養(yǎng)陰活血方藥對糖尿病大鼠肝臟的氧化應(yīng)激水平及病理改變的影響

楊曉暉 李淑貞 宋翠榮 崔茂香 梁金環(huán)

1.滄州醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校科研處，河北滄州061001；2.滄州醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)?；A(chǔ)部，河北滄州061001；3.滄州醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)?？谇幌?，河北滄州061001

養(yǎng)陰活血方藥對糖尿病大鼠肝臟的氧化應(yīng)激水平及病理改變的影響

楊曉暉1李淑貞2宋翠榮3崔茂香2梁金環(huán)2

1.滄州醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)?？蒲刑?，河北滄州061001；2.滄州醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)?；A(chǔ)部，河北滄州061001；3.滄州醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)?？谇幌?，河北滄州061001

目的探討?zhàn)B陰活血方藥對糖尿病大鼠肝臟氧化應(yīng)激水平及病理改變的影響。方法采用腹腔注射鏈脲佐菌素（STZ）造糖尿病大鼠模型，挑選造模成功的大鼠，隨機(jī)分為四組：糖尿病模型組；中藥6周組，中藥8周組，中藥10周組，另外隨機(jī)選出8只作為正常對照組，造模成功后分別于6、8、10周取材，測定肝組織氧化指標(biāo)并進(jìn)行病理觀察。結(jié)果與正常對照組比較，糖尿病模型組的丙二醛（MDA）的含量明顯增加（P＜0.01），超氧化物歧化酶（SOD）活性、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）活性明顯降低（P＜0.01）。與糖尿病模型組相比，中藥干預(yù)組各階段MDA的含量明顯減少（P＜0.05或P＜0.01），中藥8周組和中藥10周組SOD活性和GSH-Px活性均有顯著升高（P＜0.05或P＜0.01），中藥6周組雖有升高SOD活性和GSH-Px活性的趨勢，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。病理學(xué)觀察，模型組肝細(xì)胞索及肝小葉結(jié)構(gòu)紊亂，炎癥細(xì)胞增多，說明肝組織有損傷。與模型組比較，中藥干預(yù)組各階段形態(tài)學(xué)改變均有改善。結(jié)論養(yǎng)陰活血方藥具有一定的抗氧化能力，抑制氧化應(yīng)激，對糖尿病大鼠肝臟具有一定的保護(hù)作用。

糖尿??；大鼠；肝臟；氧化應(yīng)激；養(yǎng)陰活血方藥

糖尿病是常見的內(nèi)分泌代謝疾病之一，發(fā)病率逐年增加，嚴(yán)重威脅人類的健康。糖尿病肝臟性疾病是糖尿病并發(fā)癥之一。有資料表明糖尿病2型患者非酒精性脂肪肝、肝纖維化、肝硬化的風(fēng)險增加[1]；2型糖尿病罹患癌癥風(fēng)險增加，對糖尿病患者的處置中應(yīng)該附加癌癥篩查[2]。糖尿病肝病的病因及發(fā)病機(jī)制仍未完全明了，許多研究者認(rèn)為，除遺傳、環(huán)境和自身免疫等因素外，氧化應(yīng)激可能也與其發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)歸有密切關(guān)系[3-4]，而且目前中藥防治糖尿病肝臟性疾病的研究較少，本研究建立糖尿病大鼠模型，采用養(yǎng)陰活血方藥進(jìn)行治療，觀察糖尿病對大鼠肝臟氧化應(yīng)激的損傷作用以及在不同時期養(yǎng)陰活血方藥的治療效果，探討其保護(hù)肝臟的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動物、試劑及儀器

4個月齡健康雄性SD大鼠，清潔級，體重為250～300 g，購自河北省實驗動物中心（動物合格證編號：809091）。鏈脲佐菌素（STZ，Sigma公司），丙二醛測定試劑盒、超氧化物歧化酶測定試劑盒和谷胱甘肽過氧化物酶測定試劑盒均購自南京建成生物工程研究所，其余試劑均為國產(chǎn)分析純。血糖檢測儀（購于強(qiáng)生公司），7200型可見分光光度計（上海尤尼柯公司），德國萊卡熒光倒置顯微鏡。

