導(dǎo)數(shù)紫外光譜法測定人血漿中三唑侖的血藥濃度

周波林

廣西醫(yī)科大學(xué)第九附屬醫(yī)院廣西壯族自治區(qū)北海市人民醫(yī)院藥劑科，廣西北海536000

導(dǎo)數(shù)紫外光譜法測定人血漿中三唑侖的血藥濃度

周波林

廣西醫(yī)科大學(xué)第九附屬醫(yī)院廣西壯族自治區(qū)北海市人民醫(yī)院藥劑科，廣西北海536000

目的建立測定人血漿中三唑侖濃度的一階導(dǎo)數(shù)分光光度法，為臨床應(yīng)用提供技術(shù)參考。方法采用一階導(dǎo)數(shù)光譜法在232.0 nm波長處測定人血漿中三唑侖濃度。結(jié)果三唑侖在2.55～15.30μg/mL范圍呈良好線性關(guān)系；其回歸方程為D=1.3487×10-3C+3.7748×10-3（r=0.9965）；平均回收率為101.53%，RSD=2.12%（n=5）。結(jié)論該法操作簡單，測定結(jié)果準(zhǔn)確，適用于三唑侖血藥濃度的監(jiān)測。

三唑侖；血藥濃度；一階導(dǎo)數(shù)光譜法；治療藥物監(jiān)測

三唑侖（Triazolam）又稱甲基三唑氯安定、海爾神，為短效的二氮類鎮(zhèn)靜催眠藥，三唑侖誘導(dǎo)睡眠的特點(diǎn)是縮短入睡時(shí)間、延遲快速動(dòng)眼睡眠的開始，但不減少其所占睡眠的總比率，可減少第四期睡眠，增加總的睡眠時(shí)間、減少夜間覺醒的次數(shù)，因此，是失眠患者較理想的藥物[1]。本藥口服起效快，但是藥物過量可出現(xiàn)持續(xù)的精神錯(cuò)亂、嚴(yán)重嗜睡、語言模糊、蹣跚、心率減慢、呼吸短促或困難、嚴(yán)重乏力等。三唑侖沒有特效的拮抗藥，遇到過量或中毒，宜及早進(jìn)行對癥處理，因此，因此監(jiān)測其血藥濃度對臨床治療和中毒搶救均有重要意義[2]。

目前，對三唑侖血藥濃度檢測的研究報(bào)道多為高效液相色譜法[3-5]，紫外導(dǎo)數(shù)光譜法檢測三唑侖血藥濃度未見報(bào)道，本文建立了簡便、快速、準(zhǔn)確地測定血漿中三唑侖濃度的新方法—紫外導(dǎo)數(shù)光譜法，為三唑侖的血藥濃度監(jiān)測與藥動(dòng)學(xué)研究提供了新的分析手段。

1 儀器與試藥

儀器MV-1201型雙光束紫外可見分光光度計(jì)（北京瑞利分析儀器公司），BP-21lD型電子天平（德國SARTORIMS公司），超聲波發(fā)生器（上海SBS2200）；三唑侖化學(xué)對照品（中國藥品生物制品檢定所提供）；水為超純水；甲醇（化學(xué)純）；純化水由廣西醫(yī)科大學(xué)第九附屬醫(yī)院（以下簡稱“我院”）檢驗(yàn)科提供；血漿由我院輸血科提供。

2 方法與結(jié)果

2.1 測定條件及吸收光譜的選擇

2.1.1 溶液的制備

2.1.1.1 血漿樣品溶液的制備將三唑侖對照品適量在105℃下干燥至恒重，精密稱取10.20mg，置于100mL容量瓶中，加入甲醇適量，振蕩2～3 min，加甲醇試劑至刻度，制得三唑侖貯備溶液。精密量取三唑侖貯備溶液1 mL，置于10 mL量瓶中，用空白血漿（陰性對照液）稀釋至刻度，即得（含三唑侖約10.20μg/mL）。

