3-MA 對三氧化二砷誘導(dǎo)Jurkat 細胞凋亡作用的影響①

王艷婕 牛志國 郭繼強 王 輝 牛新清 (新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)研究中心，新鄉(xiāng) 453003)

自噬對腫瘤細胞具有雙重作用，是繼壞死和凋亡后發(fā)現(xiàn)的第3 種細胞死亡形式。自噬通過清除腫瘤細胞內(nèi)折疊異常的蛋白和功能異常的細胞器來抑制腫瘤的發(fā)生，同時腫瘤細胞可利用自噬作用使自身在營養(yǎng)缺乏和低氧的狀況下得以存活［1，2］。在多種腫瘤放化療的過程中，可以觀察到腫瘤細胞的自噬水平明顯升高［3］。這一現(xiàn)象提示，自噬可能是腫瘤細胞放化療耐受的一種機制，抑制腫瘤細胞的自噬可能會增強腫瘤細胞對放化療的敏感性［4］。因此，自噬抑制劑與常規(guī)治療的聯(lián)合應(yīng)用可能是提高療效的潛在手段。三氧化二砷(As2O3)是臨床上常用的抗腫瘤藥，通過誘導(dǎo)腫瘤細胞的分化和凋亡有效治療多種惡性腫瘤。本研究探討了自噬特異性抑制劑3-甲基腺嘌呤(3-MA)對As2O3誘導(dǎo)的Jurkat 細胞凋亡的影響及機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 急性T 細胞白血病細胞系Jurkat細胞株由新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院免疫中心實驗室王輝教授惠贈。XTT 及硫酸酚嗪甲脂(PMS)均為Sigma 公司產(chǎn)品，三氧化二砷(As2O3)為哈爾濱伊達藥業(yè)有限公司產(chǎn)品，3-MA 為Sigma 公司產(chǎn)品，AnnexinV-FITC 凋亡檢測試劑盒購自嘉美生物，RPMI1640 為Gibco 公司產(chǎn)品，胎牛血清杭州購自四季青生物公司。ECL發(fā)光試劑盒購自碧云天生物技術(shù)有限公司;兔抗人微管相關(guān)蛋白1 輕鏈3B (microtubule associated protein 1 light chain 3B，LC-3B)抗體購自Sigma;β-actin單克隆抗體(mAb)、HRP 標記的山羊抗兔二抗、HRP 標記的山羊抗小鼠二抗、FITC 標記的山羊抗兔二抗購自Proteintech。

1.2 實驗方法

1.2.1 XTT 檢測不同濃度As2O3對Jurkat 細胞生長抑制作用 取對數(shù)生長期Jurkat 細胞，調(diào)整細胞濃度10 ×104ml-1，均以80 μl/孔種植于96 孔細胞培養(yǎng)板，加入不同終濃度(2.5、5.0、10.0、20.0、40.0 μmol/L)的As2O3處理細胞24 h 后檢測細胞生長指數(shù)，選擇最佳濃度分別于0、24、48 h 檢測細胞生長抑制作用。每個藥物濃度設(shè)置三個復(fù)孔，以不加藥物孔的細胞培養(yǎng)液作為空白對照，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育后加入終濃度為0.2 mg/ml 的XTT 及終濃度為25 μmol/ml 的PMS 混合液20 μl/孔，于培養(yǎng)箱中避光孵育2 h 后，在酶標儀上450 nm，630 nm雙波長測定OD 值，A 值3 孔取均值。計算不同藥物濃度下的細胞生長指數(shù)和生長抑制率。細胞生長指數(shù)(%)=實驗組OD 值/對照組OD 值。抑制率=［(OD 對照組-OD 加藥組)/OD 對照組］×100%。

1.2.2 透射電鏡觀察各組細胞自噬變化 取對數(shù)生長期細胞，用RPMI 培養(yǎng)液調(diào)整細胞濃度為1 ×106ml-1，接種于6 孔板，每孔加入細胞懸液2 ml，培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)2 h 后加藥。第一孔為對照不加藥組，后三孔加藥組使As2O3終濃度為2.5、5、10 μmol/L，每組設(shè)3 個復(fù)孔，培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h 后收集細胞，離心后2.5%戊二醛固定液固定細胞。

1.2.3 免疫印跡 24 孔板每孔加入含有1 ×106個Jurkat 細胞的1 ml 細胞懸液，對照組加入PBS，實驗組加入終濃度為5 μmol/L As2O3，單獨或聯(lián)合加入10 mmol/L 的3-MA;培養(yǎng)24 h 和48 h 后提蛋白，免疫印跡檢測β-actin 蛋白及LC-3B 蛋白表達。一抗1∶1 000 稀釋，4℃過夜，二抗1∶1 000 稀釋，室溫孵育1.5 h，ECL 發(fā)光。

