅(Methyl red)指示液[4]、α-萘酚溶液[4]。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 菌種的分離[1]

水果→清洗→去核、切塊→打漿→自然酒精發(fā)酵→自然醋酸發(fā)酵→菌源→增殖培養(yǎng)→稀釋平板分離→初篩→斜面培養(yǎng)→純化→斜面保藏菌株。

1.2.2 菌種的形態(tài)學(xué)鑒定[4-6]

1.2.2.1 菌落形態(tài)觀察：利用劃線分離法以及簡(jiǎn)單染色法進(jìn)行觀察。

1.2.2.2 鞭毛生長(zhǎng)情況的觀察：半固體直立柱穿刺線上群體生長(zhǎng)是否擴(kuò)散來(lái)判斷。

1.2.2.3 革蘭氏染色：用細(xì)菌的革蘭氏染色法觀察顏色(注：做革蘭氏染色的菌的培養(yǎng)不能超過(guò)24h，以免出現(xiàn)假陰性)。

1.2.3 菌株的特殊生理特征實(shí)驗(yàn)[4-6]

1.2.3.1 葡萄糖的氧化發(fā)酵測(cè)定

用18-24h的幼齡菌做種子，穿刺接種于休和利夫森二氏培養(yǎng)基，每株4支。其中兩支用滅菌的凡士林油封蓋，約0.5-1cm厚，以隔絕空氣為閉管。另兩只為開管。同時(shí)還要有不接種的閉管作對(duì)照。將試管置于30℃的溫箱內(nèi)培養(yǎng)1，2，4，7，14d觀察結(jié)果。(注：本試驗(yàn)可同時(shí)觀察細(xì)菌的運(yùn)動(dòng)性。)

1.2.3.2 乙醇的氧化

接種兩環(huán)菌株P(guān)-7于乙醇氧化培養(yǎng)基試管中，置于30℃的溫箱內(nèi)培養(yǎng)內(nèi)培養(yǎng)1，2，4，7，14d觀察產(chǎn)酸變黃者為陽(yáng)性，不變黃者為陰性。

1.2.3.3 乙酸的氧化

觀察培養(yǎng)分離培養(yǎng)基上的細(xì)菌生長(zhǎng)狀況，置于30℃的溫箱內(nèi)培養(yǎng)內(nèi)2d，能使CaCO3形成白色透明圈，繼續(xù)培養(yǎng)2，3，5，7天，乙酸將進(jìn)一步氧化分解，產(chǎn)生CO2和水，菌落周圍出現(xiàn)白色暈圈者為陽(yáng)性否則為陰性。

1.2.3.4 接觸酶試驗(yàn)

將菌株P(guān)-7接種于牛肉膏蛋白胨斜面上，置于30℃的溫箱內(nèi)培養(yǎng)2天。滴一滴5%的過(guò)氧化氫在一片載玻片上，用接種環(huán)接取一小環(huán)斜面上的菌株與玻片上，觀察，如有氣泡產(chǎn)生則為陽(yáng)性，無(wú)氣泡則為陰性。

1.2.3.5 生酮試驗(yàn)

接種兩環(huán)菌株于五支生酮實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)基的試管中，另兩支試管做空白對(duì)照，置于30℃的溫箱內(nèi)培養(yǎng)。分別取10mL的A液和10mL的B液混合配制成為斐林試劑。分別滴加兩滴斐林試劑于7支試管中，將試管放入盛有100℃的水浴過(guò)中20min后，觀察試管顏色的變化，若有磚紅色的沉淀出現(xiàn)則為陽(yáng)性，若顏色不變則為陰性。

1.2.3.6 乙醇生長(zhǎng)試驗(yàn)

分別用接種環(huán)接種兩環(huán)菌株P(guān)-7于五支Hoyer-Frateur液態(tài)培養(yǎng)基試管中，另兩支作為空白對(duì)照，置于30℃的溫箱內(nèi)培養(yǎng)1，2，4，7，14d，觀察培養(yǎng)基的變化，若有渾濁出現(xiàn)則表示細(xì)菌有生長(zhǎng)為陽(yáng)性，否則，為陰性。

1.2.3.7 產(chǎn)硫化氫試驗(yàn)

將產(chǎn)硫化氫培養(yǎng)基試管置于30℃的溫箱內(nèi)培養(yǎng)1，2，4，7，14天，觀察醋酸鉛紙條顏色的變化，若紙條的顏色變黑者為陽(yáng)性，不變者為陰性。

1.2.3.8 產(chǎn)纖維素試驗(yàn)

