單曲霉菌與混合曲霉菌發(fā)酵對(duì)纖溶酶活性的影響

周媛媛，孫 楚，李永平，劉曉玲，李 秋，吳 非，*

（1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，黑龍江哈爾濱150030；2.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)經(jīng)管學(xué)院，黑龍江哈爾濱150030；3.黑龍江糧食職業(yè)學(xué)院，黑龍江哈爾濱150030；4.黑龍江省質(zhì)量監(jiān)督檢測(cè)研究院，黑龍江哈爾濱150030）

單曲霉菌與混合曲霉菌發(fā)酵對(duì)纖溶酶活性的影響

周媛媛1，孫 楚2，李永平3，劉曉玲4，李 秋1，吳 非1，*

（1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，黑龍江哈爾濱150030；2.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)經(jīng)管學(xué)院，黑龍江哈爾濱150030；3.黑龍江糧食職業(yè)學(xué)院，黑龍江哈爾濱150030；4.黑龍江省質(zhì)量監(jiān)督檢測(cè)研究院，黑龍江哈爾濱150030）

以三株經(jīng)過篩選誘變得到的纖溶酶高產(chǎn)突變株作為實(shí)驗(yàn)菌株，以大豆為原料，選取誘變后纖溶酶活性較大的黑曲霉3.4309進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)，以纖溶酶活性為指標(biāo)，確定其產(chǎn)纖溶酶活性的最適發(fā)酵溫度為30℃、接種量為10%、料水比0.6mL/g、裝料量20g/250mL、pH5.5，發(fā)酵72h纖溶酶活性達(dá)到1.16TAME U/mL。在此條件下，運(yùn)用混料設(shè)計(jì)確定最適的混菌接入量為黑曲霉3.4309添加4.3%、米曲霉3.800添加2.1%、米曲霉3.5232添加3.6%，72h發(fā)酵纖溶酶活性最大達(dá)到1.311TAME U/mL，比最優(yōu)條件下單菌發(fā)酵纖溶酶活性高13%。

大豆，單霉菌發(fā)酵，混合霉菌發(fā)酵，纖溶酶活性

血栓病是涉及到血液和循環(huán)系統(tǒng)的一種疾病，嚴(yán)重危害人類健康，是對(duì)死亡威脅最大的疾病之一[1]。溶栓治療即利用纖溶酶水解纖維蛋白原和纖維蛋白，使非纖溶蛋白轉(zhuǎn)變?yōu)榭扇苄运槠倪^程，是治療血栓性疾病安全有效的手段[2]。目前，國內(nèi)外已正式批準(zhǔn)的臨床溶栓藥物有尿激酶、鏈激酶[3]等，但這些藥物盡管溶栓效果好，卻還存在許多缺點(diǎn)且不能口服。因此，尋找安全有效、無毒副作用[4-5]、服用方便的新型溶栓劑或溶栓保健食品具有重要意義。

具有溶栓作用的纖溶酶是一種蛋白酶，微生物以大豆為基質(zhì)發(fā)酵能產(chǎn)生纖溶酶，是因?yàn)榇蠖怪械鞍踪|(zhì)含量高，結(jié)構(gòu)復(fù)雜，導(dǎo)致其生長(zhǎng)環(huán)境中存在和血纖維蛋白結(jié)構(gòu)類似或一致的誘導(dǎo)物。國際上，對(duì)于傳統(tǒng)豆制品來源纖溶酶的發(fā)現(xiàn)最早開始于1987年日本學(xué)者從納豆中分離出了納豆激酶[6]，國內(nèi)報(bào)道的產(chǎn)纖溶酶霉菌有根霉[7]、脈孢霉[8]和米曲霉[9]，本研究以大豆為原料，以經(jīng)過篩選誘變的黑曲霉和米曲霉為實(shí)驗(yàn)菌株，采用固態(tài)發(fā)酵法應(yīng)用混料設(shè)計(jì)確定最適的混菌接入比例，并分別對(duì)單菌、混菌發(fā)酵條件優(yōu)化研究進(jìn)行比較。雖然目前對(duì)于微生物法產(chǎn)纖溶酶的研究較多，但是大多數(shù)都是通過單菌株發(fā)酵條件的優(yōu)化提高酶活，而混菌發(fā)酵產(chǎn)纖溶酶的研究很少，本研究即是想通過尋找一種新的發(fā)酵方式，即混菌發(fā)酵來提高酶活，預(yù)實(shí)驗(yàn)表明同時(shí)接種發(fā)酵，產(chǎn)酶活性較高。其結(jié)果可應(yīng)用于食品加工，為新型溶栓保健食品的開發(fā)，及纖溶酶的提取純化以開發(fā)口服用藥提供基礎(chǔ)，也為大豆的綜合利用提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

