小鼠皮膚移植中雷公藤內(nèi)酯醇的免疫抑制作用及機(jī)制研究

梁 闊 劉 爽 崔葉青 孫海晨 羅 斌 萬歲桂 孫雪靜 李 非▲

1.首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院普通外科，北京100053；2.首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院血液科，北京100053

小鼠皮膚移植中雷公藤內(nèi)酯醇的免疫抑制作用及機(jī)制研究

梁 闊1劉 爽1崔葉青1孫海晨1羅 斌1萬歲桂2孫雪靜2李 非1▲

1.首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院普通外科，北京100053；2.首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院血液科，北京100053

目的探討雷公藤內(nèi)酯醇（Triptolide，Tri）在小鼠同種異體皮膚移植中的免疫抑制作用及其可能的作用機(jī)制。方法采用BALB/c小鼠作為供體，C57BL/6小鼠作為受體，建立皮膚移植模型。隨機(jī)分為3組，每組8只。移植術(shù)后前6天（0～5 d）分別予腹腔注射1%吐溫80溶劑（對照組）、Tri 100μg/kg（L-Tri組）和Tri 200μg/kg（H-Tri組）。術(shù)后觀察移植皮片存活情況。并于術(shù)后第7天每組隨機(jī)選取3只，切取脾臟以流式細(xì)胞術(shù)檢測脾淋巴細(xì)胞中CD4+CD25+Foxp3+T細(xì)胞比例。結(jié)果對照組、L-Tri組和H-Tri組移植皮片平均存活時間分別為（8.3±1.2）、（12.4±1.9）、（14.9±2.2）d；脾淋巴細(xì)胞中CD4+CD25+Foxp3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞比例分別為（5.6±0.8）%、（12.6±1.5）%和（16.1±2.1）%；L-Tri組及H-Tri組與對照組比較，H-Tri組與L-Tri組比較，小鼠移植皮膚平均存活時間均明顯延長（P＜0.05），CD4+CD25+Foxp3+T細(xì)胞數(shù)量也明顯增加（P＜0.05）。結(jié)論Tri能夠抑制移植后排斥反應(yīng)，延長小鼠同種異體皮膚移植的存活時間，其免疫作用機(jī)制可能與上調(diào)移植受體CD4+CD25+Foxp3+T細(xì)胞的比例有關(guān)，并且其免疫抑制作用具有一定的劑量依賴性。

皮膚移植；免疫抑制；雷公藤內(nèi)酯醇；作用機(jī)制

同種器官移植已成為治療人類腎臟、心臟及肝臟等嚴(yán)重疾病的一種重要手段。但是，由于目前臨床應(yīng)用的免疫抑制劑長期使用時具有一定的毒副作用，因此研制開發(fā)新型、高效、低毒的免疫抑制劑，一直是臨床關(guān)注的熱點(diǎn)[1-2]。雷公藤內(nèi)酯醇（Triptolide，Tri）是從我國傳統(tǒng)中藥雷公藤中分離出來的含有三個環(huán)氧基的二萜內(nèi)酯化合物，具有較強(qiáng)的抗炎、抗腫瘤和免疫抑制作用[3-4]。動物實(shí)驗(yàn)證實(shí)其在心臟[5-6]、腎臟[7]、肝臟[8]、肺臟[9]、胰島[10-11]等多種移植模型中均具有較好的抗排斥作用，是一種極有潛力的免疫抑制藥物。但目前國內(nèi)外學(xué)者對于Tri在移植中的抗排斥作用機(jī)制仍然存在較多爭論[12]。本研究旨在通過觀察Tri在小鼠同種異體皮膚移植中的抗排斥效果，初步探討其可能的免疫作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

近交系雄性BALB/c小鼠（H-2d）8只為供體，雄性C57BL/6（H-2b）24只為受體，均為8～12周齡，體重22～25 g，購自北京維通利華公司。飼養(yǎng)于恒溫（25～27℃）、恒定濕度（45%～55%）、無特定病原體（SPF級）環(huán)境中。

1.2 主要試劑

Tri購自中國藥品生物制品檢定所，吐溫80購自北京思語偉業(yè)生物公司，鏈脲佐菌素（streptozotocin，STZ）、膠原酶Ⅴ購自Sigma公司，F(xiàn)icoll 400購自瑞典Pharmacia公司，胎牛血清購自Gibco公司，免疫組化試劑購自邁新公司。藻紅蛋白（PE）標(biāo)記的抗小鼠Foxp3單克隆抗體（mAb）、異硫氰酸熒光素（FITC）標(biāo)記的抗小鼠CD4單克隆抗體（mAb）、別藻青蛋白（APC）標(biāo)記的抗小鼠CD25單克隆抗體（mAb）等免疫熒光染料均購自eBioscience公司。