用接種環(huán)將菌株P(guān)-7使用劃線法接種于葡萄糖培養(yǎng)基平板上，置于30℃的溫箱內(nèi)培養(yǎng)4天。觀察菌體生長(zhǎng)情況，將平皿蓋打開，在葡萄糖培養(yǎng)基菌落上滴加碘滴入少量Lugol’s碘液于平皿中，輕輕旋轉(zhuǎn)平皿，使碘液均勻鋪滿整個(gè)平皿，并滴加60%的濃硫酸，若培養(yǎng)基上出現(xiàn)黃色表明不產(chǎn)生纖維素，為陽(yáng)性，否則，為陰性。

1.2.3.9 淀粉水解試驗(yàn)

在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基中加入 0.2%的可溶性淀粉，0.1Mpa滅菌20min后，倒平板，用接種環(huán)將菌株P(guān)-7使用劃線法接種于此培養(yǎng)基平板上，置于30℃的溫箱內(nèi)培養(yǎng)4d。觀察菌體生長(zhǎng)情況，將平皿蓋打開，滴入少量Lugol’s碘液于平皿中，輕輕旋轉(zhuǎn)平皿，使碘液均勻鋪滿整個(gè)平皿。如菌臺(tái)周圍出現(xiàn)無(wú)色透明圈，說(shuō)明淀粉已被水解，為陽(yáng)性。透明圈的大小可初步判斷該菌水解淀粉能力的強(qiáng)弱。

1.2.3.10 產(chǎn)葡萄糖酸試驗(yàn)

用接種環(huán)將菌株P(guān)-7使用劃線法接種于產(chǎn)葡萄糖酸培養(yǎng)基平板上，置于30℃的溫箱內(nèi)培養(yǎng)1，2，4，7，14d 。觀察菌落的生長(zhǎng)狀態(tài)及其周圍的狀態(tài)，若菌落周圍形成透明圈則表示有葡萄糖酸產(chǎn)生為陽(yáng)性，否則，為陰性。

1.2.3.11 明膠液化試驗(yàn)

將七支明膠液化培養(yǎng)基試管至于裝有冰塊的杯中，待其凝固，用穿刺法接種菌株P(guān)-7于五支試管中，另兩支作為空白對(duì)照，置于30℃的溫箱內(nèi)培養(yǎng)1，2，4，7，14d。觀察時(shí)，將試管放入裝有冰塊的杯中，待其凝固，觀察，若有明膠被細(xì)菌液化，即使在低溫下明膠也不會(huì)再凝固，則為陽(yáng)性，否則，為陰性。

1.2.3.12 甲基紅(M.R)試驗(yàn)

用接種環(huán)分別接種兩環(huán)菌株P(guān)-7于葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基的試管中，置于30℃的溫箱內(nèi)培養(yǎng)4d。取出培養(yǎng)好的試管沿試管壁加入M.R試劑3-4滴，觀察是否變色，若培養(yǎng)基由原來(lái)的橘黃色變?yōu)榧t色則為陽(yáng)性反映，否則，為陰性。

1.2.3.13 乙酰甲基甲醇(V.P)試驗(yàn)

用接種環(huán)分別接種兩環(huán)菌株P(guān)-7于葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基的試管中，置于30℃的溫箱內(nèi)培養(yǎng)4d。取出培養(yǎng)好的試管，在培養(yǎng)基中加入40%的NaOH溶液15滴，再加入α-萘酚溶液15滴，用力震蕩，在沸水浴中加熱2min。如培養(yǎng)基出現(xiàn)紅色為V.P正反應(yīng)，否則，為陰性。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株P(guān)-7的形態(tài)鑒定

菌種的形態(tài)特征是鑒別菌種的重要特征參考。所篩選的菌株P(guān)-7在分離培養(yǎng)基上培養(yǎng)1d的菌落形態(tài)特征和鏡檢結(jié)果:

表2-1 菌株P(guān)-7的菌落形態(tài)

表2-2 菌體P-7形態(tài)的鏡鑒結(jié)果

2.2 菌株P(guān)-7的生理生化鑒定

2.2.1 葡萄糖的氧化發(fā)酵測(cè)定結(jié)果

在經(jīng)過(guò)7d的培養(yǎng)之后，開管于休和利夫森二氏培養(yǎng)基的顏色由黃色變?yōu)榘咨?/p>

閉管于休和利夫森二氏培養(yǎng)基的顏色幾乎沒(méi)有變化，仍為黃色。溴百里酚藍(lán)的變色范圍為pH6-7.6，顏色變化為黃—綠—藍(lán)，由于開管產(chǎn)酸，所以顏色由黃色變淡，而閉管不產(chǎn)酸，說(shuō)明P-7菌株能氧化產(chǎn)酸。