黑曲霉3.4309、米曲霉3.800、米曲霉3.5232 均由東北農(nóng)業(yè)大學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供，經(jīng)紫外、微波誘變后纖溶酶活力分別為0.737、0.721、0.686TAME U/mL；大豆培養(yǎng)基 取大豆加水浸泡6～8h，瀝干后置于鍋內(nèi)煮熟，將煮熟的大豆碾碎，為霉菌的發(fā)酵基質(zhì)；對(duì)甲基苯磺酰-L-精氨酸甲酯（TAME） Sigma公司；變色酸、硫酸、甲醇等試劑 均為分析純。

高壓濕熱滅菌鍋 上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療器械廠；722可見光分光光度計(jì) 上海菁華科技儀器有限公司；振蕩培養(yǎng)箱 常州國華電器有限公司；超凈工作臺(tái) 北京安泰科技有限公司；pHS-25型pH計(jì) 上海精科雷磁儀器廠；JD500-2型分析天平 沈陽龍騰電子稱量?jī)x器有限公司；高速離心機(jī) 上海珂淮儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 霉菌菌株活化 選取誘變后纖溶酶活性最高的黑曲霉3.4309作為實(shí)驗(yàn)菌株。從凍存管中取300μL菌液分別接入10mL PDA液體培養(yǎng)基中，30℃下活化培養(yǎng)72h，然后分別吸取1.5mL菌液于50mL PDA培養(yǎng)基中，30℃下活化培養(yǎng)60h，再分別吸取3mL菌液于100mL PDA培養(yǎng)基中，30℃下活化培養(yǎng)54h待用。

1.2.2 纖溶酶活性的測(cè)定 纖溶酶能夠特異地催化TAME的分解，用TAME底物法來測(cè)定纖溶酶的酶活性[10-11]?；钚詥挝籘AME U/mL是指每毫升發(fā)酵液催化TAME分解的單位數(shù)量，即每毫升發(fā)酵液的纖溶酶活性。

1.2.3 單霉菌發(fā)酵大豆產(chǎn)纖溶酶培養(yǎng)條件的優(yōu)化 選取誘變處理后，纖溶酶活性最大的黑曲霉3.4309作為實(shí)驗(yàn)菌株。通過單因素實(shí)驗(yàn)，確定發(fā)酵溫度、料水比、菌種添加量、裝料量以及培養(yǎng)基初始pH對(duì)單霉菌發(fā)酵大豆產(chǎn)纖溶酶活性的影響。

1.2.3.1 發(fā)酵溫度對(duì)纖溶酶活性的影響 在菌種添加量為10%的條件下，用黑曲霉3.4309發(fā)酵大豆，設(shè)定發(fā)酵溫度分別為26、28、30、32、34℃，在此條件下發(fā)酵72h，比色法測(cè)發(fā)酵液的纖溶酶活性，確定最佳發(fā)酵溫度。

