微波固相合成L-瓜氨酸鋅螯合物的研究

劉 玲，馮 振，燕 南，牟 杰，劉 毅，鄭友廣，安 琳，張榮麗

（1.徐州醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，江蘇徐州221004；

2.徐州醫(yī)學(xué)院公共教育學(xué)院，江蘇徐州221004）

微波固相合成L-瓜氨酸鋅螯合物的研究

劉 玲1，馮 振1，燕 南1，牟 杰1，劉 毅1，鄭友廣1，安 琳1，張榮麗2，*

（1.徐州醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，江蘇徐州221004；

2.徐州醫(yī)學(xué)院公共教育學(xué)院，江蘇徐州221004）

以L-瓜氨酸和乙酸鋅為原料，在固體狀態(tài)下，通過微波輻射合成L-瓜氨酸鋅螯合物。以螯合率為指標(biāo)，運(yùn)用單因素和正交實(shí)驗(yàn)對影響L-瓜氨酸鋅螯合物的合成條件進(jìn)行了研究，得出最佳反應(yīng)條件為：碳酸鈉添加量15%，微波輻射功率300W，微波輻射時(shí)間4min，水分添加量5%；在此工藝條件下，L-瓜氨酸鋅螯合物的平均螯合率達(dá)到91.1%；紅外光譜初步確證了化合物的螯合結(jié)構(gòu)。

L-瓜氨酸鋅螯合物，微波，固相合成

氨基酸微量元素配合物具有良好的生物化學(xué)穩(wěn)定性，易被人體吸收，利用率高，無毒副作用，是近年來發(fā)展較快的一類新型營養(yǎng)添加劑。L-瓜氨酸是一種首先從西瓜汁中發(fā)現(xiàn)的人體內(nèi)非蛋白質(zhì)氨基酸，研究表明，瓜氨酸具有重要生理功能，能夠清除自由基、抗氧化、舒張血管等，在醫(yī)藥、食品、保健等各個(gè)領(lǐng)域廣泛應(yīng)用[1-2]。鋅是已知的人體14種必需微量元素之一，由于其在人體內(nèi)廣泛的生理生化作用而被稱為“生命元素”[3]。瓜氨酸鋅螯合物既能補(bǔ)充人體所必需的微量元素鋅又能提供生理活性物質(zhì)瓜氨酸，并且吸收比單獨(dú)的補(bǔ)鋅制劑好。因此，對L-瓜氨酸鋅螯合物合成工藝的研究有著重大意義。

目前，氨基酸金屬螯合物合成多采用水相合成法，但該方法存在合成工藝長，三廢多，純化困難，成本高等缺點(diǎn)[4]；而微波輻射技術(shù)與傳統(tǒng)的加熱方法相比，具有反應(yīng)速度快、產(chǎn)率高及產(chǎn)品易純化等優(yōu)點(diǎn)[5]。本實(shí)驗(yàn)以L-瓜氨酸與乙酸鋅為原料，通過微波輻射固相合成L-瓜氨酸鋅螯合物，并探討了合成最佳工藝條件。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

L-瓜氨酸 寧波市鎮(zhèn)海海德生化科技有限公司；乙酸鋅 江蘇徐州化學(xué)工業(yè)二廠；二甲酚橙 天津市化學(xué)制劑研究所；乙二胺四乙酸 上海凌峰化學(xué)試劑有限公司。

MAS-Ⅱ型微波爐 新儀微波化學(xué)科技有限公司；SHZ-D（Ⅲ）型循環(huán)水式真空泵 天津市天發(fā)科技有限公司；島津IR-750型紅外光譜儀。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 瓜氨酸鋅螯合物的合成 將L-瓜氨酸和乙酸鋅以2∶1的摩爾比混合，加入一定量的碳酸鈉充分研勻，加適量水作反應(yīng)引發(fā)劑，放至微波爐以不同功率進(jìn)行反應(yīng)。用蒸餾水充分洗滌并干燥稱重。

1.2.2 單因素實(shí)驗(yàn)