2.1.1.2 三唑侖對照品溶液將三唑侖對照品適量在105℃下干燥至恒重，精密稱取10.20mg，置于100mL容量瓶中，加入甲醇適量，振蕩2～3 min，加甲醇試劑至刻度，制得三唑侖貯備溶液，備用。精密量取三唑侖標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液適量，制備三唑侖對照品溶液（濃度：10.20μg/m L）。

2.1.1.3 陰性對照液精密吸取空白血漿適量，加入3倍量甲醇沉淀蛋白，振蕩3min，12 000 r/min離心10min，取上清液備用。

2.1.2 零階紫外掃描光譜

分別將血漿樣品溶液（a液，含三唑侖約10.20μg/mL），三唑侖對照品溶液（b液，濃度：10.20μg/mL）、陰性對照液（c液，空白血漿），進(jìn)行紫外光譜掃描，波長范圍為190～400 nm。光譜掃描條件：光度模式為Abs，掃描模式為單一，掃描速度為快速，光譜帶寬為2 nm，采樣間隔為0.1 nm。圖1結(jié)果顯示，三唑侖與空白血漿之間的紫外吸收相互影響，干擾較大，利用紫外分光光度法無法直接測定血漿中三唑侖的含量。

圖1 各溶液的零階紫外光譜

2.1.3 一階導(dǎo)數(shù)光譜及測定波長的選擇

取上述a、b、c溶液，進(jìn)行紫外光譜掃描，波長范圍為190～400 nm。對掃描后的紫外光譜進(jìn)行導(dǎo)數(shù)微積分轉(zhuǎn)換，分別得到3種溶液的一階導(dǎo)數(shù)光譜。掃描條件同“2.1.2”項(xiàng)下，微分波長差為10；縮放系數(shù)為1。由圖2可見：血漿樣品溶液（a液）在232.0 nm波長處的谷-零振幅圖譜與三唑侖對照品溶液（b液）相一致，而空白血漿（c液）在此波長處的谷-零振幅值為0，因此，測定三唑侖血藥濃度的檢測波長可以定為232.0 nm。

2.2 線性關(guān)系考察

精密吸取三唑侖標(biāo)準(zhǔn)貯備液0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mL，分別置于10 mL容量瓶中，加入甲醇稀釋至刻度，制成濃度（C）為2.55～15.30μg/mL的系列工作液，以甲醇為空白，在232.0 nm波長處測定其一階導(dǎo)數(shù)光譜的振幅值D，以濃度C對D進(jìn)行線性回歸，得回歸方程：D=1.3487×10-3C+3.7748×10-3（r=0.9965）。表明三唑侖在2.55～15.30μg/mL濃度范圍內(nèi)，其一階導(dǎo)數(shù)振幅值D與濃度C呈良好線性關(guān)系[6]。

2.3 回收率試驗(yàn)

5) 微信平臺(tái)的開發(fā)依賴于微信的接口，經(jīng)過適配，訂閱號(hào)和服務(wù)號(hào)的開發(fā)可共用RN Bridge的Web頁面。

精密吸取按“2.1.1.3”項(xiàng)下制備的陰性對照液5mL，分別精密加入濃度為10.20μg/mL的三唑侖5、10、15、20、25 mL，混勻，按照“2.2”項(xiàng)下測定D值，以D值代入回歸方程計(jì)算含量，結(jié)果見表1。

2.4 精密度試驗(yàn)

取三唑侖對照品液適量，在波長232.0 nm處重復(fù)測定三唑侖一階導(dǎo)數(shù)光譜的谷-零振幅D值，D值為0.0178、0.0171、0.0175、0.0183、0.0172，RSD為2.77%（n=5）。

2.5 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取血漿樣品溶液按“2.1.1.1”項(xiàng)下配制后室溫放置0、1、2、4、6 h后，分別于波長232.0 nm處測定谷-零振幅D值，D值為0.0216、0.0219、0.0208、0.0210、0.0221，RSD為2.67%（n=5），說明在6 h內(nèi)血漿樣品穩(wěn)定性較好，對檢測結(jié)果沒有產(chǎn)生不良影響。