1.2.3.2 料水比對(duì)纖溶酶活性的影響 在菌種添加量為10%、發(fā)酵溫度30℃的條件下，分別向培養(yǎng)基中按0.2、0.4、0.6、0.8、1mL/g的量加入水，用黑曲霉3.4309發(fā)酵72h，比色法測(cè)發(fā)酵液的纖溶酶活性，確定最佳料水比。

1.2.3.3 菌種添加量對(duì)纖溶酶活性的影響 以黑曲霉3.4309發(fā)酵大豆，在發(fā)酵溫度30℃，菌種的添加量分別為4%、6%、8%、10%、12%的條件下發(fā)酵72h，比色法測(cè)定發(fā)酵液中纖溶酶活性，確定最佳菌種添加量。

1.2.3.4 裝料量對(duì)纖溶酶活性的影響 分別向250mL三角瓶中加入15、20、25、30g培養(yǎng)基，30℃以黑曲霉3.4309添加量為10%發(fā)酵72h，比色法測(cè)定發(fā)酵液中纖溶酶活性，確定最佳裝料量。

1.2.3.5 培養(yǎng)基初始pH對(duì)纖溶酶活性的影響 調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的初始pH分別為4、4.5、5、5.5、6、7。30℃以黑曲霉3.4309添加量為10%發(fā)酵72h，比色法測(cè)定發(fā)酵液中纖溶酶活性，確定培養(yǎng)基最佳初始pH。

1.2.4 混合霉菌發(fā)酵大豆產(chǎn)纖溶酶培養(yǎng)條件的優(yōu)化

根據(jù)以上實(shí)驗(yàn)，以發(fā)酵溫度30℃，發(fā)酵時(shí)間72h，菌種添加量10%為固定值，采用混料實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)[12-13]，混合霉菌發(fā)酵大豆，以A（黑曲霉3.4309添加量）、B（米曲霉3.800添加量）、C（米曲霉3.5232添加量）分別表示自變量，以纖溶酶活性為因變量，確定因素水平編碼表如表1所示。

實(shí)驗(yàn)采用混料設(shè)計(jì)中的Simplex Centroid方法，應(yīng)用Design-Expert軟件進(jìn)行分析，編碼設(shè)置是系統(tǒng)自動(dòng)生成的。實(shí)際生產(chǎn)中將百分比換算成L或g是可以達(dá)到的。

表1 因素水平編碼表Table 1 Encode table of factors and levels

1.2.5 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn) 通過運(yùn)用混料實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)研究混菌不同配比參數(shù)對(duì)纖溶酶活性的影響，得到產(chǎn)纖溶酶活性的最優(yōu)菌株配比值。考察最優(yōu)混合菌配比參數(shù)工藝條件下，進(jìn)行3次驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)取平均值。對(duì)比最優(yōu)混合菌配比條件下得到的驗(yàn)證值與預(yù)測(cè)值之間的標(biāo)準(zhǔn)偏差是否在合理范圍內(nèi)。

1.2.6 單霉菌與混合霉菌復(fù)合發(fā)酵對(duì)纖溶酶活性的影響 在分別確定單霉菌、混合霉菌最優(yōu)發(fā)酵條件的基礎(chǔ)上，分別在最優(yōu)條件下進(jìn)行發(fā)酵，測(cè)定產(chǎn)酶曲線，對(duì)比纖溶酶活性差異。

1.2.7 統(tǒng)計(jì)分析 單因素實(shí)驗(yàn)采用Microsoft Excel 2003進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，每組實(shí)驗(yàn)均做3組檢測(cè)；混料設(shè)計(jì)采用Design Expert進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 單霉菌發(fā)酵產(chǎn)纖溶酶條件的優(yōu)化結(jié)果

2.1.1 發(fā)酵溫度對(duì)單菌發(fā)酵纖溶酶活性的影響 由圖1可知，發(fā)酵溫度對(duì)纖溶酶活性影響的結(jié)果可知，溫度對(duì)纖溶酶活性的影響較大，當(dāng)溫度在28～30℃時(shí)，纖溶酶活性隨著溫度的升高而逐漸增大，30℃時(shí)發(fā)酵液纖溶酶活性最高，為0.965TAME U/mL，隨后酶活逐漸降低，這與閔偉紅等的研究結(jié)論一致[14]。