1.2 中藥配方

養(yǎng)陰活血方藥組成：熟地20 g、山藥15 g、牡丹皮20 g、山茱萸10 g等六味中藥。

1.3 方法

1.3.1 動物模型建立及分組處理，SD大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，隨機(jī)選出8只作為正常對照組，其他大鼠禁食不禁水12 h，稱質(zhì)量，腹腔注射STZ造糖尿病模型，72 h后測空腹血糖（FPG），以連續(xù)3 d的FPG≥11.1mmol/L，并且有多食、多飲，多尿癥狀者，為模型成功標(biāo)準(zhǔn)。挑選造模成功的大鼠，隨機(jī)分為四組，每組各8只，包括：糖尿病模型組；中藥6周組，中藥8周組，中藥10周組。各組正常飼料喂養(yǎng)，對照組和糖尿病模型組自由飲水，中藥干預(yù)組按人與動物間體表面積折算的等效劑量比值灌喂給藥。造模成功后分別于6、8、10周取材，用10%水合氯醛麻醉大鼠，股動脈放血，并取肝臟，部分固定，其余放入液氮，-70℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 氧化應(yīng)激指標(biāo)測定，取肝組織1 g左右，稱重，加入9倍體積勻漿介質(zhì)，于冰浴中制備10%組織勻漿，4℃3500 r/min離心10 min，取上清。用化學(xué)比色法測定肝勻漿丙二醛（MDA）含量、超氧化物歧化酶（SOD）活性和谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）活性，嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。

1.3.3 病理觀察取適量肝組織，切成2～3 mm厚的薄片，用4%多聚甲醛固定，24 h后酒精梯度脫水、透明，浸蠟，常規(guī)石蠟包埋，制備切片，去蠟后進(jìn)行HE染色，在顯微鏡下觀察肝組織形態(tài)學(xué)變化并拍片。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，組間比較用單因素方差分析，兩獨(dú)立樣本的計量資料采用t檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠肝組織氧化指標(biāo)變化

與正常對照組比較，糖尿病模型組的MDA的含量明顯增加（P＜0.01），SOD活性、GSH-Px活性明顯降低（P＜0.01）。與糖尿病模型組相比，中藥干預(yù)組各階段MDA的含量明顯減少（P＜0.05或P＜0.01），中藥8周組和中藥10周組SOD活性和GSH-Px活性均有顯著升高（P＜0.05或P＜0.01），中藥6周組雖有升高SOD活性和GSH-Px活性的趨勢，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。與中藥6周組比較，中藥8周組和中藥10周組MDA的含量明顯減少（P＜0.05），SOD活性均有顯著升高（P＜0.05），中藥10周組GSH-Px活性顯著升高（P＜0.01），與中藥8周組比較，中藥10周組MDA的含量減少，SOD活性升高，但差異無統(tǒng)計學(xué)也意義（P＞0.05），中藥10周組GSH-Px活性顯著升高（P＜0.01）。見表1。

表1 各組大鼠肝組織氧化指標(biāo)變化（±s，n=8）

表1 各組大鼠肝組織氧化指標(biāo)變化（±s，n=8）

注：與正常對照組比較，▲P＜0.01；與糖尿病模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與中藥6周組比較，ΔP＜0.05，ΔΔP＜0.01；與中藥10周組比較，#P＜0.01；MDA：丙二醛；SOD：超氧化物歧化酶；GSH-Px：谷胱甘肽過氧化物酶

組別MDA（nmol/mgprot）SOD（U/mgprot）GSH-Px（U/mgprot）正常對照組糖尿病模型組中藥6周組中藥8周組中藥10周組0.43±0.07 0.61±0.09▲0.51±0.01*0.47±0.04**Δ0.45±0.06**Δ196.56±27.70 132.46±13.46▲146.50±10.92 155.89±18.81*Δ165.58±12.76**Δ298.22±33.70 194.86±20.79▲210.60±16.96 224.56±13.17*#246.60±10.23**ΔΔ

