脂質(zhì)筏神經(jīng)鞘磷脂在T 細(xì)胞活化中的作用①

黃成日 (延邊大學(xué)附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科，延吉 133000)

機(jī)體通過正確地調(diào)節(jié)活化免疫細(xì)胞的信號(hào)傳遞，抵抗入侵的病原微生物。其中獲得性免疫起主要作用，主體為T 淋巴細(xì)胞或B 淋巴細(xì)胞。細(xì)胞膜上的T 細(xì)胞受體集中在免疫突觸的中央，與抗原提呈細(xì)胞結(jié)合形成免疫突觸［1］。1972 年Nicolson 提出細(xì)胞膜液態(tài)鑲嵌模型，當(dāng)時(shí)這一重大發(fā)現(xiàn)在學(xué)界引起了轟動(dòng)。隨著對(duì)細(xì)胞膜研究的深入，近年，脂質(zhì)組學(xué)逐漸受到了關(guān)注。1997 年Simons 和Ikonen 提出了［由神經(jīng)鞘脂質(zhì)和膽固醇形成的區(qū)域叫脂質(zhì)筏，它在細(xì)胞黏附和運(yùn)輸膜蛋白的過程中發(fā)揮重要作用］的筏模型［2］。2001 年，在西班牙召開的歐洲生物科學(xué)研討會(huì)上正式提出了“脂質(zhì)筏(Lipid Raft)”的概念。脂質(zhì)筏是細(xì)胞膜上的功能微區(qū)，可以在膜中側(cè)向流動(dòng)、聚集，從而完成信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)等功能。脂質(zhì)筏對(duì)維持T 細(xì)胞穩(wěn)態(tài)發(fā)揮重要作用，認(rèn)清T 細(xì)胞活化與脂質(zhì)筏的密切關(guān)系有著重要意義。研究表明，改變脂質(zhì)筏的完整性會(huì)影響T細(xì)胞的功能，引起各種疾病。神經(jīng)鞘磷脂(Sphingomyelin，SM)是脂質(zhì)筏的主要構(gòu)成成分，在細(xì)胞膜上跨膜信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中發(fā)揮重要作用。本文主要對(duì)脂質(zhì)筏SM 在T 細(xì)胞活化中的作用進(jìn)行綜述。

1 脂質(zhì)筏的結(jié)構(gòu)

脂質(zhì)筏存在于細(xì)胞生物膜上的特殊微區(qū)(microdomain)，不被去垢劑溶解，又稱detergent resistant fractions(DRF)［3］。這些由磷脂質(zhì)、鞘磷脂和膽固醇組成的脂質(zhì)將細(xì)胞膜分為功能不同的區(qū)域，保持一種液態(tài)有序相，不溶于去垢劑。這個(gè)區(qū)有許多名稱:不溶于去垢劑的糖脂富含區(qū)(Detergent-insoluble glycolipid-rich domain，DIGs)，不溶于去垢劑的膜(Detergent resistant membrane，DRMs)，富含糖脂的膜(Glycolipid-rich membrane，GEMs)，Triton 不溶復(fù)合物(Triton insoluble complexes，TIC)［4］。脂質(zhì)筏富含膽固醇和鞘脂，包括鞘磷脂和鞘糖脂(glycolsphingolipids)，如神經(jīng)節(jié)苷脂GM1、GM2、GM3 等。并有特定的蛋白質(zhì)，如GPI(糖基磷脂酰肌醇)錨定蛋白等信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白，TCR、BCR、生長(zhǎng)因子等跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和功能蛋白;以及一些標(biāo)記蛋白caveolin、flotillin、stomatin 等。目前脂質(zhì)筏分為小窩、富含糖鞘脂膜區(qū)、富含多磷酸肌醇膜區(qū)三種類型，不同類型含有某些特有的蛋白質(zhì)，故將這些蛋白稱為標(biāo)記蛋白，如caveolin 是caveolae 上的標(biāo)記蛋白，flotillin、stomatin是富含PIP2 膜區(qū)的標(biāo)記蛋白［5］。鞘糖脂中GM1 是神經(jīng)節(jié)苷脂的一種，相對(duì)分子量為11 500，因其能與霍亂毒素-B 亞基特異性的結(jié)合，常作為脂質(zhì)筏的標(biāo)記分子。到目前為止對(duì)筏的鑒定是以筏中的GM1的霍亂毒素B 亞基(cholera toxin B subunit;CTx)為探針進(jìn)行分析的。筏的功能解析是用甲基-β-環(huán)湖精(methyl-β-cyclodextrin;MβCD)來進(jìn)行的［6］。但是，對(duì)脂質(zhì)筏的主要構(gòu)成成分的SM 的解析報(bào)道甚少。