1.2.4 流式細胞術(shù)檢測Jurkat 細胞LC-3B 的表達24 孔板每孔加入含有1 ×106個Jurkat 細胞的1 ml細胞懸液，加入終濃度為5 μmol/L As2O3，培養(yǎng)24 h和48 h 后，收集細胞;2 ml/L Triton-X100 室溫15 min，加入10 μl LC-3B mAb 或正常鼠血清(同型對照)室溫孵育30 min;PBS 洗滌2 次后加入FITC 標記的二抗，室溫孵育30 min，PBS 洗滌2 次，300 目過濾后上機檢測。以實驗組平均熒光強度(mean fluorescence intensity，MFI)除以同一批同型對照的均數(shù)表示LC-3B 的表達水平。

1.2.5 流式細胞儀檢測Jurkat 細胞凋亡 取對數(shù)生長期細胞，用RPMI 培養(yǎng)液調(diào)整細胞濃度為1 ×106ml-1，接種于6 孔板，每孔加入細胞懸液2 ml，培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。24 h 后加藥，第一孔為對照組，后兩孔使藥物終濃度為As2O35 μmol/L，As2O35 μmol/L 聯(lián)合3-MA 10 mmol/L，每組設(shè)3 個復(fù)孔，放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。藥物作用24 h 后收集細胞，將細胞懸于300 μl Binding Buffer;先后加入5 μl AnnexinV-FITC和5 μl 的碘化丙啶(PI)，輕輕混勻，避光，室溫反應(yīng)15 min，流式細胞儀檢測各組細胞凋亡率。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS13.0 軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。數(shù)據(jù)以±s 表示，組間分析進行t 檢驗，P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 As2O3對Jurkat 細胞增殖的影響 As2O3處理Jurkat 細胞24 h 后，2.5、5、10、20、40 μmol/L 的細胞生長指數(shù)分別為(97.33±0.32)%、(80.57±1.05)%、(74.70±0.50)%、(70.40±0.17)%、(71.20±0.49)%，As2O3濃度自5.0 μmol/L 開始有明顯作用，隨著濃度增加抑制率增強(P ＜0.01，圖1)。不同濃度As2O3分別處理細胞24 h 后，電鏡結(jié)果顯示，正常對照組細胞膜完整，細胞核染色質(zhì)均勻。2.5 μmol/L As2O3作用Jurkat 細胞后，電鏡下可見少量雙層膜結(jié)構(gòu)的自噬體;5.0 μmol/L As2O3作用Jurkat 細胞后，出現(xiàn)細胞體積縮小、胞漿濃縮、胞核體積減小，可見核染色質(zhì)聚集或沿核膜收縮邊集，部分染色質(zhì)致密成斑塊狀，此種超微結(jié)構(gòu)明顯區(qū)別于正常及死亡細胞，為典型的初期凋亡形態(tài)。同時胞質(zhì)內(nèi)仍可見較多的自噬體和其特征性獨立雙層膜結(jié)構(gòu);10 μmol/L As2O3作用Jurkat 細胞后，可見細胞器腫脹，細胞核稀疏成網(wǎng)狀，細胞膜破裂，細胞腫脹等壞死形態(tài)特征的出現(xiàn)，同時胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)了更多的自噬體，見圖2?？紤]臨床用藥有效性及安全性，選用As2O3最佳濃度5 μmol/L 分別處理Jurkat 細胞0、24、48 h 后，Jurkat 細胞的生長抑制率分別為(1.4±1.2)%、(21.7±5.3)%、(58.9±9.4)%，24 h 和48 h 均明顯表現(xiàn)為明顯的細胞毒作用，且隨著時間的增加逐漸增強(P ＜0.05，圖3)。

圖1 As2O3對Jurkat 細胞增殖的影響Fig.1 As2O3inhibit proliferation of Jurkat cells

圖2 As2O3對Jurkat 細胞超微結(jié)構(gòu)的影響Fig.2 Ultrastructure of As2O3on Jurkat cells

圖3 As2O3對Jurkat 細胞的生長抑制率Fig.3 Growth inhibition rate of As2O3on Jurkat cells

圖4 免疫印跡檢測As2O3處理后LC-3B 蛋白的表達Fig.4 LC-3B protein expression of As2O3on Jurkat cells by western blot

圖5 流式細胞技術(shù)檢測As2O3處理后LC-3B 的表達Fig.5 LC-3B protein expression of As2O3on Jurkat cells by flow cytometry

2.2 As2O3處理后LC3 蛋白的表達 5 μmol/L 的As2O3處理Jurkat 細胞后，0 h 并未檢測到LC-3B 蛋白的表達，24 h 和48 h 的LC-3B 表達水平隨時間增加而顯著性升高(圖4)，與電鏡結(jié)果吻合;流式細胞技術(shù)檢測顯示As2O3處理細胞后，0、24、48 h 的MFI相對倍數(shù)為(3.1±0.2)、(4.6±0.31)、(34.2±4.5)倍(圖5)，各組之間兩兩對比均有顯著性差異(P ＜0.01，圖6)，與免疫印跡結(jié)果吻合。