2.2.2 乙醇的氧化結(jié)果

在經(jīng)過(guò)4d的培養(yǎng)后，試管中的液態(tài)乙醇氧化培養(yǎng)基上部由原來(lái)的淡藍(lán)色變?yōu)榈S色，而在7d的培養(yǎng)后，試管全部變?yōu)榱说S色，表明，反應(yīng)為陽(yáng)性，且氧化能力很強(qiáng)。

2.2.3 乙酸的氧化結(jié)果

菌落周圍出現(xiàn)白色暈圈，反應(yīng)為陽(yáng)性。

2.2.4 接觸酶試驗(yàn)結(jié)果

當(dāng)挑有菌株的接種環(huán)與滴有一滴5%的過(guò)氧化氫的載玻片上時(shí)，會(huì)產(chǎn)生氣泡，反應(yīng)為陽(yáng)性。

2.2.5 生酮試驗(yàn)結(jié)果

在100℃的水浴過(guò)中20min后，試管底部有磚紅色的沉淀出現(xiàn)，反應(yīng)為陽(yáng)性。

2.2.6 乙醇生長(zhǎng)試驗(yàn)結(jié)果

在經(jīng)過(guò)7d的培養(yǎng)后Hoyer-Frateur培養(yǎng)基中試管中有渾濁出現(xiàn)，表明，菌株P(guān)-7在Hoyer-Frateur培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，反應(yīng)為陽(yáng)性。

2.2.7 產(chǎn)硫化氫試驗(yàn)結(jié)果

圖2-1 產(chǎn)硫化氫試驗(yàn)

由圖2-1可知，在經(jīng)過(guò)7d的培養(yǎng)后，醋酸鉛紙條的顏色變黑，表明，菌株P(guān)-7產(chǎn)硫化氫，反應(yīng)為陽(yáng)性。

2.2.8 產(chǎn)纖維素試驗(yàn)結(jié)果

在涂布了Lugol’s碘液的葡萄糖培養(yǎng)基上滴入60%的濃硫酸后，發(fā)現(xiàn)葡萄糖平板上不出現(xiàn)黃色，表明，菌株P(guān)-7不產(chǎn)生纖維素，反應(yīng)為陰性。

2.2.9 淀粉水解試驗(yàn)結(jié)果

在加入0.2%的可溶性淀粉牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基中加入Lugol’s碘液后，菌臺(tái)周圍沒(méi)有出現(xiàn)無(wú)色透明圈，表明，菌株P(guān)-7無(wú)分解淀粉的能力，反應(yīng)為陰性。

2.2.10 產(chǎn)葡萄糖酸試驗(yàn)結(jié)果

在產(chǎn)葡萄糖酸培養(yǎng)基上，菌落周圍有白色透明圈出現(xiàn)，表明，菌株P(guān)-7有產(chǎn)生葡萄糖酸的能力，反應(yīng)為陽(yáng)性。

2.2.11 明膠液化試驗(yàn)結(jié)果

菌株P(guān)-7在明膠液化培養(yǎng)基試管中培養(yǎng)7d后無(wú)明膠液化現(xiàn)象，反應(yīng)為陰性。

2.2.12 甲基紅(M.R)試驗(yàn)結(jié)果與乙酰甲基甲醇(V.P)試驗(yàn)結(jié)果

圖2-2 甲基紅(M.R)試驗(yàn) 圖2-3 乙酰甲基甲醇(V.P)試驗(yàn)

由圖2-2可知，菌株P(guān)-7在葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)液試管中培養(yǎng)4d，在加入M.R試劑后，試管中葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基由原來(lái)的橘黃色變?yōu)榧t色，反應(yīng)為M.R陽(yáng)性。

由圖2-3可知，菌株P(guān)-7在葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)液試管中培養(yǎng)4d，在試管中加入40%的NaOH溶液15滴，然后再加入α-萘酚溶液15滴，用力震蕩，于沸水浴中加熱2min后，培養(yǎng)液無(wú)明顯顏色變化，只是顏色稍有加深無(wú)紅色出現(xiàn)，反應(yīng)為V.P陰性。

3 結(jié)論

從自然酒精發(fā)酵和醋酸發(fā)酵，待發(fā)酵醪液形成刺激性醋味后，通過(guò)增殖培養(yǎng)基和鈣平板分離培養(yǎng)基中選擇小而規(guī)則且周圍透明圈大的菌株接斜面，純化，篩選出菌株P(guān)-7。其各生理生化指標(biāo)見(jiàn)表3-1。

表3-1 菌株P(guān)-7各生理生化指標(biāo)

通過(guò)特征培養(yǎng)、個(gè)體形態(tài)和生理生化試驗(yàn)結(jié)果，對(duì)照第八版《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》，確認(rèn)菌株P(guān)-7為醋酸醋酸細(xì)菌醋酸亞種subsp.aceti。

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