2.2 大鼠肝組織形態(tài)學(xué)變化

正常對照組肝小葉結(jié)構(gòu)清晰，肝細(xì)胞索和肝竇排列規(guī)則；糖尿病模型組肝細(xì)胞索及肝小葉結(jié)構(gòu)紊亂，炎癥細(xì)胞增多，說明肝組織有損傷。與糖尿病模型組比較，中藥干預(yù)組各階段形態(tài)學(xué)改變均有改善。見圖1。

3 討論

糖尿病可造成糖脂代謝紊亂，肝臟作為糖脂代謝重要的靶器官，糖尿病狀態(tài)下可產(chǎn)生脂肪肝、肝纖維化、肝硬化等肝臟疾病，其機(jī)制可能與氧化應(yīng)激有關(guān)[5]。氧化應(yīng)激是指機(jī)體組織或細(xì)胞內(nèi)氧自由基生成增加和（或）消除能力降低，導(dǎo)致活性氧（ROS）家族在機(jī)體內(nèi)或細(xì)胞內(nèi)蓄積而引起的氧化損傷。肝臟是外源性過氧化物在體內(nèi)轉(zhuǎn)化和排泄的主要場所，當(dāng)肝臟內(nèi)促氧化物和抗氧化物之間的動態(tài)平衡嚴(yán)重失調(diào)時，即可導(dǎo)致氧化應(yīng)激，產(chǎn)生大量自由基，后者可導(dǎo)致肝細(xì)胞大小膜泡的形成；膜通透性、流動性喪失；DNA損傷及誘發(fā)細(xì)胞凋亡，造成肝損傷[6]。同時氧自由基也可以促進(jìn)肝星狀細(xì)胞的增殖和膠原的合成，促進(jìn)肝纖維化形成[7]。

研究表明，2型糖尿病患者遭受著長期的氧化應(yīng)激，氧化應(yīng)激是糖尿病合并癥的一種致病因子[8]。

目前MDA的含量（組織中脂質(zhì)過氧化程度的一項指標(biāo)）和SOD、GSH-Px活性（體內(nèi)抗氧化防御體系中消除ROS的重要抗氧酶）常被用作反映組織細(xì)胞氧化應(yīng)激的指標(biāo)。MDA是反映脂質(zhì)過氧化程度的指標(biāo)，也間接反映了機(jī)體細(xì)胞受自由基攻擊的程度[9]。SOD是抗氧化體系中最為關(guān)鍵的酶，機(jī)體對氧自由基的滅活主要由SOD完成，測定其活力可間接反映氧自由基產(chǎn)生的情況[10]。超氧陰離子（O2-）由SOD催化O2-轉(zhuǎn)化為過氧化氫（H2O2），H2O2可由GSH-Px催化生成水的同時，氧化還原型的谷胱甘肽，GSH-Px也可以清除MDA。本實驗中，糖尿病模型組大鼠肝組織的MDA的含量明顯增加，SOD活性、GSH-Px活性明顯降低，說明機(jī)體氧化應(yīng)激水平增高，導(dǎo)致肝損傷，研究表明，MDA可激活NADPH氧化酶產(chǎn)生更多的ROS，進(jìn)一步損傷肝細(xì)胞[11]。HE染色顯示模型組肝細(xì)胞索及肝小葉結(jié)構(gòu)紊亂，炎癥細(xì)胞增多，也說明肝組織有損傷。

