羅非魚(yú)水解蛋白金屬離子螯合物的抑菌活性研究

王子懷，胡 曉，李來(lái)好，楊賢慶，郝淑賢，吳燕燕，陳勝軍，岑建偉

（1.中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院南海水產(chǎn)研究所，農(nóng)業(yè)部水產(chǎn)品加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，國(guó)家水產(chǎn)品加工技術(shù)研發(fā)中心，廣東廣州510300；2.上海海洋大學(xué)食品學(xué)院，上海201306；3.中國(guó)科學(xué)院南海海洋研究所，廣東廣州510301）

羅非魚(yú)水解蛋白金屬離子螯合物的抑菌活性研究

王子懷1，2，胡 曉1，3，李來(lái)好1，*，楊賢慶1，郝淑賢1，吳燕燕1，陳勝軍1，岑建偉1

（1.中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院南海水產(chǎn)研究所，農(nóng)業(yè)部水產(chǎn)品加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，國(guó)家水產(chǎn)品加工技術(shù)研發(fā)中心，廣東廣州510300；2.上海海洋大學(xué)食品學(xué)院，上海201306；3.中國(guó)科學(xué)院南海海洋研究所，廣東廣州510301）

羅非魚(yú)肉蛋白經(jīng)木瓜蛋白酶水解后分別與CaCl2、FeCl2按質(zhì)量比（水解物∶金屬鹽）為5∶1、10∶1、20∶1進(jìn)行螯合，研究并比較了羅非魚(yú)水解蛋白鈣、亞鐵離子螯合物的抗菌活性。結(jié)果表明：鈣、亞鐵離子與水解物的螯合率隨著水解物與金屬鹽質(zhì)量比的升高而逐漸增大；氨基酸分析表明羅非魚(yú)肉蛋白水解物中具有金屬螯合活性的氨基酸含量較高，其占總氨基酸含量的34.59%；抑菌實(shí)驗(yàn)顯示得到的螯合物對(duì)枯草芽孢桿菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌的生長(zhǎng)表現(xiàn)出明顯的抑制作用，其中以5∶1質(zhì)量比得到的亞鐵離子螯合物的抑菌活性最高。

羅非魚(yú)水解蛋白，金屬離子螯合物，抑菌活性

我國(guó)羅非魚(yú)養(yǎng)殖產(chǎn)量位居世界首位，羅非魚(yú)資源極為豐富。目前，羅非魚(yú)的加工主要以?xún)鋈~(yú)與凍魚(yú)片為主，而出口產(chǎn)品中以加工初級(jí)產(chǎn)品較多，深加工產(chǎn)品很少，大大限制了羅非魚(yú)蛋白的高值化利用。鈣和鐵都是人體必需的金屬元素，鈣一旦缺乏將影響機(jī)體發(fā)育并易造成骨質(zhì)疏松等多種疾?。蝗辫F易導(dǎo)致貧血和免疫力下降等疾病。人體對(duì)鈣、鐵的需求主要從食物中獲得，但其吸收過(guò)程及生物利用率受到多方面因素的影響。離子螯合肽是金屬離子按一定的摩爾比以共價(jià)鍵同肽類(lèi)物質(zhì)結(jié)合而成的有機(jī)物。鈣、鐵離子與肽螯合而形成有機(jī)態(tài)后，能夠借助肽在機(jī)體內(nèi)的吸收機(jī)制提高其生物利用率[1-4]。研究發(fā)現(xiàn)，將具有抗菌活性或抗氧化活性的不同來(lái)源的蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物與一些金屬離子（如鈣、鐵、鋅、銅等）螯合后可以增強(qiáng)其生物活性[5-10]。因此，蛋白水解物與金屬離子的螯合物不僅可以作為一種金屬元素補(bǔ)充劑，又可作為食品、化妝品的添加劑，具有很大的研發(fā)價(jià)值。為提高羅非魚(yú)精深加工和綜合利用水平，尋求羅非魚(yú)肉蛋白新的利用途徑已成為目前的研究熱點(diǎn)，利用羅非魚(yú)肉蛋白制備抗菌活性肽是提高其生物效價(jià)的方式之一?？v觀國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)資料，制備羅非魚(yú)水解蛋白金屬離子螯合物并探索其螯合率與抑菌活性關(guān)系的相關(guān)研究報(bào)道不多。本實(shí)驗(yàn)以羅非魚(yú)肉為原料，采用酶法水解制備得到羅非魚(yú)肉蛋白水解物，將此水解物分別與鈣、鐵離子螯合后研究其抑菌活性，以期為具有抗菌活性的金屬離子螯合肽的研究與開(kāi)發(fā)提供重要參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

