氯沙坦對血管性癡呆大鼠認(rèn)知功能的改善及膽堿能系統(tǒng)活性的影響

陳江瑛 閆振文 張素平 尹義臣

1.暨南大學(xué)醫(yī)學(xué)院第四附屬醫(yī)院廣州紅十字會醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，廣東廣州510220；2.中山大學(xué)附屬第二醫(yī)院神經(jīng)科，廣東廣州510120

氯沙坦對血管性癡呆大鼠認(rèn)知功能的改善及膽堿能系統(tǒng)活性的影響

陳江瑛1閆振文2張素平1尹義臣1

1.暨南大學(xué)醫(yī)學(xué)院第四附屬醫(yī)院廣州紅十字會醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，廣東廣州510220；2.中山大學(xué)附屬第二醫(yī)院神經(jīng)科，廣東廣州510120

目的研究氯沙坦對血管性癡呆（VaD）大鼠認(rèn)知功能的改善和膽堿能系統(tǒng)活性的影響。方法將40只雄性SD大鼠隨機分成四組：假手術(shù)組，模型組，氯沙坦低劑量[2 mg/（kg·d）]組，氯沙坦高劑量[5 mg/（kg·d）]組，每組10只。用雙側(cè)頸總動脈永久性結(jié)扎法（2VO）制備VaD大鼠模型，造模前予灌胃治療，Morris水迷宮測試治療后VaD大鼠認(rèn)知功能的改善情況，Tunel染色測定各組大鼠海馬腦組織內(nèi)細(xì)胞凋亡的變化。免疫組織化學(xué)方法檢測Bc1-2、Bax蛋白表達(dá)，并測定乙酰膽堿轉(zhuǎn)移酶（ChAT）活性。結(jié)果方差分析表明，潛伏期和跨越次數(shù)F值分別為33.23和25.20。氯沙坦灌胃治療的VaD大鼠，與未予治療的VaD大鼠組相比，治療組大鼠找到平臺的潛伏期縮短（P＜0.01），穿越平臺次數(shù)增多（P＜0.01）；氯沙坦高劑量組較氯沙坦低劑量組逃避潛伏期時間減少，穿越平臺次數(shù)增多（P＜0.01）。方差分析表明，凋亡細(xì)胞、Bcl-2蛋白及Bax蛋白F值分別為155.58、215.79和428.95。與模型組相比，氯沙坦治療組大鼠腦組織海馬區(qū)凋亡細(xì)胞數(shù)明顯減少，抗凋亡基因Bcl-2蛋白表達(dá)顯著增加，凋亡基因Bax蛋白表達(dá)降低，差異有高度統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；氯沙坦高劑量組與氯沙坦低劑量組相比，Bcl-2蛋白表達(dá)增加，Bax蛋白表達(dá)下降，差異有高度統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。方差分析表明，各組大鼠ChAT活力F值為13.61。氯沙坦治療組腦組織ChAT活力明顯升高，差異有高度統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；氯沙坦高劑量組與氯沙坦低劑量組相比，腦組織ChAT活力顯著升高，差異有高度統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。結(jié)論氯沙坦治療可以明顯改善VaD大鼠的認(rèn)知功能，其機制與調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)、促進(jìn)乙酰膽堿的合成相關(guān)。

氯沙坦；血管性癡呆；認(rèn)知功能；細(xì)胞凋亡；乙酰膽堿轉(zhuǎn)移酶

血管性癡呆（vascular dementia，VaD）是由一系列腦血管因素（缺血或出血或急慢性缺氧性腦血管病等）導(dǎo)致腦組織損害，引起以認(rèn)知功能障礙為特征的綜合征[1-2]。有研究表明，腦內(nèi)具有獨立的腎素-血管緊張素系統(tǒng)（RAS），而RAS除調(diào)節(jié)血壓和水電解質(zhì)平衡外，還參與學(xué)習(xí)、記憶等認(rèn)知功能的調(diào)節(jié)。氯沙坦屬血管緊張素1型受體（AT1受體）阻滯藥，通過阻滯AT1受體對抗AngⅡ的作用。有研究顯示氯沙坦可進(jìn)入腦組織，拮抗腦局部AT1受體，下調(diào)腦局部RAS系統(tǒng)的作用而產(chǎn)生腦保護(hù)[3-4]。本研究采用VaD模型大鼠，觀察氯沙坦對VaD大鼠認(rèn)知功能的改善作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物老齡健康雄性SD大鼠40只，月齡大于16個月，體重300～450 g，由中山大學(xué)北校區(qū)實驗動物中心提供。

1.1.2 藥物氯沙坦（美國杭州默沙東公司生產(chǎn)，批號：H20030654）。

1.1.3 試劑凋亡TUNEL試劑盒（美國ROSS公司），兔抗大鼠Bax多克隆抗體（美國Epitomics公司），兔抗大鼠BCl-2多克隆抗體（美國CST公司），乙酰膽堿轉(zhuǎn)移酶（ChAT）測試盒（南京建成生物工程研究所）。

1.2 血管性癡呆大鼠模型的建立及分組處理

將雄性SD大鼠用10%水合氯醛（0.035 mL/10 g）腹腔注射麻醉后，分離雙側(cè)頸總動脈，并以“0”號絲線阻斷血流20 min，可以觀察到大鼠驚厥、呼吸深慢、心跳加快；同時在距鼠尾尖約1 cm處斷尾，放血約0.3 mL。松開絲線扣恢復(fù)血流10 min后，再次阻斷血流20 min，如此重復(fù)3次，第3次血流再灌注后觀察30 min，如大鼠呼吸、心跳平穩(wěn)，即可縫合皮膚，放回籠中正常飼養(yǎng)。其中假手術(shù)組僅分離雙側(cè)頸總動脈，套絲扣；但不阻斷血流，尾部不放血，觀察時間、飼養(yǎng)條件與模型組相同。

