VEGF在EAE大鼠血清中的表達及意義

楊慧敏，蹇順海，黃一凡，李祖茂

(川北醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理學(xué)教研室，四川 南充 637000)

多發(fā)性硬化(multiple sclerosis，MS)是以中樞神經(jīng)系統(tǒng)白質(zhì)炎性脫髓鞘病變?yōu)橹饕攸c的自身免疫性疾病，具有較高的致殘率。近幾年的研究提出了自身免疫、病毒感染、遺傳傾向等綜合作用的多因素病因?qū)W說，但其病因和發(fā)病機制至今仍未完全明確。目前多采用敏感動物制作與MS發(fā)病極為相似的疾病模型即實驗性自身免疫性腦脊髓炎(experimental autoimmune encephalomyelitis，EAE)模型對MS進行研究。有國外研究者[1]在EAE疾病進展中觀察到血管生成現(xiàn)象，且與臨床表現(xiàn)保持平行，但其與髓鞘炎性破壞的具體關(guān)系目前尚未見相關(guān)研究。本研究擬通過復(fù)制大鼠EAE模型，觀察與血管生成有重要關(guān)系的血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)的表達，探討其與EAE發(fā)生發(fā)展的關(guān)系及其臨床意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物與分組 健康雌性Wistar大鼠30只，體重180～220 g，隨機分組為模型組20只及對照組10只；豚鼠1只，體重350 g，均由川北醫(yī)學(xué)院動物實驗中心提供。

1.1.2 主要試劑 卡介苗凍干粉、百日咳菌液購自中國藥品生物制品檢定所，羊毛脂、液體石蠟購自南充藥業(yè)集團；固藍(luxol fast blue,LFB)購自SIGMA公司；大鼠VEGF、IL-4、IL-10及IFN-γ ELISA試劑盒購自欣博盛生物科技有限公司，大鼠髓鞘堿性蛋白(myelin basic protein，MBP)ELISA試劑盒購自武漢優(yōu)爾生科技股份有限公司。

1.2 方法

1.2.1 動物模型制作 羊毛脂20 g加入液體石蠟40 mL混勻，滅菌后每毫升加入卡介苗4～10 mg混勻即成完全弗氏佐劑，將豚鼠全腦及脊髓制成50%腦脊髓勻漿，與完全弗氏佐劑1∶1充分混勻即得到完全抗原。模型組20只，麻醉消毒后于四肢足墊內(nèi)注射完全抗原0.4 mL/只，同時腹部皮內(nèi)注射百日咳菌液0.1 mL(約含活菌3×109)，對照組10只，麻醉消毒后僅足墊注射等量生理鹽水。

1.2.2 模型判定 每日稱重，并參照Hooper等[2]的方法進行評分：0分：不發(fā)病；1分：豎毛，尾無力；2分：尾癱；3分：尾癱及后肢無力；4分：尾癱及不完全后肢癱；5分：完全后肢癱；6分：四肢癱；7分：瀕死或死亡。

1.2.3 取材 將模型組大鼠于發(fā)病高峰時(癥狀連續(xù)3 d無加重或評分6～7分時)處死，對照組大鼠于模型組全部處死同時處死。深度麻醉后，抽取右心房血液備用，用小號靜脈留置針經(jīng)左心室穿刺，再用生理鹽水推注沖洗及4%多聚甲醛灌注固定后取全腦、脊髓。

1.2.4 病理學(xué)觀察 分離的大鼠全腦及脊髓用4%多聚甲醛固定24～48 h后行石蠟包埋切片及HE、LFB染色。

1.2.5 用ELISA檢測各因子在各組大鼠血清中的濃度 大鼠血液在促凝管中靜置30 min，3 000 r/min離心10 min分離血清，按試劑盒說明書用ELISA法檢測血清中VEGF、IL-4、IL-10、IFN-γ及MBP濃度。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 EAE發(fā)病情況及病理學(xué)觀察