1.2.2.1 加堿量的確定 將L-瓜氨酸和乙酸鋅以2∶1的摩爾比混合，添加水分5%混勻，分別添加碳酸鈉10%、15%、20%、25%、30%，放置微波爐加熱，微波功率400W，微波輻射時(shí)間4min，重復(fù)實(shí)驗(yàn)三次，通過比較螯合率來確定合適的碳酸鈉添加量。

1.2.2.2 微波輸出功率的確定 將L-瓜氨酸和乙酸鋅以2∶1的摩爾比混合，添加碳酸鈉20%和水分5%后混勻，放置微波爐加熱，微波功率分別為100、200、300、400、500W，微波輻射時(shí)間4min，重復(fù)實(shí)驗(yàn)三次，通過比較螯合率來確定合適微波輸出功率。

1.2.2.3 微波輻射時(shí)間的確定 將L-瓜氨酸和乙酸鋅以2∶1的摩爾比混合，添加碳酸鈉20%和水分5%后混勻，放置微波爐加熱，微波功率為400W，微波輻射時(shí)間分別為2、3、4、5、6min，重復(fù)實(shí)驗(yàn)三次，通過比較螯合率來確定合適微波輻射時(shí)間。

1.2.2.4 水分添加量的確定 將L-瓜氨酸和乙酸鋅以2∶1的摩爾比混合，添加碳酸鈉20%，分別向其中加入水分2%、3%、4%、5%、6%后混勻，放置微波爐加熱，微波功率400W，微波輻射時(shí)間4min，重復(fù)實(shí)驗(yàn)三次，通過比較螯合率來確定合適的引發(fā)劑添加量。

1.2.3 正交實(shí)驗(yàn) 在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，將L-瓜氨酸和乙酸鋅以2∶1的摩爾比混合，選取加堿量（A）、微波功率（B）、微波時(shí)間（C），水分添加量（D）四個(gè)因素，采用L9（34）正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)。以螯合率為指標(biāo)．確定最佳合成條件，因素水平設(shè)計(jì)見表1。

表1 L9（34）實(shí)驗(yàn)因素水平表Table 1 L9（34）Orthogonal factor level table

1.2.4 微量元素螯合率的測定 取制得的瓜氨酸鋅0.01g，加20mL水，滴加1mol/L的HCl溶液至完全溶解，用2mol/L的NaOH溶液調(diào)節(jié)pH到5～6之間。加6mL HAc-NaAc緩沖溶液（pH=5.5）和1～2滴0.5%二甲酚橙指示劑至溶液呈鮮紅色。立即用0.01mol/L的EDTA標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液滴定至溶液由紅色突變?yōu)榱咙S色，記錄下所用EDTA溶液的體積并計(jì)算螯合率。

螯合態(tài)Zn元素的摩爾質(zhì)量=CV×10-3×m/0.01；反應(yīng)前Zn元素的摩爾質(zhì)量=M/183.47；

螯合率（%）=（螯合態(tài)Zn元素的摩爾質(zhì)量/反應(yīng)前Zn元素的摩爾質(zhì)量）×100

式中，C—EDTA的濃度，為0.01mol/L；V—滴定所用EDTA的體積，mL；m—反應(yīng)后所得瓜氨酸鋅螯合物的質(zhì)量，g；M—反應(yīng)前使用原料乙酸鋅的質(zhì)量，g；其中，乙酸鋅分子量為183.47。

1.2.3 紅外光譜的測定 紅外光譜：以KBr壓片法，在4000～400cm-1范圍內(nèi)測定瓜氨酸和瓜氨酸鋅的紅外圖譜。

2 結(jié)果與討論

2.1 L-瓜氨酸與乙酸鋅的摩爾配比的確定

氨基酸與金屬離子的摩爾配比是影響合成的關(guān)鍵因素，如果太小，所得螯合物不穩(wěn)定；如果過大，螯合物穩(wěn)定性過高，影響其生物利用度，此外，還會(huì)浪費(fèi)原料。因此，本實(shí)驗(yàn)根據(jù)文獻(xiàn)[6-7]報(bào)道的氨基酸與鋅離子的配位可能結(jié)構(gòu)（如圖1）采用L-瓜氨酸與乙酸鋅的摩爾配比為2∶1進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，既能保證螯合物結(jié)構(gòu)的相對穩(wěn)定，又能充分利用L-瓜氨酸。