圖1 大鼠肝組織形態(tài)學(xué)變化（HE，200×）

糖尿病屬于中醫(yī)學(xué)中“消渴”兼“脅痛”等范疇，有資料表明，中藥可以治療糖尿病并發(fā)癥[12]，而且中藥還可以緩解糖尿病大鼠的氧化應(yīng)激，增強(qiáng)機(jī)體抗氧化能力[13-14]，中藥治療糖尿病大鼠，可以使SOD的活性及谷胱甘肽含量顯著增加；活性氧族ROS、MDA等降低[15]，還可以增加GSH-Px和過氧化氫酶（CAT）的活性[16]。本實驗所用養(yǎng)陰活血方藥是經(jīng)多年研究和臨床試驗的核心方劑[17]，由熟地、山藥、牡丹皮、山茱萸等六味中藥組成。該方藥不僅具有降糖作用，而且牡丹皮、熟地、山藥、山茱萸中的某些成分如多糖類、丹皮酚、環(huán)烯醚萜總苷等又具有一定的抗氧化作用。實驗結(jié)果表明各階段養(yǎng)陰活血方藥均可不同程度地提高糖尿病大鼠肝組織SOD活性和GSH-Px活性，減少M(fèi)DA的含量，中藥6周組雖有升高SOD活性和GSH-Px活性的趨勢，但沒有統(tǒng)計學(xué)差異，說明該階段效果較差，隨著治療進(jìn)程，中藥8周組已經(jīng)有顯著的效果，中藥10周組效果最為明顯，說明相對來說治療時間長一些效果較好。HE染色顯示中藥干預(yù)組各階段形態(tài)學(xué)改變均有改善，同樣是中藥干預(yù)10周后效果最佳。

綜上所述，該方藥可減少自由基產(chǎn)生，抑制氧化應(yīng)激，對糖尿病大鼠肝臟具有一定的保護(hù)作用，隨著治療進(jìn)程，效果越來越好，其在糖尿病的臨床治療中可進(jìn)一步推廣。

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Effects of Nourishing Yin and Promoting Blood Flow Recipe on oxidative stress level and pathologic changes in diabetic rat liver

YANG Xiaohui1LIShuzhen2SONG Cuirong3CUIMaoxiang2LIANG Jinhuan2
1.Scientific Research Department,Cangzhou Medical College,Hebei Province,Cangzhou 061001,China;2.Foundation Department,Cangzhou Medical College,Hebei Province,Cangzhou 061001,China;3.Cavitas Oris Department, Cangzhou Medical College,Hebei Province,Cangzhou 061001,China

Objective To discuss the effects of Nourishing Yin and Promoting Blood Flow Recipe on oxidative stress level and pathologic changes in diabetic rat liver.M ethods Diabetic ratswere induced by intraperitoneal streptozotocin (STZ)injection.Successfully-established model rats were selected and randomly divided into four groups:diabetic group,traditional Chinesemedicine(TCM)six-week intervention group,TCM eight-week intervention group,TCM tenweek intervention group.In addition,eight normal rats were randomly chosen as normal control group.Rat livers were extracted respectively after six weeks,eightweeks and ten weeks to determine oxidation index and undertake pathologic observation.Results Compared with normal control group,contents ofmalonaldehyde(MDA)in rat livers of diabetic group rose significantly(P＜0.01),activities of superoxide dismutase(SOD)and glutathione peroxidase(GSH-Px)were notably lower than those of normal control group(P＜0.01);compared with diabetic group,contents of MDA in rat livers of TCM intervention group in each period decreased strikingly(P＜0.05 or P＜0.01),activitiesof SOD and GSH-Px in TCM eight-week intervention group and TRC ten-week intervention group increased significantly(P＜0.05 or P＜0.01). Rising tendency was shown from activities of SOD and GSH-Px in TCM six-week intervention group,but there was no statistics difference(P＞0.05).By pathology observation,liver cell cords and hepatic lobules structure of diabetic group were chaotic,with inflammatory cells increasing,which indicated that there were injuries in hepatic tissue.Compared with diabetic group,morphology changeswere improved in every phase of TCM intervention group.Conclusion Certain anti-oxidative capability was shown to restrain oxidative stress in Nourishing Yin and Promoting Blood Flow Recipe,which has some protection to diabetic rat liver.

Diabetes;Rat;Liver;Oxidative stress; Nourishing Yin and Promoting Blood Flow Recipe

R587.2

A

1673-7210（2014）08（b）-0039-04

2014-04-23本文編輯：張瑜杰）

河北省滄州市科學(xué)技術(shù)研究與發(fā)展指導(dǎo)計劃項目（編號08ZD240）。

楊曉暉（1975-），碩士；研究方向：細(xì)胞生物學(xué)、醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)教學(xué)及研究。