羅非魚(yú) 購(gòu)自廣州華潤(rùn)萬(wàn)家超市，取羅非魚(yú)肉，絞碎，放置于聚乙烯袋內(nèi)于-18℃凍藏備用；木瓜蛋白酶（實(shí)際酶活：264000U/g） 廣州齊云生物技術(shù)有限公司；氯化鈣、氯化亞鐵、氯化銨 均為分析純，廣州齊云生物技術(shù)有限公司；枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis，ATCC6633）、大腸桿菌（E.coli，ATCC25922）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus，ATCC6538）、技術(shù)瓊脂、營(yíng)養(yǎng)瓊脂 廣東環(huán)凱生物科技有限公司；氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品 Sigma。

DK-S24恒溫水浴鍋 上海信森實(shí)驗(yàn)儀；普及型pH計(jì) 德國(guó)Sartorius公司；HJ-3恒溫磁力攪拌器 江蘇榮華儀器制造有限公司；3K30高速冷凍離心機(jī) 德國(guó)Sigma公司；AA240原子吸收光譜儀 美國(guó)Varian公司；Mars xpress微波消解儀 美國(guó)CEM公司；1100 series高效液相色譜 美國(guó)Agilent公司；PICO.TAG色譜柱 Waters，Milford，MA，USA；Transsonic T1-H-10超聲波清洗儀 德國(guó)Elma公司；Alpha1-4冷凍干燥機(jī) 德國(guó)Chaist公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 羅非魚(yú)肉蛋白水解物的制備 參考馬賽蕊等[11]方法，取羅非魚(yú)肉解凍后以1∶2（m/V）加入去離子水均質(zhì)至混合物呈均一乳白色后，55℃恒溫水浴。待樣品中心溫度達(dá)到55℃后，添加木瓜蛋白酶，加酶量為0.3g/100g魚(yú)肉，攪拌酶解4h后沸水浴15min滅酶。冷卻后，于4℃、10000r/min離心20min后，抽濾得到的濾液即為酶解液。將酶解液凍干后即得到羅非魚(yú)肉蛋白水解物。

1.2.2 羅非魚(yú)肉水解蛋白金屬離子螯合物的制備 本實(shí)驗(yàn)選取亞鐵、鈣兩種金屬離子與上述羅非魚(yú)肉蛋白水解物螯合并測(cè)定螯合物的螯合率。以CaCl2、FeCl2為金屬源，配制5mg/mL CaCl2、FeCl2溶液，稱(chēng)取一定量的水解物溶于水中，室溫水化10min，然后按比例加入CaCl2、FeCl2（水解物與金屬鹽質(zhì)量比為5∶1、10∶1、20∶1）于37℃水浴40min進(jìn)行螯合反應(yīng)。反應(yīng)結(jié)束后將溶液全部移入透析袋透析并記錄透析后溶液的總膨脹體積，透析后溶液經(jīng)冷凍干燥即得螯合物樣品。

1.2.3 螯合率測(cè)定 取上述透析后溶液5mL于消化管（經(jīng)10%HNO3浸泡過(guò)夜并用去離子水洗凈），加入10mL濃硝酸和5mL去離子水后進(jìn)行微波消解。取5mL消解液于100mL容量瓶（經(jīng)10%HNO3浸泡過(guò)夜并用去離子水洗凈），以去離子水定容后用原子吸收法測(cè)定溶液中所含金屬離子的濃度C（mg/L），后經(jīng)計(jì)算可得各螯合物的螯合率。