2.6 重復(fù)性試驗(yàn)

取相同濃度血漿樣品5份，按“2.2”項(xiàng)下測定谷-零振幅D值，以D值代入回歸方程計(jì)算含量，分別為13.44、13.22、12.62、13.59、13.29，各樣品中三唑侖含量的平均值分別為13.23μg/mL，RSD分別為2.62%（n=5）。

圖2 各溶液的一階導(dǎo)數(shù)光譜圖

表1 三唑侖樣品回收率試驗(yàn)結(jié)果（n=5）

3 討論

三唑侖治療口服吸收快，沒有特效的拮抗藥，而且藥物中毒的發(fā)生和嚴(yán)重的程度與血藥濃度呈正相關(guān)，因此，檢測其血藥濃度對臨床治療和中毒搶救均有重要意義。為了確保藥物治療的安全、有效，必須建立一種簡單、靈敏、準(zhǔn)確的三唑侖血藥濃度測定方法。

3.1 檢測方法的選擇

紫外吸收光譜是由價(jià)電子的躍遷而產(chǎn)生的，由，因此會(huì)選擇性地吸收不同波長的光，這樣就會(huì)產(chǎn)生吸收光譜的差異。因此物質(zhì)的分子或離子產(chǎn)生的紫外光譜及吸收程度可以對物質(zhì)的組成、含量和結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析、測定、推斷。紫外導(dǎo)數(shù)光譜是利用不同物質(zhì)紫外吸收不同的原理，通過對紫外光譜進(jìn)行微積分求導(dǎo)，達(dá)到清除物質(zhì)相互干擾的目的，能夠?qū)旌衔锖蛷?fù)雜組分直接進(jìn)行檢測。目前，新型的紫外分光光度計(jì)均可利用紫外-可見分光光度計(jì)軟件系統(tǒng)帶有的數(shù)學(xué)處理功能，對吸收光譜進(jìn)行處理，可以獲得導(dǎo)數(shù)光譜。通?？梢垣@得1～4階導(dǎo)數(shù)光譜，在各階導(dǎo)數(shù)光譜中，吸光度對波長的微分值與溶液中組分的濃度C保持線性關(guān)系：∝C，其中s為導(dǎo)數(shù)的階數(shù)，通過電子學(xué)獲得模擬導(dǎo)數(shù)光譜圖，使其應(yīng)用更加簡化、普遍化[7]。

3.2 測定波長的選擇

本實(shí)驗(yàn)在選定波長時(shí)，對所檢測的溶液在200～400 nm范圍內(nèi)進(jìn)行光譜掃描，可以觀察到，空白血漿與三唑侖之間的紫外吸收有重疊，干擾較大，利用紫外分光光度法無法直接測定血漿中三唑侖的含量。通過導(dǎo)數(shù)光譜筆者發(fā)現(xiàn)血漿樣品溶液（a液）在232.0 nm波長處的谷-零振幅圖譜與三唑侖對照品溶液（b液）的相一致，而空白血漿（c液）在此波長處的谷-零振幅值為0，因此，測定三唑侖血藥濃度的檢測波長可以定為232.0 nm。

3.3 血漿蛋白沉淀劑的選擇

本文在參考現(xiàn)有文獻(xiàn)報(bào)道[8-10]的基礎(chǔ)上，結(jié)合本單位現(xiàn)有設(shè)備條件，優(yōu)化了血樣處理方法：以甲醇代替乙腈，試劑價(jià)格相對低廉；以3倍血樣量的甲醇為蛋白沉淀劑，輔以較高轉(zhuǎn)速離心的方法處理血樣，蛋白沉淀效果好，提取回收率高，適合紫外導(dǎo)數(shù)光譜測定三唑侖血藥濃度時(shí)使用。

3.4 方法學(xué)研究

線性化范圍試驗(yàn)也叫標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制，實(shí)際是在給定的范圍內(nèi)獲取與樣品中供試物濃度成正比的試驗(yàn)結(jié)果的能力，也就是供試物濃度（或質(zhì)量）的變化與試驗(yàn)結(jié)果（或測得的響應(yīng)信號(hào)）呈線性關(guān)系。通常，線性是用最小二乘法處理數(shù)據(jù)求得回歸曲線來表示，回歸曲線的相關(guān)系數(shù)越接近1.00，表明越呈線性。