通常，因?yàn)榱字|(zhì)具有氫受體(Hydrogen acceptor)，不具有供氫體(Hydrogen donor)，因而磷脂質(zhì)之間不易結(jié)合，含多加不飽和脂肪酸的部分不對(duì)稱，不易形成聯(lián)網(wǎng)狀態(tài)。但是，飽和脂肪酸的SM 具有與氫結(jié)合必需的氫受體和供氫體，因而脂質(zhì)雙層結(jié)構(gòu)中容易形成聯(lián)網(wǎng)狀態(tài)。其脂質(zhì)分配是不均一的，維持著非對(duì)稱性。即具有頭部膽堿的SM 或磷脂酰膽堿(Phosphatidylcholine，PC)等的飽和磷脂質(zhì)存在于細(xì)胞膜雙重結(jié)構(gòu)的外層(Exoplasmic leaflet);磷脂酰絲氨酸(Phosphatidylserine，PS)、磷脂酰乙醇胺(Phosphatidylethanolamine，PE)或 磷 脂 酰 肌 醇(Phosphatidylinositol，PI)等的不飽和磷脂質(zhì)存在于內(nèi)層(Cytoplasmic leaflet)。膽固醇則填充脂質(zhì)雙層間隙之中［7］，通過酰基(acyl)鏈結(jié)合于SM，填補(bǔ)SM 間隙。這就是筏的實(shí)體，SM 和膽固醇密集的區(qū)域［6，8］。到目前為止已知的Ras 還有很多的酪氨酸激酶、接頭蛋白等各種信號(hào)傳導(dǎo)物質(zhì)聚集在筏(表1)。TCR的信號(hào)傳導(dǎo)為由通過聚集在筏的Lck 或Fyn 等酪氨酸激酶或LAT(linker for activation of T cells)信號(hào)傳導(dǎo)來實(shí)現(xiàn)的。

前面已提到生物膜上存在由脂質(zhì)構(gòu)成的不同的微結(jié)構(gòu)域和神經(jīng)鞘脂質(zhì)密集的細(xì)胞膜外層區(qū)域在細(xì)胞黏著或活化時(shí)起運(yùn)輸膜蛋白的作用?？梢娔ぶ|(zhì)不是生物膜靜止的構(gòu)成成分，而是動(dòng)態(tài)移動(dòng)，將情報(bào)提供給各種各樣的功能分子的匯合或集聚部位，而轉(zhuǎn)導(dǎo)重要的信號(hào)。

2 脂質(zhì)筏的功能

脂質(zhì)筏是蛋白質(zhì)和脂質(zhì)停留和活動(dòng)的平臺(tái)。脂質(zhì)筏在整個(gè)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中起到一個(gè)平臺(tái)的作用。細(xì)胞受刺激時(shí)，筏中的SM 迅速相互聯(lián)結(jié)凝集成更大的微結(jié)構(gòu)區(qū)，這些結(jié)構(gòu)又可以迅速形成一個(gè)或多個(gè)平臺(tái)。這個(gè)過程可以理解成脂質(zhì)筏由小的、無(wú)活性的狀態(tài)轉(zhuǎn)化為大的、有活性的狀態(tài)，即平臺(tái)的形成。脂質(zhì)筏選擇性地聚集不同的蛋白質(zhì)于細(xì)胞膜的兩側(cè)，脂質(zhì)筏中的脂質(zhì)對(duì)其進(jìn)行修飾使蛋白嵌入脂質(zhì)筏中。脂質(zhì)筏在膜中側(cè)向流動(dòng)可使多種距離較遠(yuǎn)的蛋白質(zhì)聚集在脂質(zhì)筏內(nèi)，便于信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)［9］。脂質(zhì)筏還參與信使的形成、跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)、突觸傳遞、細(xì)胞膜非對(duì)稱性的維持、抗腫瘤、抗感染、細(xì)胞的增殖與凋亡及胰島素調(diào)節(jié)等［10，11］。