2.1.1 發(fā)病情況 全部模型組大鼠于免疫后(13.33±1.88) d開始出現(xiàn)癥狀，發(fā)病率為100%。具體表現(xiàn)為進食及活動減少，體重下降，進而尾部無力、后肢無力、大小便失禁、前肢無力等，觀察期間未出現(xiàn)死亡者。模型組發(fā)病高峰臨床評分為(4.4±1.35)分。對照組進食、活動情況良好，體重?zé)o減輕，無一發(fā)病。

2.1.2 病理學(xué)觀察 (1)HE染色：EAE主要的光鏡下形態(tài)學(xué)表現(xiàn)為炎癥性改變，主要表現(xiàn)為腦脊髓炎性水腫，血管擴張充血，以淋巴細胞為主的炎細胞浸潤。實驗組于發(fā)病高峰期取材、染色后觀察發(fā)現(xiàn)，大鼠的大腦、小腦及脊髓中有大量炎細胞浸潤，并可圍繞血管呈“血管袖套樣”改變，以脊髓及小腦病變最為明顯，主要集中于脊髓表面蛛網(wǎng)膜下腔及近表面的白質(zhì)內(nèi)，炎細胞浸潤明顯區(qū)由于水腫，組織間隙增寬。對照組大鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)未見明顯改變(圖1)。(2)LFB染色：LFB可將正常髓鞘染成藍色，EAE病理改變?yōu)檠仔运枨拭撌?，故脫髓鞘區(qū)不被LFB染色或只見髓鞘碎片。模型組大鼠發(fā)病高峰時中樞神經(jīng)系統(tǒng)在炎細胞浸潤明顯區(qū)可見明顯髓鞘脫失，呈空泡狀改變，病變較輕區(qū)域可見髓鞘碎片(圖2)。對照組大鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)未見明顯脫髓鞘病變。

2.2 大鼠血清中各細胞因子表達檢測

模型組大鼠發(fā)病高峰時血清中VEGF、IFN-γ及MBP水平較對照組明顯升高，IL-4水平較對照組降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。模型組血清IL-10水平與對照組相比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(表1)。

表1 大鼠血清中各細胞因子表達情況及組間比較

VEGFIFN-γIL-4IL-10MBP模型組29.98±14.8420.71±12.3482.88±38.4211.53±8.5422.47±13.34對照組19.70±10.447.91±4.48144.91±30.155.24±1.154.69±2.65P值0.0430.0220.0190.2320.000t值2.1232.241-2.6161.2434.715

2.3 相關(guān)性分析

模型組大鼠中，臨床癥狀評分與VEGF水平呈顯著正相關(guān)(P<0.01)，與IFN-γ及MBP水平亦呈正相關(guān)，與IL-4水平呈負相關(guān)，相關(guān)性存在統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)，與IL-10水平無明顯相關(guān)性(表2)。模型組大鼠血清中VEGF水平與IFN-γ及MBP水平呈正相關(guān)，與IL-4水平呈負相關(guān)，相關(guān)性存在統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)，與IL-10水平無明顯相關(guān)性(表3)。

表2 模型組臨床評分與各細胞因子表達的相關(guān)性

表3 模型組VEGF與其余各細胞因子表達的相關(guān)性

3 討論

MS的確切發(fā)病機制仍不十分清楚，目前多認為是T淋巴細胞介導(dǎo)的炎性反應(yīng)，細胞因子在其中起著重要作用。研究表明，MS患者中存在Thl/Th2類細胞因子的失衡，Th1細胞主要分泌促炎癥性細胞因子(如IL-2、IL-12、IL-17、IFN-γ、TNF-α等)，可激活巨噬細胞，介導(dǎo)遲發(fā)性變態(tài)反應(yīng)誘發(fā)EAE；Th2細胞主要分泌抑炎癥性細胞因子(如IL-4、IL-5、IL-10、IL-6等)，可促進B細胞分化成熟，產(chǎn)生抗體，增強抗體介導(dǎo)的免疫應(yīng)答，抑制或逆轉(zhuǎn)EAE的發(fā)生。細胞因子在EAE發(fā)病及病情進展中起著重要而復(fù)雜的調(diào)節(jié)作用[3-5]。