1.3 皮膚移植與分組

供體（BALB/c）脫椎法處死后，取尾部皮膚，剪成0.8 cm×0.8 cm大小的皮片置于無菌PBS中備用。C57BL/6受鼠給予4%水合氯醛腹腔注射（10μL/g）麻醉。制備受鼠背部移植床，將供體皮片置于移植床，6-0絲線縫合固定，皮片表面敷蓋凡士林油紗并用無菌紗布包扎覆蓋，創(chuàng)可貼包扎固定，單籠飼養(yǎng)。3 d后去掉凡士林油紗和無菌紗布，逐日觀察移植物排斥狀況。以皮片結(jié)痂、變硬、壞死、縮小到初始測量尺寸的50%時，定義為移植皮膚被排斥標(biāo)準(zhǔn)[13]。術(shù)后分成對照組和治療組[包括L-Tri組（100μg/kg）和H-Tri組（200μg/kg）]。治療組術(shù)后連續(xù)6 d腹腔注射Tri，對照組給予等體積溶劑（1%吐溫80）。

1.4 流式細(xì)胞術(shù)

移植術(shù)后第7天，分別制備各組小鼠的脾淋巴細(xì)胞懸液，將濃度調(diào)制5×106/mL。然后取1 mL細(xì)胞懸液加入FITC-抗CD4單抗（0.25μg/106個細(xì)胞）和APC-抗CD25單抗（0.125μg/106個細(xì)胞），室溫共孵育15 min，F(xiàn)oxp3-PE標(biāo)記參照試劑盒操作指南進(jìn)行破膜標(biāo)記。標(biāo)記后的細(xì)胞用冷PBS緩沖液（pH 7.4）洗2次。1%多聚甲醛300μL重懸固定，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106個/mL，取400μL上FACScan流式細(xì)胞儀進(jìn)行分析。每份標(biāo)本均設(shè)同型對照，取2次檢測結(jié)果均值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。以流式細(xì)胞儀雙色、三色分析法分別分析CD4+CD25+Foxp3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的比例。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件及Graphpad Prism 5.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，計(jì)量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Tri對移植皮膚存活時間的影響

對照組移植皮膚平均存活時間為（8.3±1.2）d，L-Tri組為（12.4±1.9）d，H-Tri組為（14.9±2.2）d；與對照組相比，L-Tri組和H-Tri組移植皮膚平均存活時間明顯延長，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）；與L-Tri組相比，H-Tri組移植皮膚平均存活時間明顯延長，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見圖1。

圖1 Tri對小鼠同種異體移植皮膚生存時間的影響

2.2 流式細(xì)胞檢測結(jié)果

皮膚移植術(shù)后第7天，Tri處理組脾細(xì)胞CD4+CD25+Foxp3+T reg的比例明顯增加，H-Tri組為（16.1± 2.1）%，明顯高于L-Tri組[（12.6±1.5）%]（P=0.00），且兩組均明顯高于對照組[（5.6±0.8）%]（P=0.01）。見圖2。

3 討論

器官移植已經(jīng)成為治療終末期器官衰竭的最有效手段，但移植術(shù)后的免疫排斥反應(yīng)卻長期影響著移植效果和患者的生存質(zhì)量，免疫抑制藥物的合理應(yīng)用是移植成敗的關(guān)鍵。目前常用的免疫抑制劑的作用效果仍不十分理想，長期應(yīng)用可造成肝、腎功能受損、感染風(fēng)險增加、腫瘤發(fā)生率增加等一系列不良反應(yīng)。因此，研究開發(fā)新型、低毒、高效的抗排斥藥物，探索更為有效的免疫抑制方案仍然是當(dāng)前迫切需要解決的問題[6]。

圖2 Tri對皮膚移植小鼠脾淋巴細(xì)胞CD4+CD25+Foxp3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的影響

近幾年的研究顯示，Tri在體內(nèi)、體外均具有較好的免疫抑制活性[14]，在器官移植領(lǐng)域有一定應(yīng)用前景。在大鼠同種異體心臟移植模型中，Tri能夠明顯延長移植心臟的存活時間，并與他克莫司和環(huán)孢霉素均具有明顯協(xié)同作用[5]。在小鼠同種異體心臟移植研究中，Tri能夠延長移植心臟存活時間，并與雷帕霉素顯示出了良好的協(xié)同作用[6]。有學(xué)者研究顯示，在大鼠同種異體腎臟移植中，Tri同樣能夠明顯延長移植腎臟的存活時間[7]。鄭樹森等[8]研究證實(shí)，雷公藤多苷能夠輕度抑制大鼠異種原位肝移植排斥反應(yīng)。He等[9]研究發(fā)現(xiàn)，Tri能夠減輕移植肺臟的缺血再灌注損傷，改善移植肺功能。本研究將Tri應(yīng)用于小鼠同種異體皮膚移植模型，觀察到Tri能夠抑制其免疫排斥反應(yīng)，有效延長移植物的存活時間，并且隨著Tri劑量的增加，其免疫抑制作用也明顯增強(qiáng)，提示Tri的抗排斥作用與藥物劑量有一定相關(guān)性。但Tri發(fā)揮免疫抑制作用的機(jī)制尚未完全闡明，國內(nèi)外學(xué)者仍然存在較多的爭論。

