扇貝貝肉抗氧化肽制備及體外抗氧化實驗研究

劉 媛，王 健，牟建樓，孫劍峰，魏 巍，王 頡，*

（1.河北農(nóng)業(yè)大學食品科技學院，河北保定071000；2.河北北方學院食品科學系，河北張家口075000）

扇貝貝肉抗氧化肽制備及體外抗氧化實驗研究

劉 媛1，2，王 健2，牟建樓1，孫劍峰1，魏 巍1，王 頡1，*

（1.河北農(nóng)業(yè)大學食品科技學院，河北保定071000；2.河北北方學院食品科學系，河北張家口075000）

以海灣扇貝和蝦夷扇貝的貝肉為原料，研究扇貝品種、蛋白酶種類、加酶量、固液比、酶解溫度對水解度及體外自由基清除率的影響。在單因素實驗的基礎上采用L9（34）正交實驗，對酶解條件進行優(yōu)化研究。結果表明，最佳酶解條件為：以海灣扇貝為原料，選用中性蛋白酶，加酶量3.25%（[E]/[S]），酶解溫度40℃，固液比1∶2.5（W/V），此時水解度可達45.91%，DPPH自由基和超氧陰離子自由基的清除率分別為91.90%和79.72%。

扇貝，抗氧化肽，超氧陰離子，DPPH自由基

鑒于陸生資源的匱乏，近年來從海洋生物中尋找新的活性物質(zhì)日益受到人們的重視。在海洋貝類中越來越多的生理活性物質(zhì)正被逐步發(fā)現(xiàn)，扇貝多肽（polypeptide from chlamys farreri，PCF）是首次從海洋生物櫛孔扇貝（chlamys farreri）中提取得到的水溶性多肽，以往體外細胞研究發(fā)現(xiàn)，PCF能有效地清除化學體系產(chǎn)生的氧自由基[1]；能夠抑制UVA對HeLa上皮細胞的氧化損傷[2]；抑制UVB對成纖維細胞的氧化損傷[3]；可明顯減輕UVA、UVB對昆明種無毛小鼠皮膚的損傷作用[4]；可提高免疫細胞活性，減輕胸腺細胞的氧化損傷、抑制胸腺細胞的凋亡[5]，對紫外線及60Co輻射損傷的免疫細胞有保護作用[6-7]等。因此作為新一代天然抗氧化添加劑，其開發(fā)利用的價值非常廣闊。

目前，國內(nèi)外研究人員已從花生[8]、豬皮[9]等原料中提取到抗氧化肽[10]，但多集中于陸生動植物原料，而對具有獨特結構和功能的海洋生物原料的研究報道較少。本研究以扇貝為原料，采用商品蛋白酶酶解制備扇貝抗氧化肽。在篩選實驗和單因素實驗基礎上，采用正交實驗優(yōu)化了制備扇貝抗氧化肽的酶解條件，并對所得的抗氧化肽進行了體外抗氧化研究，旨在為深入研究扇貝中抗氧化肽的性質(zhì)及應用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

海灣扇貝和蝦夷扇貝 河北農(nóng)業(yè)大學科技市場；木瓜蛋白酶（＞50萬U/g）、中性蛋白酶（＞6000U/g） 北京奧博星生物技術有限公司；堿性蛋白酶（＞10萬U/g） Biotopped；基準級鄰苯二甲酸氫鉀 天津市福晨化學試劑廠。

DFT-200C200克快速開蓋萬能高速粉碎機 上海比朗儀器有限公司制造；pHS-3C實驗室酸度計 上海洛奇特電子設備有限公司；HH-2電熱恒溫水浴鍋 上海比朗儀器有限公司；79-1磁力攪拌器 常州國華電器有限公司；GL-20B冷凍離心機 上海安亭科學儀器廠制造；GZX-9140MBE電熱鼓風干燥箱 上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠；UV-2800型紫外可見分光光度計 上海尤尼柯儀器有限公司。