本實(shí)驗(yàn)利用6個(gè)濃度點(diǎn)，制訂了線性方程[11]：D=1.3487×10-3C+3.7748×10-3，相關(guān)系數(shù)為0.9965，這表明表明三唑侖在2.55～15.30μg/mL濃度范圍內(nèi)，其紫外導(dǎo)數(shù)光譜振幅值D與濃度C呈良好線性關(guān)系，該回歸方程可用于紫外導(dǎo)數(shù)光譜測定三唑侖血藥濃度。

回收率實(shí)驗(yàn)也叫加樣回收率試驗(yàn)，是衡量誤差或準(zhǔn)確度的一種方法。是向試樣中加入已知量的被測成分，然后進(jìn)行對照試驗(yàn)，觀察加入的被測組分能否定量回收，以此判斷分析過程是否存在系統(tǒng)誤差，加樣回收率一般要求在95%～105%之間為宜[12]，本實(shí)驗(yàn)平均回收率是101.53%，符合實(shí)驗(yàn)要求。

精密度是指用相同方法對同一試樣進(jìn)行多次測定，各測量值彼此接近的程度。精密度的用標(biāo)準(zhǔn)偏差（S）和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD%）來表示[13]，本實(shí)驗(yàn)精密度的RSD為2.77%（n=5），符合實(shí)驗(yàn)要求。

重復(fù)性實(shí)驗(yàn)是指在同一實(shí)驗(yàn)室，由同一個(gè)操作者使用相同的設(shè)備，按相同的試驗(yàn)方法，在短時(shí)間內(nèi)對同一試樣（或元件）相互獨(dú)立進(jìn)行的試驗(yàn)結(jié)果間的一致性[14]。本實(shí)驗(yàn)精密度的RSD分別為2.62%（n=5），符合實(shí)驗(yàn)要求。

本實(shí)驗(yàn)建立的方法，樣品處理簡單，操作方便，8 min左右即可完成一個(gè)樣品的分析，分析成本低。吸收峰與血漿藥物濃度之間的線性關(guān)系良好，專屬性強(qiáng)，精密度和準(zhǔn)確度高，穩(wěn)定可靠，為三唑侖的藥代動(dòng)力學(xué)研究提供了可靠的分析方法，對開展三唑侖藥代動(dòng)力學(xué)研究及治療藥物濃度監(jiān)測著重要意義，可供藥代動(dòng)力學(xué)研究及臨床血藥濃度檢測使用。

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Determ ination of Triazolam in human plasma by derivative spectrophotometry

ZHOU Bolin
Department of Pharmacy,the Ninth Affiliated Hospital of Guangxi Medical University Beihai People's Hospital, Guangxi Zhuang Autonomous Region,Beihai 536000,China

Ob jective To develop first order derivative spectrophotometry for the determination of Triazolam concentration in human plasma to provide the technical reference for its clinical application.Methods The first order derivative spectrophotometry was performed at the wavelength of 232.0 nm.Results Triazolam showed a good linear relationship within a ranger of 2.55-15.30μg/mL,the regression equation was D=1.3487×10-3C+3.7748×10-3(r=0.9965);the average recovery was 101.53%,RSD=2.12%(n=5).Conclusion Thismethod is simple to operate and accurate in the detection results,and can be applied in the analysisof Triazolam in human plasma.

Triazolam;Plasma drug concentration;First order derivative spectrophotometry;Therapeutic drug monitoring

R927.2

A

1673-7210（2014）08（b）-0022-04

2014-04-25本文編輯：衛(wèi)軻）

廣西壯族自治區(qū)北海市科學(xué)研究與技術(shù)開發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目（編號(hào)：北科合201047029）。

周波林（1973.7-），男，廣西北海人，副主任藥師；研究方向：臨床藥學(xué)。