近年來研究顯示，作為一種新的免疫抑制劑，Tri可抑制T細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)T細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞（DC）的凋亡，抑制抗原遞呈細(xì)胞的抗原遞呈，抑制DC表達(dá)主要組織相容性復(fù)合體Ⅰ類和Ⅱ類分子[15]，抑制IL-2、IL-6、IL-8、IFN-γ、TNF-α等細(xì)胞因子的產(chǎn)生[16]。CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞是Sakaguchi等于1995年首先發(fā)現(xiàn)，存在于外周血及脾臟組織的CD4+T細(xì)胞中的一類具有獨(dú)特抑制功能的T細(xì)胞亞群。在小鼠體內(nèi)占CD4+T細(xì)胞的5%～10%，而在人體內(nèi)只占2%～3%。近年來研究發(fā)現(xiàn)，CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞作為一群具有免疫負(fù)調(diào)控功能的T細(xì)胞亞群，通過抑制其他免疫效應(yīng)細(xì)胞的激活和增殖，對抑制移植排斥反應(yīng)和誘導(dǎo)移植免疫耐受起重要作用[17-18]，而輸注CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞可以促進(jìn)移植物存活[19]。在同種移植中，有研究證實(shí)，CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞對于預(yù)防或糾正慢性移植物抗宿主反應(yīng)（GVHD）有重要作用[20]。許多研究表明，CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞亦可以影響巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、NK細(xì)胞、B細(xì)胞等的功能[6，21]。Foxp3（forkhead/winged helix transciption factor）作為叉頭狀轉(zhuǎn)錄因子，為CD4+CD25+T細(xì)胞的發(fā)育和功能所必需[22]。Tri能夠促進(jìn)Foxp3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的產(chǎn)生[23-24]。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，給予皮膚移植小鼠應(yīng)用不同劑量Tri，能夠提高受體小鼠脾臟CD4+CD25+Foxp3+T細(xì)胞的數(shù)量，延長移植皮膚的存活時間，并具有一定劑量依賴效應(yīng)。由此推斷，Tri可能通過增加移植受體CD4+CD25+Foxp3+T細(xì)胞的數(shù)量，誘導(dǎo)免疫耐受，從而發(fā)揮延長移植物存活時間的作用。但Tri誘導(dǎo)CD4+CD25+Foxp3+T細(xì)胞上調(diào)的分子機(jī)制目前尚不清楚，還需進(jìn)一步研究。

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Immunosuppressive effect and mechanism of Triptolide on skin allografts in m ice

LIANG Kuo1LIU Shuang1CUIYeqing1SUN Haichen1LUO Bin1WAN Suigui2SUN Xuejing2LIFei1▲
1.Department of General Surgery,Xuanwu Hospital of Capital Medical University,Beijing 100053,China;2.Department of Hematology,Xuanwu Hospitalof Capital Medical University,Beijing 100053,China

Ob jective To investigate the immunosuppressive effect and the possiblemechanism of Triptolide on skin allografts in murinemodel.M ethods BALB/c mice to C57BL/6 mice skin allograftingmodels were created.The recipientswere divided into three groups.Themice in the treatment groupswere injected intraperitoneally with Triptolide at 100μg/kg(low-dose Triptolide group,L-Trigroup)or 200μg/kg(high-dose Triptolide group,H-Tri group)daily in the first 6 days(0-5 days);while themice in control group were given vehicles(1%Tween 80).Themedian survival time of skin allografts in each group wasmonitored.The proportion of CD4+CD25+Foxp3+regulatory T cells in spleen tissue were tested by flow cytometry.Results The median survival time of skin allografts in the control group,L-Tri group and H-Tri group were(8.3±1.2),(12.4±1.9)d and(14.9±2.2)d respectively.The percentage of CD4+CD25+Foxp3+regulatory T cells in spleen tissues of three groupswere(5.6±0.8)%,(12.6±1.5)%and(16.1±2.1)%respectively. Compared with control group,the L-Tri group and H-Tri group show significantly prolonged skin allograft survival time (P＜0.05),increased percentage of CD4+CD25+Foxp3+regulatory T cells(P＜0.05).Conclusion Tri can inhibit immune rejection,prolong the skin allograftsurvival time inmice.The anti-rejection effect of Trimay be attributed to the upregulation of regulatory T cells.In addition,the immunosuppressive effectof triptolide shows dose-dependent.

Skin transplantation;Immunosuppression;Triptolide;Mechanism

R657.5

A

1673-7210（2014）08（b）-0012-04

2014-04-08本文編輯：程銘）

北京市自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（編號7142071）；北京市衛(wèi)生系統(tǒng)高層次衛(wèi)生技術(shù)人才培養(yǎng)項(xiàng)目（編號2011-2-27）；中共北京市委組織部優(yōu)秀人才項(xiàng)目（編號2011D005018000004）；首都醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)臨床合作研究基金項(xiàng)目（編號13JL19）。[作者簡介]梁闊（1973-），男，北京人，博士；研究方向：胃腸胰腺疾病的臨床與基礎(chǔ)研究、移植免疫的基礎(chǔ)研究。

▲通訊作者