圖1 溫度對(duì)單菌發(fā)酵纖溶酶活性的影響Fig.1 The influence of temperature to fibrinolytic activity

2.1.2 料水比對(duì)單菌發(fā)酵纖溶酶活性的影響 由圖2可知，培養(yǎng)基的水分含量不同，纖溶酶活性大小也不相同。水分含量低時(shí)，霉菌菌絲生長(zhǎng)不旺盛，產(chǎn)酶量低；水分含量高時(shí)，不利于通風(fēng)，菌體生長(zhǎng)不夠旺盛，也不利于產(chǎn)酶。當(dāng)料水比為0.6mL/g時(shí)為最優(yōu)，此時(shí)纖溶酶活性達(dá)到0.864TAME U/mL。

圖2 料水比對(duì)單菌發(fā)酵纖溶酶活性的影響Fig.2 The influence of water ratio to fibrinolytic activity

2.1.3 接種量對(duì)單菌發(fā)酵纖溶酶活性的影響 由圖3可知，隨著接種量的逐漸增加，菌群生長(zhǎng)加快，大豆培養(yǎng)基的營養(yǎng)物質(zhì)得到充分利用，纖溶酶活性逐漸升高。當(dāng)接入10%的菌液時(shí)，纖溶酶活性最大達(dá)到1.116TAME U/mL。接菌量繼續(xù)增加，菌體生長(zhǎng)過快，培養(yǎng)基黏性大，溶氧不足，影響菌株代謝產(chǎn)酶，纖溶酶活性降低。

2.1.4 裝料量對(duì)單菌發(fā)酵纖溶酶活性的影響 圖4為裝料量對(duì)纖溶酶活性的影響，不同的裝料量通過影響菌株的通氣量，從而影響菌株的生長(zhǎng)代謝。由圖4可知，裝料量為20g/250mL為宜，此時(shí)，纖溶酶活性最大為0.912TAME U/mL。

圖3 接種量對(duì)單菌發(fā)酵纖溶酶活性的影響Fig.3 The influence of adding amount of strains to fibrinolytic activity

圖4 裝料量對(duì)單菌發(fā)酵纖溶酶活性的影響Fig.4 The influence of loading capacity to fibrinolytic activity

2.1.5 培養(yǎng)基pH對(duì)單菌發(fā)酵纖溶酶活性的影響 圖5為培養(yǎng)基初始pH對(duì)纖溶酶活性的影響，由圖5可知，在大豆培養(yǎng)基的自然pH范圍5～5.5范圍內(nèi)纖溶酶活性較大，當(dāng)pH為5.5時(shí)，纖溶酶活性最大達(dá)到0.806TAME U/mL。因此，pH5.5為該菌株生長(zhǎng)和生產(chǎn)纖溶酶的最佳初始pH，這與楊雪佳等[15]的研究結(jié)論一致。

圖5 培養(yǎng)基pH對(duì)單菌發(fā)酵纖溶酶活性的影響Fig.5 The influence of pH to fibrinolytic activity

2.2 混合霉菌發(fā)酵大豆產(chǎn)纖溶酶培養(yǎng)條件的優(yōu)化

2.2.1 混合霉菌發(fā)酵大豆對(duì)纖溶酶活性的影響 以黑曲霉3.4309添加量A（%）、米曲霉3.800添加量B（%）和米曲霉3.5232添加量C（%）分別代表的因素為自變量，以纖溶酶活性R為因變量，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與數(shù)據(jù)處理采用統(tǒng)計(jì)軟件Design-Expert來完成，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表2。