1.2 扇貝貝肉抗氧化肽制備工藝流程

新鮮扇貝→去除內(nèi)臟→清洗→絞成肉糜→按比例加水勻漿→調(diào)最佳pH→按不同加酶量、溫度恒溫酶解4h→沸水浴滅酶10min→冷卻后離心10000r/min，30min→取上清液→抗氧化肽。

反應過程中以1mol/L的NaOH標準溶液調(diào)節(jié)酶解液pH。

1.3 扇貝品種及蛋白酶種類的篩選實驗

稱取海灣扇貝和蝦夷扇貝肉糜（固液比1∶5）各3份，按[E]/[S]=1.2%分別加入三種酶，并調(diào)節(jié)水溫和pH（堿性蛋白酶45℃，pH10.5；中性蛋白酶40℃，pH7.5；木瓜蛋白酶57℃，pH7.5），均保溫水解4h，測定抗氧化肽的水解度及自由基清除率，篩選出扇貝品種和蛋白酶種類。

1.4 酶解條件的單因素實驗

1.4.1 酶添加量對水解度及自由基清除率的影響 稱取扇貝肉糜（固液比1∶5）8份，分別按酶添加量（[E]/[S]）0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%、3.5%、4.0%的比例加入篩選出的中性蛋白酶，調(diào)節(jié)水解溫度為40℃，pH為7.5，保溫水解4h，測定抗氧化肽的水解度及自由基清除率。

1.4.2 固液比對水解度及自由基清除率的影響 稱取扇貝肉糜8份，分別按照固液比1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5、1∶6、1∶7、1∶8加水勻漿，按篩選出的酶添加量3.0%加入中性蛋白酶，調(diào)節(jié)水解溫度為40℃，pH為7.5，保溫水解4h，測定抗氧化肽的水解度及自由基清除率。

1.4.3 溫度對水解度及自由基清除率的影響 稱取扇貝肉糜5份（均按篩選出的固液比1∶3和酶添加量3.0%），分別在25、30、35、40、45℃水解溫度下，調(diào)節(jié)pH為7.5，保溫水解4h，測定抗氧化肽的水解度及自由基清除率。

1.5 酶解工藝條件的正交實驗設計

根據(jù)L9（34）正交實驗設計原理，以水解度為指標，選取酶添加量、固液比與溫度為影響因素，進行三因素三水平實驗設計，具體反應因素、水平如表1所示。

表1 因素水平表Table 1 Factors and levels of orthogonal experiment

1.6 水解度（DH）的測定

總氮含量：樣品中總氮含量的測定采用凱氏定氮法[11]

氨態(tài)氮含量：采用GB/T 5009.39-2003甲醛值法進行測定.

水解度按照以下公式進行計算：

1.7 DPPH自由基清除率的測定

[12]并加以改進：在離心管中依次加入0.5mL樣品，0.5mL蒸餾水，0.5mL 0.2mmol/L DPPH乙醇溶液，混勻后在室溫下避光反應20min，在517nm下測吸光值As，空白組為0.5mL無水乙醇代替DPPH溶液，測定吸光值為Ax；對照組為0.5mL蒸餾水代替樣品，測定吸光值A0，并以等體積蒸餾水和無水乙醇混合液空白調(diào)零，DPPH自由基清除率AOA按以下公式計算：

式中：AOA—自由基清除率；A0—對照組吸光值；As—樣品組吸光值；Ax—空白組吸光值。

1.8 超氧陰離子自由基清除率的測定

參考文獻[13]并加以改進：取0.05mol/L的Tris-HCl（pH8.2）緩沖液2.4mL，于25℃水浴預熱20min，加入0.3mL預熱過的4mmol/L的鄰苯三酚溶液和0.3mL的不同濃度的樣品溶液，混勻，25℃下反應4min，加一滴10mmol/L的HCl終止反應，在325nm處測定吸光度，重復三次，計算平均值。