表1 筏中局限或集聚的分子Tab.1 Localized molecules cluster in raft

3 T 細(xì)胞活化與脂質(zhì)筏

T 細(xì)胞活化需要兩個(gè)信號(hào):第一信號(hào)的產(chǎn)生依賴于TCR 與抗原提呈細(xì)胞(APC)所提呈的抗原肽-主要組織相容性復(fù)合體(MHC)復(fù)合物特異性結(jié)合，第二信號(hào)則來自于共刺激信號(hào)。APC 將共刺激分子(B7-1、B7-2、VCAM、ICAM、LFA 等)抗原提呈給特異性T 細(xì)胞，兩種細(xì)胞表面黏附因子圍繞TCR/抗原肽-MHC 凝聚，形成一狹小空間，即免疫突觸。突觸中存在一個(gè)由TCR 為中心族聚集而成的中央超分子活化簇［12］。

1998 年，美國(guó)癌研究所Samelson 等［13］研究人員發(fā)現(xiàn)linker for activation of cell(LAT)，闡明LAT 是局限在筏的結(jié)合蛋白，首次論證TCR 信號(hào)與筏的關(guān)系。TCR 與抗原肽-MHC 復(fù)合物特異性結(jié)合時(shí)，引起TCR 交聯(lián)。TCR 交聯(lián)時(shí)，TCR 復(fù)合物中的CD3、CD4 等膜分子發(fā)生聚集，CD3ξ 鏈的 immunoreceptor tyrosine-based activation motif(ITAM)受到磷酸化，磷酸化ITAM 里結(jié)合Syk 酪氨酸激酶屬的ZAP-70 后，與Lck 協(xié)同作用下酪氨酸磷酸化LAT、SLP-76 等結(jié)合蛋白。進(jìn)而，通過磷酸化LAT、SLP-76、PLC-γ、Grb2、PI-3kinase、Cbl、Vav、SKP-76等的信號(hào)因子聚集在筏里［13］(圖1)。LAT 以后的信號(hào)途徑是Grb2 或SOS→Ras，Gads，SLP-76;Vav→Rac/cdc42;Nck，Wasp→肌動(dòng)蛋白聚合;PLC-γ，Gads，SLP-76 →流入到細(xì)胞內(nèi)。伴隨著T 細(xì)胞活化，以LAT 為首的重要的激酶或結(jié)合蛋白和TCR 自身集聚在筏。但是，LAT 一直局限于筏中而TCR 是未受到刺激時(shí)不存在于筏中。那么，什么時(shí)間段和以什么方式TCR 移動(dòng)到筏，尚不清楚。最近還有一種報(bào)道稱，TCR 在筏中凝聚之前或微小群集形成時(shí)TCR活化信號(hào)傳遞到LAT，其機(jī)制尚不清楚。［12，14］