圖1 L-瓜氨酸鋅螯合物的分子結(jié)構(gòu)式Fig.1 The structure of L-citrulline chelated zinc

2.2 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 加堿量對螯合反應(yīng)的影響 采用乙酸鋅為原料時(shí)，反應(yīng)副產(chǎn)物是乙酸，具有較高的偶極極化率，如不盡快除去，將造成反應(yīng)物局部受熱過大，引起產(chǎn)物的焦糊、分解。碳酸鈉能迅速中和反應(yīng)過程中產(chǎn)生的副產(chǎn)物酸，調(diào)節(jié)反應(yīng)體系的酸堿度，促進(jìn)反應(yīng)向正方向進(jìn)行。作為脫酸劑，它對瓜氨酸鋅螯合物的穩(wěn)定性不產(chǎn)生負(fù)面影響，且易于洗滌除去，不影響產(chǎn)物的提取。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出（圖2），隨著加堿量的提高，反應(yīng)螯合率逐漸增加，當(dāng)添加量為20%時(shí)，螯合率達(dá)到最大值。繼續(xù)提高加堿量，反應(yīng)的螯合率反而下降，這是由于堿性物質(zhì)的過量加入，在一定程度降低了L-瓜氨酸與乙酸鋅之間的接觸程度。

圖2 加堿量對螯合率的影響Fig.2 Effect of sodium carbonate addition on the chelation ratio

圖3 微波輸出功率對螯合率的影響Fig.3 Effect of microwave power on the chelation ratio

2.2.2 微波輸出功率對螯合反應(yīng)的影響 微波不同于一般的常規(guī)加熱，后者一般是由外部熱源通過熱輻射由表及里的傳導(dǎo)式加熱，而微波是一種電磁波，具有一定的穿透能力，能對物體進(jìn)行體內(nèi)加熱。通過提高微波功率可以加強(qiáng)微波的穿透強(qiáng)度，加速反應(yīng)的進(jìn)行。結(jié)果顯示（圖3）：微波輸出功率對反應(yīng)的螯合率影響顯著。隨著微波輸出功率的增加，瓜氨酸鋅的螯合率也大幅度提高。當(dāng)微波輸出功率為400W時(shí)，反應(yīng)的螯合率達(dá)到最大值。但當(dāng)功率達(dá)到能為反應(yīng)提供足夠的能量后，繼續(xù)增大功率，螯合率快速下降，原因是過高的能量產(chǎn)生瞬時(shí)高溫，引起產(chǎn)物焦糊，同時(shí)副反應(yīng)增多，引起螯合率下降。

2.2.3 微波輻射時(shí)間對螯合反應(yīng)的影響 微波輻射時(shí)間對螯合反應(yīng)的影響見圖4。微波輻射時(shí)間低于3min時(shí)，反應(yīng)螯合率低于65%；隨著輻射時(shí)間的延長，螯合率逐漸升高，在4min左右達(dá)到最高值；但微波輻射超過4min，螯合率呈現(xiàn)下降趨勢，因此，本反應(yīng)的最佳輻射時(shí)間為4min。

圖4 微波輻射時(shí)間對螯合率的影響Fig.4 Effect of microwave irradiation time on the chelation ratio

2.2.4 水分添加量對螯合反應(yīng)的影響 一般物質(zhì)對微波吸收能力主要是由介電常數(shù)和介質(zhì)損耗角正切來決定的[8]。在固相反應(yīng)中，適當(dāng)添加介電常數(shù)較大的水分子，能更好地吸收微波，促進(jìn)反應(yīng)發(fā)生。理論上，引發(fā)劑量主要影響初始反應(yīng)速度，并不影響反應(yīng)進(jìn)行的程度[9]，故實(shí)驗(yàn)中最佳引發(fā)劑水分添加量為5%（見圖5）。