式中：C：為透析后金屬離子的濃度（mg/L）；V：為總膨脹體積（mL）；m：為加入金屬總質(zhì)量（g）；n：為稀釋倍數(shù)。

1.2.4 螯合物的抑菌活性 參考張巖等[12]方法從4℃冰箱中取出的保藏菌株需經(jīng)活化后使用，用接種環(huán)挑取適量菌苔在營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面上劃線(xiàn)，37℃過(guò)夜培養(yǎng)。采用牛津杯雙層平板法檢測(cè)各螯合物抑菌活性，取5mL滅菌的2%瓊脂于培養(yǎng)皿中鋪平，待其凝固后擺放牛津杯，將1mL濃度為108CFU/mL測(cè)試菌液加入到滅菌后冷卻到46℃的營(yíng)養(yǎng)瓊脂中，搖勻后適量?jī)A倒入上述平板，待營(yíng)養(yǎng)瓊脂凝固后用滅菌的鑷子小心取出牛津杯，向每個(gè)孔中分別加入一種螯合物水溶液（24mg/mL）150μL以測(cè)試各螯合物的抑菌活性，設(shè)置三個(gè)平行，以相同濃度（如5∶1質(zhì)量比的螯合物相應(yīng)的肽水解物濃度為20mg/mL）的肽水解物溶液作對(duì)照，以無(wú)菌水作空白，將培養(yǎng)皿小心移至恒溫箱37℃培養(yǎng)12h，觀察結(jié)果并測(cè)量抑菌圈直徑。

1.2.5 氨基酸分析 用6mol/L鹽酸于110℃處理樣品24h，使其充分水解，采用反相高效液相色譜（Agilent）及PICO.TAG柱（Waters），以異硫氰酸苯酯柱前衍生化反相高效液相法[13]測(cè)定其氨基酸組成。其中色氨酸經(jīng)堿解后測(cè)定，氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品經(jīng)過(guò)相同步驟處理后進(jìn)行分析。

1.2.6 數(shù)據(jù)分析 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示（n=3），采用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟處理數(shù)據(jù)，應(yīng)用t-test檢驗(yàn)組間差異顯著性，p＜0.05表示組間差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 螯合率測(cè)定結(jié)果

圖1 螯合率測(cè)定結(jié)果Fig.1 Chelation rate of the samples

本實(shí)驗(yàn)中，羅非魚(yú)肉蛋白水解物與鈣離子和亞鐵離子按質(zhì)量比（水解物∶金屬鹽）5∶1、10∶1及20∶1進(jìn)行螯合。由圖1可知，鈣離子螯合物在5∶1、10∶1及20∶1的配比下的螯合率分別為44.82%、62.17%及71.88%；亞鐵離子螯合物的螯合率為40.49%、52.84%及60.72%。不同金屬離子與同種蛋白水解物的螯合率不同，相同質(zhì)量比下，水解物與鈣離子的螯合率較亞鐵離子的高，說(shuō)明相同條件下水解物更易與鈣離子發(fā)生螯合反應(yīng)；而同種金屬在不同質(zhì)量比下，螯合率隨著質(zhì)量比升高而增大。