4 靶向神經(jīng)鞘磷脂的脂質(zhì)筏解析的新策略

越來越多的研究顯示，神經(jīng)酰胺作為細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)的第二信使，在腫瘤細(xì)胞增殖、信號(hào)傳遞、蛋白質(zhì)相互作用、黏附和凋亡中發(fā)揮很重要的作用。SM/神經(jīng)酰胺循環(huán)如下:SMase(Sphingomyelinase)促進(jìn)SM 水解神經(jīng)酰胺磷脂酰膽堿為神經(jīng)酰胺和磷脂酰膽堿。神經(jīng)酰胺酶(Ceramidase)分解神經(jīng)酰胺形成神經(jīng)鞘氨醇(Sphingosine)。神經(jīng)酰胺在SMS作用下可轉(zhuǎn)變?yōu)镾M。神經(jīng)酰胺重新合成開始于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的絲氨酸軟脂酰轉(zhuǎn)移酶催化的絲氨酸和軟脂酰-CoA 凝集，隨后的一系列反應(yīng)產(chǎn)生ER 細(xì)胞質(zhì)內(nèi)神經(jīng)酰胺。如此，存在于細(xì)胞膜脂質(zhì)雙重結(jié)構(gòu)外葉的SM 和細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的神經(jīng)酰胺之間形成SM/神經(jīng)酰胺周期，日常維持平衡(見圖1)。這種SM-神經(jīng)酰胺途徑介導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)已被證實(shí)是廣泛存在的。

圖1 神經(jīng)鞘磷脂/神經(jīng)酰胺代謝示意圖Fig.1 Schematic diagram of sphingomyelin and ceramide metabolism

很多一流雜志上刊登了有關(guān)脂質(zhì)筏的論文。但是，到目前為止對(duì)筏的檢測(cè)是以筏中的GM1 的霍亂毒素B 亞單位為探針進(jìn)行分析的。筏的功能解析是用MβCD 破壞筏的方法進(jìn)行的。但是，對(duì)脂質(zhì)筏的主要構(gòu)成成分的SM 的解析幾乎沒有報(bào)道。因?yàn)闆]有發(fā)現(xiàn)神經(jīng)鞘磷脂合成酶(Sphingomyelin synthesis;SMS)基因，所以SM 合成經(jīng)路或SM 可視化方法沒確立下來。我們研究小組克隆神經(jīng)鞘磷脂合成酶基因SMS1、SMS2 和SMS3，并發(fā)現(xiàn)SM 特異性結(jié)合的標(biāo)志物lysenin。用lysenin 的敏感性來確定細(xì)胞膜的SM。

我們將SMS1 基因轉(zhuǎn)入到無(wú)SM 的細(xì)胞株［WR/Fas-SM(-)］使其成為存在SM 的細(xì)胞株［WR/Fas-SMS1］。兩者Fas 表達(dá)量及細(xì)胞膜膽固醇與神經(jīng)節(jié)苷脂GM1 的量同等，但用lysenin 鑒定時(shí)只有WR/Fas-SMS1 表達(dá)SM。利用兩者首次闡明在筏的集聚或凋亡中的SM 的重要性［15］。

5 SM 沉默的細(xì)胞株和敲除小鼠模型的制備及解析

SM 是脂質(zhì)筏的重要構(gòu)成成分，分布于細(xì)胞膜脂質(zhì)雙層結(jié)構(gòu)的外層，發(fā)揮維持脂質(zhì)雙層結(jié)構(gòu)的對(duì)稱性的作用，作為脂質(zhì)筏的標(biāo)志物與神經(jīng)節(jié)苷脂GM1 發(fā)揮同樣的重要作用。所以，我們將神經(jīng)鞘磷脂酶基因SMS1-siRNA 轉(zhuǎn)染于jurkat T 細(xì)胞，建立SM 沉默的細(xì)胞株，分析其TCR 信號(hào)及細(xì)胞活化可見沉默細(xì)胞的T 細(xì)胞功能顯著下降［16］。CD69 是早期的白血球活化抗原，反映細(xì)胞免疫功能的標(biāo)志物。正常的T 細(xì)胞受TCR/CD3 或CD3/CD28 的刺激時(shí)，逐漸地表達(dá)于細(xì)胞表面，受刺激6 h 開始出現(xiàn)，48 h 達(dá)到高峰，其后逐漸減弱，最后消失。表達(dá)CD69 需要T 細(xì)胞的膜結(jié)構(gòu)和轉(zhuǎn)導(dǎo)TCR/CD3 信息傳導(dǎo)通路，才能將CD69 蛋白質(zhì)運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞膜。用Phorbol 12-myristate 13-acetate(PMA)刺激時(shí)沉默細(xì)胞和對(duì)照組細(xì)胞表達(dá)同等量的CD69，但是用CD3交聯(lián)刺激時(shí)在沉默細(xì)胞中顯著的減少。結(jié)果顯示神經(jīng)鞘磷脂與TCR/CD3 誘導(dǎo)的CD69 表達(dá)密切相關(guān)［16］。