圖6 LC-3B 的平均熒光強度MFIFig.6 Mean fluorescent intensity of LC-3B protein

圖7 各處理組Jurkat 細胞的抑制率Fig.7 Inhibition rate of Jurkat cells each group

圖8 免疫印跡檢測各組LC-3B 蛋白的表達Fig.8 LC-3B protein expression of each group by Western blot

圖9 各處理組Jurkat 細胞的凋亡率Fig.9 Apoptosis rate of Jurkat cells each group

2.3 3-MA 對As2O3誘導(dǎo)自噬的抑制作用 PBS、10 mmol/L 的3-MA、5 μmol/L 的As2O3及3-MA 聯(lián)合As2O3處理細胞48 h 后，其生長抑制率分別為(1.2±1.4)%、(9.7±3.3)%、(33.4±9.1)%、(60.6±8.3)%，3-MA 聯(lián)合As2O3處理Jurkat 細胞48 h 后，相對As2O3，生長抑制率明顯上升(P ＜0.01，圖7)，同時免疫印跡檢測顯示，相對于As2O3組，3-MA 聯(lián)合As2O3處理細胞48 h 后，LC-3B 的表達減弱(圖8)。

2.4 3-MA 對As2O3誘導(dǎo)Jurkat 細胞凋亡的作用 5 μmol/L As2O3，5 μmol/L AS2O3聯(lián)合10 mmol/L 3-MA 作用Jurkat 細胞48 h，凋亡細胞百分數(shù)分別為(2.94±0.26)%，(44.96±3.60)%，與單用As2O3處理組相比，聯(lián)用自噬特異性抑制劑3-MA 組的凋亡細胞百分數(shù)明顯升高(P ＜0.05)，見圖9。

3 討論

細胞凋亡、細胞自噬和壞死在腫瘤發(fā)生、發(fā)展和治療中有著重要的意義。越來越多的研究發(fā)現(xiàn)，自噬和凋亡作為細胞程序性死亡的兩種方式，在某些情況下相互促進或拮抗，可先后發(fā)生或同時存在于同一細胞，可能共同決定惡性腫瘤的命運［5，6］。這種混合多種形式的細胞死亡使我們看到細胞死亡方式之間存在相互關(guān)系，特別是凋亡和壞死［7］。As2O3誘導(dǎo)急性T 淋巴細胞白血病細胞凋亡涉及了復(fù)雜的多信號通路，機理尚不清楚。臨床上化療藥盡管有不同的靶位和機理，但均引起腫瘤細胞的凋亡。腫瘤細胞通常對誘導(dǎo)凋亡較敏感，但最終產(chǎn)生凋亡耐受［8］。近年來，人們研究發(fā)現(xiàn)自噬參與了化療耐藥并且與化療及放療的敏感性有關(guān)，研究也證實了這一點［9］。

研究表明，臨床上治療急性早幼粒細胞白血病時，As2O3的血漿濃度峰值為6～7 μmol/L，然后下降并維持在1～2 μmol/L［10］。本實驗觀察到As2O3可以抑制急性T 淋巴細胞白血病細胞株Jurkat 細胞的生長，這種作用呈劑量和時間依賴性，與As2O3敏感細胞株K562 細胞相比，Jurkat 細胞對As2O3敏感性略低。5 μmol/L As2O3作用Jurkat 細胞24、48 h后生長抑制率與自噬公認標志物L(fēng)C-3B 表達水平均隨時間呈依賴性升高，聯(lián)用3-MA 后比單用As2O3組LC-3B 表達降低，表明As2O3化療誘發(fā)的Jurkat細胞中自噬呈現(xiàn)高表達。由于自噬的本質(zhì)是細胞通過吞噬不必要的細胞器以保證細胞度過外界的應(yīng)激，這提示在急性T 淋巴細胞白血病細胞化療中存在的細胞自噬可能是化療抵抗的一個原因。

5 μmol/L As2O3作用Jurkat 細胞24 h 后發(fā)生了細胞凋亡并可見較多的自噬體，10 μmol/L As2O3作用Jurkat 細胞24 h 后出現(xiàn)了細胞壞死和更多的自噬體。此外，我們的實驗還表明，在臨床有效血藥濃度時，As2O3誘導(dǎo)急性T 淋巴細胞白血病細胞株Jurkat 細胞的凋亡不明顯，但是當(dāng)聯(lián)用自噬抑制劑3-MA 后，凋亡細胞明顯增多，說明抑制自噬增強了AS2O3誘導(dǎo)的凋亡作用，證明了As2O3聯(lián)合自噬抑制劑在治療急性T 淋巴細胞白血病中的應(yīng)用價值。

隨著對自噬、凋亡與血液系統(tǒng)腫瘤關(guān)系的深入研究，相信靶向性藥物及自噬基因的靶向治療將為腫瘤治療帶來更好的前景。

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