O2-·清除率（%）=（A0-（As-Ax））/A0×100

式中，A0：不加樣品溶液的吸光度；As：加入樣品溶液反應后的吸光度；Ax：不加鄰苯三酚溶液時樣品溶液的吸光度。

2 結果與分析

2.1 扇貝品種及蛋白酶種類的篩選

由表2可知，以海灣扇貝為原料，采用中性蛋白酶水解，所得到的抗氧化肽水解度最大，對DPPH自由基和超氧陰離子自由基的清除能力最強。這可能與蛋白酶的種類及扇貝原料中氨基酸組成有關。

蛋白酶按照作用的位點不同可分為內(nèi)肽酶和端肽酶，內(nèi)肽酶主要作用蛋白質(zhì)分子中間的肽鍵，端肽酶主要作用蛋白質(zhì)分子的游離氨基或羧基末端，進而逐步降解氨基酸殘基。本實驗所選用的中性蛋白酶和堿性蛋白酶均為內(nèi)肽酶，且中性蛋白酶水解的特異性較寬[14]，而木瓜蛋白酶在水解蛋白質(zhì)時，主要發(fā)揮端肽酶的作用[15]。目前對各蛋白酶的切割位點進行研究的報道比較少，趙謀明等[16]采用高效液相色譜法推斷中性蛋白酶和堿性蛋白酶對酪朊酸鈉的切割位點，認為中性蛋白酶水解酪朊酸鈉時，切割位點比較廣，能對蛋白中的-Val、-Phe、-Cys、-Leu、-Tyr、-Trp、-Ile、-Lys、-Gly等氨基酸殘基部位進行水解。此外，海灣扇貝與蝦夷扇貝相比富含酪氨酸（Tyr）、賴氨酸（Lys）、甘氨酸（Gly）等氨基酸[17]，所以中性蛋白酶對海灣扇貝進行水解時具有比較強的水解能力。

2.2 單因素實驗

2.2.1 酶添加量對水解度及自由基清除率的影響 由圖1可知，酶添加量（[S]/[E]）在0.50%～4.0%時，水解度隨著酶添加量的增加而緩慢升高，且在3.0%時達到最大值30.66%，繼續(xù)提高酶用量，水解度又緩慢下降。因為一般在底物濃度飽和的情況下，增加酶的用量能提高酶解效率；而此次實驗中的固液比為1∶5，明顯未達飽和濃度，所以水解度呈先升高后下降的趨勢。

表2 扇貝品種和蛋白酶種類對酶解效果影響Table 2 Effect of species of scallop and protease on enzymatic hydrolysis

圖1 酶添加量對酶解效果的影響Fig.1 Effect of enzyme quantity on enzymatic hydrolysis

DPPH自由基的清除能力和超氧陰離子自由基的清除能力均隨著酶添加量的增加逐漸增強，在3.0%時達到最大值，分別為89.75%和65.12%，繼續(xù)提高酶用量，清除率又降低。這可能因為酶解產(chǎn)生的多肽具有清除自由基的活性，而隨著酶解反應的進行活性多肽再次分解，從而失去清除能力。

2.2.2 固液比對水解度及自由基清除率的影響 由圖2可知，固液比在1∶1～1∶8時，水解度呈急速升高又緩慢降低的趨勢，在1∶3時達到最大值33.22%；DPPH自由基的清除率呈先降又升最后又降低的趨勢，但變化不明顯，固液比在1∶3時，達到最大值84.48%；超氧陰離子自由基的清除率變化幅度較大，固液比在1∶3時，清除率驟然升高，達到最大值，之后又迅速下降。因為最初底物濃度過高，過量的底物聚集在酶分子表面，形成另一種無活性的中間產(chǎn)物，抑制了蛋白酶解[18]；在固液比為1∶3時，底物濃度適中，利于其充分占據(jù)酶的活性中心，提高敏感肽鍵的數(shù)量，加快酶反應速率[19]，有利于獲得具有清除自由基活性的目標產(chǎn)物；隨著固液比的增大，底物濃度逐漸降低，酶解效率也逐漸下降。