圖5 引發(fā)劑水分的添加量對螯合率的影響Fig.5 Effect of water addition on the chelation ratio

2.3 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

按L9（34）進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見表2，方差分析見表3。各因素對L-瓜氨酸鋅螯合率的影響程度大小順序?yàn)椋何⒉ㄝ椛鋾r(shí)間＞水分添加量＞微波輻射功率＞加堿量。L-瓜氨酸鋅螯合物的最佳合成條件為A1B1C2D2，即碳酸鈉添加量為15%，微波輻射功率為300W，微波輻射功率為4min，水分添加量為5%。進(jìn)行三次驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，得到螯合率分別為90.2%、91.3%、91.9%，其平均值為91.1%，說明選定條件是穩(wěn)定的，并且重現(xiàn)性好。

表2 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 2 Reslult of orthogonal experiment

表3 方差分析結(jié)果Table 3 Analysis of variance

圖6 L-瓜b氨酸及L-瓜氨酸鋅螯合物的紅外圖譜Fig.6 IR spectra of L-citrulline and L-citrulline chelated zinc

2.4 產(chǎn)品紅外光譜分析

由圖6可知，L-瓜氨酸在3361cm-1有由氨基（-NH2）的伸縮振動(dòng)引起的特征吸收，以及由羰基（-C=O）在1674cm-1伸縮振動(dòng)引起的特征吸收。當(dāng)L-瓜氨酸與鋅螯合后，氨基的吸收峰移至3398cm-1處；而羰基的吸收值大大增強(qiáng)，特征吸收移至1654cm-1，這是由于瓜氨酸的氨基和羧基氧參與配位形成螫合物的結(jié)果。同時(shí)，在500cm-1附近沒有出現(xiàn)配位水分子的面內(nèi)和面外搖擺振動(dòng)峰γ（H2O）和ω（H2O），說明產(chǎn)物中沒有配位水分子的存在[10]。螯合物生成后，在2113cm-1處α-氨基酸的特征吸收峰消失，與文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)果一致[11]。

其中，L-瓜氨酸鋅螯合物的紅外數(shù)據(jù)如下：IR（KBr，cm-1）：3398、3338、3282、3190、2954、2935、2877、1654、1629、1581、1556、1398、1334、1160、1124、1101、644、580。

3 結(jié)論

本研究通過微波固相法合成得到L-瓜氨酸鋅螯合物，通過紅外光譜進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析，初步確證了化合物結(jié)構(gòu)；進(jìn)一步對化合物合成進(jìn)行單因素和正交實(shí)驗(yàn)分析，確定了L-瓜氨酸鋅螯合物的最佳合成條件：碳酸鈉添加量15%，微波輻射功率300W，微波輻射功率4min，水分添加量5%，所得L-瓜氨酸鋅螯合物平均螯合率為91.1%。

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Study on the synthesis of L-citrulline chelated zinc by microwave in solid state

LIU Ling1，F(xiàn)ENG Zhen1，YAN Nan1，MOU Jie1，LIU Yi1，ZHENG You-guang1，AN Lin1，ZHANG Rong-li2，*
（1.The school of Pharamcy，Xuzhou Medical College，Xuzhou 221004，China；2.The School of Basic Education Sciences，Xuzhou Medical College，Xuzhou 221004，China）

The L-citrulline chelated zinc was synthesized with L-citrulline and zinc acetate as reactants in solid state by microwave.To determine the chelation ratio by single factor and orthogonal experiment，we get the best conditions of reaction：sodium carbonate 15%，microwave power 300W，microwave irradiation time 4min，water 5%.Under the optimal conditions，the average yield of L-citrulline chelated zinc was 91.1%.Meanwhile，the structure of the product was preliminarily confirmed by IR spectrometry.

L-citrulline chelated zinc；microwave；solid state reaction

TS201.2

B

1002-0306（2014）08-0283-04

10.13386/j.issn1002-0306.2014.08.055

2013－08－02 *通訊聯(lián)系人

劉玲（1982-），女，碩士研究生，講師，研究方向：新藥設(shè)計(jì)與藥物合成。

徐州市科技計(jì)劃項(xiàng)目（XF11C065，XZZD1153）；江蘇省腦病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開放課題（Jsbl1104）；江蘇省大學(xué)生創(chuàng)新訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目（2012JSSPITP1846）；江蘇省高校自然科學(xué)基金項(xiàng)目（10JKB350005）。