EAE作為MS經(jīng)典動物模型，其病理改變與MS相似[6]，主要是腦和脊髓實質(zhì)內(nèi)小血管周圍和蛛網(wǎng)膜下腔內(nèi)有大量淋巴細胞浸潤。淋巴細胞在血管周圍形成典型的袖套狀改變，病變部位髓鞘崩解、脫失，神經(jīng)細胞變性、壞死，上述改變亦可以在我們的實驗中觀察到。研究發(fā)現(xiàn)[7-8]，EAE急性損害還包括血腦屏障(blood brain barrier，BBB)分解和病灶內(nèi)毛細血管內(nèi)皮細胞上黏附分子上調(diào)，提示血管通透性改變和內(nèi)皮細胞的活化是MS發(fā)病機制中的重要部分。Th1細胞因子在其發(fā)病中的作用可能是通過上調(diào)病灶內(nèi)毛細血管內(nèi)皮細胞上黏附分子，使活化的T細胞得以穿過BBB進入腦實質(zhì)中[9]，另外Th1細胞因子還可誘導(dǎo)基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMPs)表達，促進BBB破壞和繼發(fā)腦組織損傷。

VEGF具有促進新生血管生成、增加血管通透性和促進單核細胞游走等功能[10]。而局部組織的缺血和缺氧可誘導(dǎo)VEGF的產(chǎn)生，與其相應(yīng)的受體結(jié)合，激活內(nèi)皮細胞，促進內(nèi)皮細胞的增殖和遷移、基底膜的降解及表達某些整合素。研究者發(fā)現(xiàn)，血清VEGF水平在MS患者急性復(fù)發(fā)期較健康對照組或MS緩解期有所增加[11]；Proescholdt等[7]研究發(fā)現(xiàn)，MS脫髓鞘損害中VEGF表達有顯著增高，且病灶內(nèi)血管數(shù)目增高與臨床及病理表現(xiàn)(即炎癥細胞浸潤和脫髓鞘)進展保持平行。

在本研究中，我們成功復(fù)制了大鼠EAE模型，模型組大鼠均不同程度出現(xiàn)由尾部開始的運動功能障礙癥狀。大多數(shù)EAE研究采用Kono’s 5分法[12]進行癥狀評分，但5分的分類相對粗略而不利于統(tǒng)計學(xué)分析，為了對癥狀的觀察和評價更加敏感和精細，我們采用Hooper’s改良后的7分法作為EAE神經(jīng)功能損傷評分法，模型組發(fā)病高峰臨床評分為(4.4±1.35)分。因欲觀察EAE大鼠癥狀最明顯時病理表現(xiàn)與細胞因子表達的關(guān)系，我們在發(fā)病高峰時獲取大鼠的組織及血清檢材。

在我們的研究中發(fā)現(xiàn)，VEGF在EAE大鼠血清中表達較對照組有明顯增高，且與動物模型發(fā)病臨床評分呈顯著正相關(guān)，提示VEGF的增高很可能與EAE病變的進展有關(guān)；同時，VEGF與血清IFN-γ及MBP水平升高相一致(前者表示促炎因子的水平，后者可表示髓鞘損傷的程度)，與IL-4水平(可表示抑炎因子的水平)升高呈負相關(guān)，相關(guān)性檢驗具有統(tǒng)計學(xué)意義。與對照組相比，IL-4水平在模型組中顯著下降，IFN-γ水平顯著增高；IFN-γ在模型組大鼠血清中的水平與其臨床評分呈正相關(guān)，IL-4水平與臨床評分呈負相關(guān)，均具有統(tǒng)計學(xué)意義，與前人研究結(jié)果相符[3]。