2.2 氨基酸分析結(jié)果

圖2 羅非魚(yú)蛋白水解物的氨基酸含量Fig.2 Amino acids content of tilapia protein hydrolysates

有研究表明，肽或蛋白的氨基酸組成及序列決定了其與金屬離子結(jié)合的效果，具有高含量谷氨酸和天冬氨酸殘基的肽或蛋白與金屬離子的結(jié)合效果較好，Asp-Glu-Asp和Glu-Glu-Glu可能是與金屬離子結(jié)合的關(guān)鍵序列[14-15]。幾種與金屬螯合活性較高的氨基酸已見(jiàn)諸報(bào)道，如組氨酸、絲氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、天冬氨酸[16]。本實(shí)驗(yàn)中測(cè)得羅非魚(yú)肉蛋白水解物樣品中谷氨酸占17.28%，天冬氨酸占9.25%，組氨酸占3.38%，絲氨酸占3.58%，半胱氨酸占0.68%，這五種螯合活性較高的氨基酸占總氨基酸的34.59%，含量較高，這可能是羅非魚(yú)蛋白水解物具有較好螯合鈣、鐵離子能力的主要原因。此外，有報(bào)道認(rèn)為半胱氨酸是影響蛋白水解物尤其是肉類(lèi)蛋白水解物與亞鐵離子的螯合活性的重要氨基酸[17-19]，而Kroll[20]發(fā)現(xiàn)鈣離子與蛋白水解物的螯合活性與酸性氨基酸（Asp，Glu）上的羧基及組氨酸上的咪唑基團(tuán)有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)中得到的羅非魚(yú)蛋白水解物中半胱氨酸（Cys）含量為0.68%，顯著低于酸性氨基酸（Asp，Glu）與組氨酸的含量，這與亞鐵離子螯合率較鈣離子螯合率低的結(jié)果相一致。

2.3 金屬離子螯合物抑菌活性

2.3.1 金屬離子螯合物對(duì)枯草芽孢桿菌的抑菌活性

由表1可知，以無(wú)菌水做對(duì)照，水解物對(duì)枯草芽孢桿菌未表現(xiàn)出抑制效果，其抑菌圈直徑小于無(wú)菌水可能由于是水解物無(wú)抑菌活性，但其本身作為營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)又能被細(xì)菌利用助其生長(zhǎng)所致。螯合物中，鈣離子螯合物與無(wú)菌水的抑菌活性沒(méi)有顯著性差異（p＞0.05），說(shuō)明鈣離子螯合物不能抑制枯草芽孢桿菌生長(zhǎng)；以質(zhì)量比為5∶1得到的亞鐵離子螯合物抑菌圈直徑達(dá)13.14mm，抑菌作用明顯；三種亞鐵離子螯合物與無(wú)菌水的抑菌活性均存在顯著性差異（p＜0.05），說(shuō)明三種亞鐵離子螯合物均能夠抑制枯草芽孢桿菌生長(zhǎng)；此外，不同質(zhì)量比得到的三種亞鐵離子螯合物的抑菌活性也有顯著性差異（p＜0.05），隨著質(zhì)量比增大，所得螯合物的抑菌活性下降明顯，其原因可能是樣品中亞鐵離子的含量隨質(zhì)量比增大而減少，故螯合物的抑菌效果反而降低。

表1 螯合物對(duì)枯草芽孢桿菌的抑菌活性Table 1 Antibacterial activity of the chelates against Bacillus subtilis

2.3.2 金屬離子螯合物對(duì)大腸桿菌的抑菌活性 表2中，水解物作為20∶1質(zhì)量比得到螯合物的抑菌實(shí)驗(yàn)對(duì)照組，其抑菌圈直徑與前兩次實(shí)驗(yàn)呈顯著性差異（p＜0.05），這是由于實(shí)驗(yàn)用牛津杯的直徑存在差別而造成的，對(duì)比其與無(wú)菌水的抑菌圈大小可知水解物對(duì)大腸桿菌無(wú)抑制效果。質(zhì)量比為5∶1得到的亞鐵離子螯合物抑菌圈直徑達(dá)12.22mm，抑菌作用明顯，其與10∶1和20∶1質(zhì)量比得到的亞鐵離子螯合物的抑菌活性差異顯著（p＜0.05）。以10∶1和20∶1質(zhì)量比得到的亞鐵離子螯合物與無(wú)菌水的抑菌活性差異顯著（p＜0.05），但這兩種螯合物間的抑菌活性無(wú)顯著差異（p＞0.05），說(shuō)明亞鐵離子與水解物在三種質(zhì)量比下得到的不同螯合物均表現(xiàn)出對(duì)大腸桿菌的抑制活性，但隨著質(zhì)量比增大，所得螯合物的抑菌活性顯著下降。鈣離子螯合物與無(wú)菌水間沒(méi)有顯著性差異（p＞0.05），說(shuō)明其無(wú)抑菌效果。