通過統(tǒng)計(jì)分析軟件Design-Expert進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，建立纖溶酶活性R回歸模型如下：纖溶酶活性R=1.09A+0.95B+1.08C-0.14AB+0.10AC-0.57BC+ 9.93ABC。采用Design-Expert軟件對(duì)纖溶酶活性R模型方程進(jìn)行方差分析，結(jié)果見表3。

表2 實(shí)驗(yàn)安排及結(jié)果Table 2 Experiment plan and results

單一項(xiàng)都顯著，表中只顯示了交互項(xiàng)的顯著性分析，未顯示單一項(xiàng)。由表3可知，該模型回歸顯著（p＜0.05），失擬項(xiàng)不顯著（p＞0.05），并且該模R2=92.20%，說明該模型能很好地?cái)M合該實(shí)驗(yàn)。通過F值和p值可知交互項(xiàng)之間的相互作用對(duì)纖溶酶活性R影響顯著性關(guān)系為：ABC＞BC＞AB＞AC，也就是說黑曲霉3.4309添加量、米曲霉3.800添加量和米曲霉3.5232添加量三種菌株之間的交互作用比其中任意兩種菌株之間的交互作用對(duì)纖溶酶活性的影響顯著，說明三種菌株的混合發(fā)酵對(duì)產(chǎn)品纖溶酶活性的影響較大。交互項(xiàng)對(duì)纖溶酶活性的等高線分析見圖6。

圖6 混料設(shè)計(jì)因素交互項(xiàng)對(duì)纖溶酶活性的等高線分析Fig.6 Contours analysis for mixture design factor interaction to fibrinolytic activity

由圖6可以看出，A、B、C交互作用對(duì)纖溶酶活性的影響。三種菌株以一定的比例混合時(shí)的纖溶酶活性大小優(yōu)于任意兩種菌株混合的纖溶酶活性值，只有當(dāng)三種菌株以一定的比例混合時(shí)，纖溶酶活性有較大值，這與方差分析的結(jié)果一致。

圖7 混菌比例對(duì)纖溶酶活性的混料設(shè)計(jì)優(yōu)化結(jié)果Fig.7 Mixing design optimization results of ratio of three moulds to fibrinolytic activity

圖7為霉菌菌株混合發(fā)酵對(duì)纖溶酶活性的混料設(shè)計(jì)優(yōu)化結(jié)果。由圖7可知，黑曲霉3.4309、米曲霉3.800和米曲霉3.5232添加量分別為4.3%、2.1%和3.6%時(shí)，纖溶酶活性有最大值為1.343TAME U/mL。因此，當(dāng)黑曲霉3.4309、米曲霉3.800和米曲霉3.5232分別接種4.3%、2.1%和3.6%時(shí)，發(fā)酵液的纖溶酶活性較高。

2.2.2 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn) 為了驗(yàn)證模型預(yù)測(cè)的準(zhǔn)確性，在最優(yōu)混菌培養(yǎng)條件下，即黑曲霉3.4309、米曲霉3.800、米曲霉3.5232添加量分別為4.3%、2.1%、3.6%，重復(fù)進(jìn)行3次平行實(shí)驗(yàn)，3次平行實(shí)驗(yàn)纖溶酶活性的平均值為1.320與預(yù)測(cè)值1.343較接近。說明響應(yīng)值的實(shí)驗(yàn)值與回歸方程預(yù)測(cè)值吻合良好。最終確定最適產(chǎn)纖溶酶的混合菌株添加量分別為：黑曲素3.4309添加4.3%、米曲霉3.800添加2.1%、米曲霉3.5232添加3.6%。

表3 回歸方程的方差分析結(jié)果Table 3 Regression equation of the results of variance analysis

2.3 單霉菌與混合霉菌復(fù)合發(fā)酵對(duì)纖溶酶活性的影響

根據(jù)以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果，分別在最優(yōu)產(chǎn)纖溶酶條件下分別進(jìn)行單菌、混菌發(fā)酵，測(cè)定發(fā)酵液的纖溶酶活性。結(jié)果如圖8所示。