CD3/TCR 信號(hào)活化途徑有經(jīng)LAT 傳導(dǎo)途徑和經(jīng)PI3K 傳導(dǎo)途徑兩種。我們轉(zhuǎn)入Jurkat T 細(xì)胞SMS1 的si-RNA 建立SM knockdown 細(xì)胞株，用蛋白印跡分析CD3 交聯(lián)刺激時(shí)ZAP-70 和LAT 及PKCθ的磷酸化，沉默細(xì)胞中ZAP-70 和LAT 及PKCθ 的磷酸化比對(duì)照細(xì)胞明顯地降低。說明細(xì)胞膜SM 是筏的重要成分而且在TCR 介導(dǎo)的T 細(xì)胞活化過程中發(fā)揮重要作用［9］。制備SM 敲除老鼠，用伴刀豆蛋白誘導(dǎo)肝炎時(shí)SM 敲除老鼠CD4+T 細(xì)胞功能明顯下降［16］。脂質(zhì)筏鞘磷脂通過CXCL12/CXCR4 途徑減小相應(yīng)的信號(hào)傳遞，調(diào)節(jié)細(xì)胞遷移［17］。

因此SM 與免疫擔(dān)當(dāng)細(xì)胞活化或細(xì)胞死亡密切相關(guān)，臨床上與自身免疫性疾病、變態(tài)反應(yīng)性疾病的免疫異常、細(xì)菌或病毒感染性疾病，臟器移植或腫瘤排斥密切相關(guān)［18，19］。

6 結(jié)語(yǔ)與展望

隨著對(duì)脂質(zhì)筏研究的深入，對(duì)細(xì)胞膜上的微區(qū)結(jié)構(gòu)逐漸清晰，但是仍然存在很多問題需要解決:①脂質(zhì)筏作為一種膜上微結(jié)構(gòu)是否存在于所有生物膜上?②通過脂質(zhì)筏的研究能否阻止病原體的入侵?③能否在脂質(zhì)筏的角度提高腫瘤細(xì)胞對(duì)腫瘤藥物的敏感性或直接殺死腫瘤細(xì)胞?④脂質(zhì)筏在參與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制并不清楚。

近年，生物膜領(lǐng)域細(xì)胞膜脂質(zhì)雙層結(jié)構(gòu)的細(xì)胞膜外層和內(nèi)層脂質(zhì)分布不均，確立了其非對(duì)稱性(asymmetry)正是細(xì)胞膜的重要概念。且對(duì)生物膜的功能和raft 特性進(jìn)行比較廣泛的研究。但是，為了更加客觀、更加自然的狀態(tài)上觀察空間和時(shí)間上變化的細(xì)胞膜，期待開發(fā)相應(yīng)的研究方法和工具。因?yàn)镽aft 的解析也存在技術(shù)上有限，對(duì)生物化學(xué)和生物物理的解析結(jié)果的評(píng)價(jià)存在不同的看法。

今后我們將進(jìn)一步對(duì)①生物膜領(lǐng)域細(xì)胞膜脂質(zhì)雙層結(jié)構(gòu)的細(xì)胞膜外層和內(nèi)層脂質(zhì)分布不均一性，非對(duì)稱性破壞為誘因的免疫細(xì)胞功能異常;②SM/神經(jīng)酰胺平衡的破壞為誘因的細(xì)胞的生存和死亡的信號(hào)傳導(dǎo);③SMS1 敲除老鼠的自身免疫性疾病、腫瘤或感染疾病的發(fā)生;④利用SM 的調(diào)節(jié)的方法對(duì)免疫抑制劑，抗癌藥物的開發(fā)進(jìn)行解析。

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