表2 螯合物對(duì)大腸桿菌的抑菌活性Table 2 Antibacterial activity of the chelates against E.coli

2.3.3 金屬離子螯合物對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌活性 由表3可知，水解物對(duì)金黃色葡萄球菌也未表現(xiàn)出抑制效果，鈣離子螯合物對(duì)金黃色葡萄球菌生長(zhǎng)沒(méi)有抑制作用。以質(zhì)量比為5∶1得到的亞鐵離子螯合物抑菌作用明顯，抑菌圈直徑為13.23mm，其與10∶1和20∶1質(zhì)量比得到的亞鐵離子螯合物的抑菌活性差異顯著（p＜0.05）；以質(zhì)量比10∶1得到的亞鐵離子螯合物有抑菌作用，其與無(wú)菌水的抑菌活性差異顯著（p＜0.05）；而以質(zhì)量比20∶1得到的亞鐵離子螯合物未表現(xiàn)出抑菌活性且三種質(zhì)量比下得到的不同螯合物的抑菌活性有顯著性差異（p＜0.05），表明亞鐵離子螯合物能夠抑制金黃色葡萄球菌生長(zhǎng)，但隨著質(zhì)量比的增大，所得螯合物的抑菌活性顯著下降。

表3 螯合物對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌活性Table 3 Antibacterial activity of the chelates against Staphylococcus aureus

綜上所述，相同的細(xì)菌濃度下，亞鐵離子螯合物較鈣離子螯合物表現(xiàn)出更好的抑菌活性，其中以質(zhì)量比為5∶1得到的亞鐵離子螯合物抑菌效果最好，初步分析可能是由于雖然質(zhì)量比為20∶1得到的螯合物螯合率最高，但其樣品干粉中實(shí)際金屬含量較質(zhì)量比為5∶1得到的螯合物少（1g以20∶1質(zhì)量比得到的亞鐵離子螯合物干粉中金屬含量為0.03g，而5∶1的螯合物中金屬含量為0.07g），因此能與細(xì)菌細(xì)胞膜上各親疏水基團(tuán)結(jié)合而造成其細(xì)胞膜損傷或代謝紊亂的金屬離子數(shù)量降低，抑菌活性隨螯合率上升反而下降。該螯合物對(duì)三種指示菌的抑制活性也有差異，對(duì)枯草芽孢桿菌及金黃色葡萄球菌的抑菌圈分別為13.14mm及13.23mm，高于大腸桿菌的12.22mm，而其中前兩者為革蘭氏陽(yáng)性菌，后者為革蘭氏陰性菌，說(shuō)明該螯合物對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌的抑制效果可能要好于革蘭氏陰性菌。另外，對(duì)照無(wú)菌水可見(jiàn)該水解物的水溶液對(duì)三種指示菌未表現(xiàn)出抑菌活性，但在與亞鐵離子螯合后抑菌活性有所提高，說(shuō)明羅非魚(yú)肉蛋白水解在與某些金屬離子螯合后能夠增強(qiáng)其抑菌活性。