圖8 對(duì)比不同發(fā)酵方式在最優(yōu)條件下的產(chǎn)纖溶酶曲線Fig.8 Comparing the influence of different fermention to plasmin curve under optimal conditons

由圖8看出，由三種霉菌混合發(fā)酵與單霉菌發(fā)酵相比，纖溶酶活性有顯著提高。分析可能是由于不同微生物發(fā)酵產(chǎn)生的纖溶酶分子量大小、結(jié)構(gòu)、酶切位點(diǎn)均有差別，故三種霉菌混合發(fā)酵可以彌補(bǔ)相互間產(chǎn)酶的差異，產(chǎn)生多種不同的纖溶酶，充分發(fā)揮各酶間的協(xié)同作用，大幅度提高酶活性及產(chǎn)量。因此，混菌發(fā)酵比單菌發(fā)酵酶活性及產(chǎn)量要高。由圖8可知，發(fā)酵24h，霉菌處于遲緩期，兩種發(fā)酵方式產(chǎn)生的纖溶酶均較少，隨著時(shí)間延長(zhǎng)，菌株進(jìn)入對(duì)數(shù)期和穩(wěn)定期，此階段酶活力顯著提高而穩(wěn)定，代謝旺盛。發(fā)酵至72h，兩種發(fā)酵方式產(chǎn)纖溶酶活性分別達(dá)到最大，混菌發(fā)酵產(chǎn)纖溶酶活性為1.311TAME U/mL，單菌發(fā)酵產(chǎn)纖溶酶活性為1.16TAME U/mL，混菌發(fā)酵較單菌發(fā)酵方式產(chǎn)纖溶酶活性高13%。由此可知，混合霉菌發(fā)酵產(chǎn)纖溶酶優(yōu)于單菌株發(fā)酵。

3 結(jié)論

由單霉菌發(fā)酵大豆產(chǎn)纖溶酶的優(yōu)化結(jié)果可知：在接種量為10%、發(fā)酵溫度為30℃、料水比為0.6mL/g，裝料量為20g/250mL，培養(yǎng)基初始pH5.5時(shí)，纖溶酶活性最大，發(fā)酵72h達(dá)到1.16TAME U/mL；在相同條件下，利用混料設(shè)計(jì)優(yōu)化得到的最適混合霉菌培養(yǎng)接菌量即黑曲霉3.4309添加4.3%、米曲霉3.800添加2.1%、米曲霉3.5232添加3.6%時(shí)，發(fā)酵72h，最終發(fā)酵液纖溶酶活性達(dá)到1.311TAME U/mL，高于任何一種單霉菌發(fā)酵時(shí)的纖溶酶活性。即混合霉菌發(fā)酵大豆時(shí)纖溶酶活性得到了提高，此種發(fā)酵方式的發(fā)現(xiàn)為進(jìn)一步纖溶酶的提取及高纖溶活性食品的開發(fā)提供了基礎(chǔ)。

[1]遲東升，阮新民.新型溶栓劑--納豆激酶[J].心血管病學(xué)進(jìn)展，2007，28（4）：545-550.

[2]王光利.芽孢桿菌纖溶酶的純化、性質(zhì)及其發(fā)酵條件的研究[D].重慶：西南農(nóng)業(yè)大學(xué)，2001.

[3]SOSAKI K M，HATSUCKA N，TOKIETAL.Fibrinolytic and coagulation activity level during formation of experimental throbus in dog’s saphena vein[J].Life Science，1960，77：1659.

[4]SUMI H，HANMADA H，NAKANISHI H.Enhancement of the fibrinolytic activity inplasma by oraladmistration of nattokinase[J].Acta Hamatol，1990，84（3）：139-143.

[5]MITSUGU F，KYOUGSU H，YAE I.Transport of nattokinase across the rat intestinal tratt[M].Biol PhamBull，1995（9）：1194-1196.