2.2.3 溫度對水解度及自由基清除率的影響 由圖3可知，隨著溫度的升高，水解度和超氧陰離子自由基的清除能力均呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，在40℃時，水解度最大，對兩種自由基的清除能力最強，與相關研究報道相符。因為中性蛋白酶的最適作用溫度為40℃，低于或高于此溫度，酶活力及反應速率受到影響，自由基清除能力降低。

圖2 固液比對酶解效果的影響Fig.2 Effect of the ratio of solid to liquid on enzymatic hydrolysis

圖3 溫度對酶解效果的影響Fig.3 Effect of temperature on enzymatic hydrolysis

2.3 正交實驗結果

正交實驗的結果如表3所示，由極差分析結果可知，3個因素的極差由大到小依次為B＞C＞A，即固液比影響最大，其次為酶解溫度，最后為酶添加量。根據(jù)K值大小可知最優(yōu)組合為A3B1C2，即加酶量（[E]/[S]）3.25%，固液比（W/V）1∶2.5，酶解溫度為40℃。在此基礎上進行驗證實驗，3組平行實驗測得水解度均值為45.91%，DPPH自由基和超氧陰離子自由基的清除率分別平均為91.90%和79.72%，說明采用優(yōu)化后的酶解工藝能獲得較高自由基清除能力的抗氧化肽。

3 結論

通過比較扇貝品種及蛋白酶種類對所得抗氧化肽水解度及自由基清除能力的影響，選定海灣扇貝為原料，采用中性蛋白酶進行酶解；在單因素實驗基礎上，篩選出適宜的酶添加量（[E]/[S]）、固液比（W/V）和溫度，利用L9（34）正交實驗得到最佳酶解工藝為：酶添加量（[E]/[S]）3.25%，固液比1∶2.5（W/V），酶解溫度40℃，在此條件下水解度可達45.91%，對DPPH自由基和超氧陰離子自由基的清除率分別為91.90%和79.72%，說明所得扇貝抗氧化肽對DPPH自由基和超氧陰離子自由基具有較強的清除能力。

表3 L9（34）正交實驗設計與結果Table 3 L9（34）orthogonal design and results

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Study on preparation and the antioxidant effect of antioxidant peptide from scallop protein

LIU Yuan1，2，WANG Jian2，MU Jian-lou1，SUN Jian-feng1，WEI Wei1，WANG Jie1，*
（1.College of Food Science and Technology，Agriculture University of Hebei，Baoding 071000，China；2.Department of Food Science，Hebei North University，Zhangjiakou 075000，China）

With Bay scallop and Japanese scallop as raw material，effects of species of scallop and enzyme，enzyme quantity，temperature and the ratio of solid to liquid on the degree of hydrolysis（DH）and free radical scavenging activity were studied.On the basis of single factor experiment，orthogonal experiment of L9（34）was used to optimize the technical parameters.Results indicated that the optimal hydrolytic conditions were as follows：using Bay scallop as the material，enzyme quantity of the neutral protease 3.25%（[E]/[S]），temperature 40℃，the ratio of solid to liquid 1∶2.5.The DH was 45.91%，and the scavenging rate of DPPH radical and superoxide anion radical were 91.90%and 79.72%.

scallop；antioxidant peptide；superoxide anion；DPPH radical

TS201.1

A

1002-0306（2014）08-0206-04

10.13386/j.issn1002-0306.2014.08.038

2013－09－16 *通訊聯(lián)系人

劉媛（1981-），女，在讀博士，講師，研究方向：農(nóng)產(chǎn)品加工及貯藏工程。

國家海洋局公益性行業(yè)科研專項（201205031）；河北省科技計劃項目（14273205D）。