3 結(jié)論

羅非魚(yú)肉蛋白水解物與鈣、亞鐵離子螯合的螯合率隨著水解物與金屬鹽質(zhì)量比的升高而逐漸增大，最高可達(dá)71.88%。對(duì)酶解產(chǎn)物的氨基酸分析表明該水解物中具有金屬螯合活性的氨基酸占總氨基酸的34.59%，含量較高，這與螯合率較高的結(jié)果一致。比較此水解物與鈣離子和鐵離子的螯合物對(duì)相同濃度的指示菌的抑制效果，發(fā)現(xiàn)該蛋白水解物與亞鐵離子在特定條件下得到的螯合物對(duì)枯草芽孢桿菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌的生長(zhǎng)有明顯的抑制作用，不同螯合物間抑菌活性存在差異，其中以質(zhì)量比為5∶1得到的亞鐵離子螯合物抑菌活性最高，對(duì)三種指示菌的生長(zhǎng)都表現(xiàn)出一定的抑制效果，其原因可能是該質(zhì)量比下制得的螯合物中金屬離子含量最高，因此更易造成細(xì)菌細(xì)胞損傷或代謝紊亂。

金屬離子螯合物作為一種新型金屬元素補(bǔ)充劑是時(shí)下的研究熱點(diǎn)，而以一些具有特殊生物活性的蛋白水解物與金屬離子進(jìn)行螯合，則既可以達(dá)到補(bǔ)充金屬元素的效果，同時(shí)利用蛋白水解物的功能特性可使螯合產(chǎn)物成為一種天然無(wú)副作用的添加劑，應(yīng)用于食品，飲料，藥品，化妝品等領(lǐng)域，大大增加了螯合物的用途和價(jià)值。在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中，期望摸索新的水解工藝以得到具有更高抑菌活性的蛋白水解物，優(yōu)化螯合工藝以制備抑菌效果更好的螯合物，并探索螯合物結(jié)構(gòu)與其抑菌活性間的關(guān)系。

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Antibacterial activity of tilapia protein hydrolysates chelated with metal ions

WANG Zi-huai1，2，HU Xiao1，3，LI Lai-hao1，*，YANG Xian-qing1，HAO Shu-xian1，WU Yan-yan1，CHEN Sheng-jun1，CENG Jian-wei1
（1.South China Sea Fisheries Research Institute，Chinese Academy of Fishery Sciences，Key Laboratory of Aquatic Product Processing，Ministry of Agriculture，National R&D Center for Aquatic Product Processing，Guangzhou 510300，China；2.College of Food Science and Technology，Shanghai Ocean University，Shanghai 201306，China；3.South China Sea Institute of Oceanology，Chinese Academy of Sciences，Guangzhou 510301，China）

Tilapia meat protein was hydrolyzed by papain and then the hydrolysates were chelated with CaCl2and FeCl2at the mass ratio（hydrolysate：mineral salt）of 5∶1，10∶1 and 20∶1，respectively.The antibacterial activity of the chelates was investigated.The result showed that the chelation rates were gradually increased with the increasing of the mass ratio.Amino acids analysis indicated that tilapia meat protein-hydrolysates had high content of chelating amino acids which accounted for 34.59%of total amino acid.Finally，antibacterial test showed that some chelates obtained under the certain conditions had significant antibacterial activity against Bacillus subtilis，Escherichia coli，and Staphylococcus aureus.The hydrolysate-ferrous ion chelate，which was obtained under the mass ratio of 5∶1，had the highest antibacterial activity against the three indicator bacterium.

tilapia protein hydrolysates；metal ion chelating；antibacterial activity

TS201.2

A

1002-0306（2014）08-0079-05

10.13386/j.issn1002-0306.2014.08.008

2013－06－17 *通訊聯(lián)系人

王子懷（1988-），男，碩士研究生，研究方向：食品科學(xué)與工程。

國(guó)家自然科學(xué)基金（31301454）；“十二五”國(guó)家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目（2012BAD28B06）；國(guó)家農(nóng)業(yè)科技成果轉(zhuǎn)化資金項(xiàng)目（2010GB23260577，2010GB2E000335）；國(guó)家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系（CARS-49）；廣東省科技計(jì)劃重點(diǎn)項(xiàng)目（2011A020102005）；廣東省海洋漁業(yè)科技推廣專(zhuān)項(xiàng)（A201101C01）；中央級(jí)公益性科研院所基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專(zhuān)項(xiàng)資金項(xiàng)目（2011TS01）。