綜合上述發(fā)現(xiàn)，我們認為，EAE時血清中增高的VEGF可以是炎癥區(qū)的血管內(nèi)皮細胞釋放及巨噬細胞產(chǎn)生[13]，在其病變進展中，VEGF可能通過活化炎區(qū)的血管內(nèi)皮細胞產(chǎn)生作用：(1)誘導(dǎo)活化的血管內(nèi)皮細胞分泌MMPs，降解細胞外基質(zhì)，促進炎細胞浸潤；(2)使血管通透性增高，局部趨化浸潤的炎細胞增多，釋放促炎因子，一方面直接參與炎癥過程，另一方面使血管內(nèi)皮細胞上黏附分子表達上調(diào)而促進炎細胞浸潤，進一步破壞BBB；(3)誘導(dǎo)炎區(qū)新生血管形成，新生血管的內(nèi)皮細胞不成熟，基底膜不完整，通透性大，炎細胞易于通過而進入病區(qū)。VEGF通過上述可能的機制與炎細胞釋放的細胞因子及調(diào)高的MMPs共同作用或誘導(dǎo)新生血管形成，致BBB免疫屏障受損，炎細胞到達CNS白質(zhì)參與炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致髓鞘破壞。這可能為MS的治療打開新的思路，即抑制VEGF，使與之相關(guān)的炎癥促進因素得到控制，從而減輕炎癥破壞。

當(dāng)然，MS及其模型EAE的發(fā)病機制目前認識不足，VEGF與之病變進展的研究也才剛開始，對于其中的確切聯(lián)系及抑制VEGF對MS及EAE是否有效還有待進一步研究。

【參考文獻】

[1]Kirk SL,Karlik SJ.VEGF and vascular changes in chronic neuroinflammation[J].J Autoimmun,2003,21(4):353-363.

[2]Hooper DC,Spitsin S,Kean RB,et al.Uric acid,a natural scavenger of peroxynitrite,in experimental allergic encephalomyelitis and multiple sclerosis[J].Proc Natl Acad Sci USA,1998,95(2):675-680.

[3]Amedei A,Prisco D,D’Elios MM.Multiple sclerosis:the role of cytokines in pathogenesis and in therapies[J].Int J Mol Sci,2012,13(10):13438-13460.

[4]Hamann I,Zipp F,Infante-Duarte C.Therapeutic targeting of chemokine signaling in Multiple Sclerosis[J].J Neurol Sci,2008,274(1-2):31-38.

[5]Comabella M,Khoury SJ.Immunopathogenesis of multiple sclerosis[J].Clin Immunol,2012,142(1):2-8.

[6]朱振國，王新施，陳艷艷，等.3種大鼠實驗性自身免疫性腦脊髓炎模型的差異[J].醫(yī)學(xué)研究雜志，2013,42(2):34-37.

[7]Proescholdt MA,Jacobson S,Tresser N,et al.Vascular endothelial growth factor is expressed in multiple sclerosis plaques and can induce inflammatory lesions in experimental allergic encephalomyelitis rats[J].J Neuropathol Exp Neurol,2002,61(10):914-925.

[8]Argaw AT,Asp L,Zhang J,et al.Astrocyte-derived VEGF-A drives blood-brain barrier disruption in CNS inflammatory disease[J].J Clin Invest,2012,122(7):2454-2468.

[9]O’Connor RA,Prendergast CT,Sabatos CA,et al.Cutting edge:Th1 cells facilitate the entry of Th17 cells to the central nervous system during experimental autoimmune encephalomyelitis[J].J Immunol,2008,181(6):3750-3754.

[10]Carvalho JF,Blank M,Shoenfeld Y.Vascular endothelial growth factor(VEGF)in autoimmune diseases[J].J Clin Immunol,2007,27(3):246-256.

[11]Su JJ,Osoegawa M,Matsuoka T,et al.Upregulation of vascular growth factors in multiple sclerosis:correlation with MRI findings[J].J Neurol Sci,2006,243(1):21-30.

[12]Urban JL,Kumar V,Kono DH,et al.Restricted use of T cell receptor V genes in murine autoimmune encephalomyelitis raises possibilities for antibody therapy[J].Cell,1988,54(4):577-592.

[13]Jeon SH,Chae BC,Kim HA,et al.Mechanisms underlying TGF-beta 1-induced expression of VEGF and Flk-1 in mouse macrophages and their implications for angiogenesis[J].J Leukoc Biol,2007,81(2):557-566.