[6]Sumi H，Hamada H，Tsushima H，et al.A novel fibrinolytic enzyme（noottokinase）in the vegetable cheese natto，a typical and popular soybean food in the Janpanese[J].Experientia，1987，43（20）：1110-1111.

[7]Liu xiao-lan，Du Lian-xiang.Purification and characterization of a novel fibrinolytic enzyme from Rhizopus chinensis 12[J]. Microbiol Biotechnol，2005，67：209-214.

[8]許愛清，劉曉蘭.脈孢霉發(fā)酵豆渣產(chǎn)纖溶酶研究[J].食品與發(fā)酵工業(yè)，2008，34（1）：77-79.

[9]高占爭(zhēng)，趙允麟.醬油曲中產(chǎn)纖溶酶微生物的分離篩選和初步鑒定[J].食品與藥品，2006（1）：61-63.

[10]李劍梅，苗玉琨，李鑫.TAME法對(duì)康脂口服液中蚓激酶單位效價(jià)的測(cè)定[J].微生物學(xué)雜志，2001，21（3）：61-62.

[11]王怡鑫，尹宗寧，張霞.納豆激酶體外活性測(cè)定及影響因素考察[J].中國生化藥物雜志，2008，29（3）：168-171.

[12]童華榮，龔正禮.茶葉拼配的混料設(shè)計(jì)研究[J].茶葉科學(xué)，2004，24（3）：207-211.

[13]劉春光，周建斌，陳竹君.混料實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)在肥料配比研究中的應(yīng)用[J].西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2001，29（1）：59-62.

[14]閔偉紅，李佳，王影，等.高產(chǎn)纖溶酶霉菌固體發(fā)酵工藝條件的優(yōu)化[J].食品科學(xué)，2008，29（1）：207-211.

[15]楊雪佳，曾志，路福平，等.大豆為原料的根霉纖溶酶固態(tài)發(fā)酵工藝條件[J].天津科技大學(xué)學(xué)報(bào)，2006，21（4）：51-54.

Effect of single and mixed moulds fermentation methods on fibrinolytic activity

ZHOU Yuan-yuan1，SUN Chu2，LI Yong-ping3，LIU Xiao-ling4，LI Qiu1，WU Fei1，*
（1.Institute of Food，Northeast Agricultural University，Harbin 150030，China；2.Institute of economic management，Northeast Agricultural University，Harbin 150030，China；3.Heilongjiang Grain Vocational College，Harbin 150030，China；4.Institute of Quality supervision and Inspection，Heilongjiang province，Harbin 150030，China）

Three screened and mutagenesised species of moulds was selected as trial strains，and were cultured in soybeans.Aspergillus niger 3.4309 was used to do single factor test for its higher fibrinolytic activity，using fibrinolytic activity as index，determine its optimum fermentation temperature was 30℃，inoculation amount was 10%，the ratio of water was 0.6mL/g，loading capacity was 20g/250mL，the optimum pH was 5.5.Under these optimum conditons，the fibrinolytic activity could reach 1.16 TAME U/mL.Then used the mixture design method to determin the optimum mixed inoculation amount was：Aspergillus niger 3.4309 4.3%added，Aspergillus oryzae 3.800 2.1%added and Aspergillus oryzae 3.6%added.In this way，the fibrinolytic activity could reach 1.311 TAME U/mL，13%higher than fibrinolytic activity of single mould fermentation.

soybean；single moulds fermentation；mixed moulds fermentation；fibrinolytic activity

TS201.1

A

1002-0306（2014）08-0161-05

10.13386/j.issn1002-0306.2014.08.028

2013－08－19 *通訊聯(lián)系人

周媛媛（1990-），女，在讀碩士研究生，研究方向：糧食、油脂與植物蛋白工程。

黑龍江省應(yīng)用技術(shù)研究與開發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目（GC13B213）。