造模前大鼠隨機分成四組，每組各10只：假手術(shù)組，模型組，氯沙坦低劑量[2 mg/（kg·d）]組，氯沙坦高劑量[5 mg/（kg·d）]組。手術(shù)當(dāng)天提前2 h灌胃，直至術(shù)后15 d。在灌胃后30 d，分別對上述各組大鼠進(jìn)行水迷宮試驗，觀察各組大鼠學(xué)習(xí)和記憶成績。術(shù)中假手術(shù)組大鼠無死亡，其余各組各有1只大鼠死亡。

1.3 Morris水迷宮測試

1.3.1 定位航行試驗水溫控制在25℃左右，每日上下午各4次，將大鼠面向池壁分四個象限放入水中，記錄其在2 min內(nèi)尋找到平臺的時間（逃避潛伏期）。如果大鼠在2 min內(nèi)未找到平臺，則用手牽引其至平臺上，讓大鼠停留20 s，再放回籠中，其潛伏期算120 s。歷時5 d。

1.3.2 空間探索試驗第6天撤除平臺，將大鼠任選1個入水點放入，記錄其2 min內(nèi)跨越原平臺位置的次數(shù)。1.4免疫組織化學(xué)法檢測Bcl-2、Bax陽性細(xì)胞的表達(dá)

各組大鼠在行為測試完畢后以10%水合氯醛麻醉，立即開胸暴露心臟，左心室迅速插管至主動脈，同時剪開右心耳，灌注生理鹽水100 mL，再灌注4%的多聚甲醛250 mL，速度先快后慢，至頸部非常僵硬為滿意，迅速取腦并分離左側(cè)海馬區(qū)組織，4%多聚甲醛中浸置4～6 h，經(jīng)乙醇常規(guī)脫水、二甲苯透明后，浸蠟包埋，5 μm厚切片，行免疫組化染色，嚴(yán)格按照說明操作。

1.5 氯沙坦對乙酰膽堿轉(zhuǎn)移酶活力的影響

將上述各動物實驗，選取6只不同劑量組的大鼠斷頭處死，制成10%的勻漿，采用相關(guān)試劑盒測定腦組織中ChAT的活力。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件，計量資料數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多組間的比較采用方差分析，兩兩比較采用q檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠Morris水迷宮實驗結(jié)果比較

模型組所用逃避潛伏期時間明顯長于假手術(shù)組、氯沙坦高劑量組及氯沙坦低劑量組，差異均有高度統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）?？臻g探索試驗結(jié)果顯示，氯沙坦高劑量組、低劑量組出現(xiàn)穿越平臺次數(shù)均高于模型組，差異有高度統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。氯沙坦高劑量組出現(xiàn)穿越平臺次數(shù)高于氯沙坦低劑量組，差異有高度統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。見表1。

表1 各組大鼠Morris水迷宮實驗結(jié)果比較（x±s）

2.2 氯沙坦對大鼠凋亡細(xì)胞、Bcl-2蛋白及Bax蛋白的影響

與假手術(shù)組比較，模型組凋亡基因Bax蛋白表達(dá)顯著增加（P＜0.01），抗凋亡基因Bcl-2蛋白表達(dá)顯著下降（P＜0.01）。與模型組比較，氯沙坦低劑量組、氯沙坦高劑量組抗凋亡基因Bcl-2蛋白表達(dá)顯著增加（P＜0.01），凋亡基因Bax蛋白表達(dá)降低（P＜0.01）。說明氯沙坦可能通過影響凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)而發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。氯沙坦高劑量組與低劑量組比較，Bcl-2蛋白表達(dá)增加，Bax蛋白表達(dá)下降，差異有高度統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。見表2。

表2 氯沙坦對大鼠凋亡細(xì)胞、Bcl-2蛋白及Bax蛋白的影響（%，x±s）

2.3 氯沙坦對大鼠腦組織中膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶活力的影響

與假手術(shù)組比較，模型組腦組織ChAT活力顯著降低（P＜0.01），氯沙坦低、高劑量組腦組織ChAT活力明顯升高，差異有高度統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。氯沙坦高劑量組與低劑量組比較，ChAT活力差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表3。

3 討論

中樞膽堿能機制和缺血后遲發(fā)性神經(jīng)元死亡（DND）引起的炎癥反應(yīng)、細(xì)胞凋亡是近年研究較為重視VaD的發(fā)生機制[5]。中樞膽堿能通路是構(gòu)成學(xué)習(xí)記憶的主要通路，乙酰膽堿（ACh）是其中的重要神經(jīng)遞質(zhì)，其濃度升高有利于學(xué)習(xí)記憶能力的恢復(fù)，降低則促進(jìn)癡呆的發(fā)生[6]。腦缺血時膽堿能神經(jīng)元退變，分解ACh增強，導(dǎo)致ACh濃度降低從而促進(jìn)癡呆的發(fā)生。ChAT活性被視為膽堿能神經(jīng)元最具體的指標(biāo)，ChAT活性降低的程度以及由此產(chǎn)生的ACh水平下降的嚴(yán)重程度與認(rèn)知能力下降密切相關(guān)，與年齡相關(guān)的認(rèn)知功能障礙在動物大腦中表現(xiàn)出ChAT活性顯著降低[7]。海馬CA1區(qū)對腦缺血有選擇易損性，海馬神經(jīng)元的凋亡丟失和缺血壞死影響了神經(jīng)元突觸的可塑性，影響了海馬對信息的處理和傳遞，引起腦缺血后記憶認(rèn)知功能損害。

表3 氯沙坦對大鼠腦組織中乙酰膽堿轉(zhuǎn)移酶活力的影響（x±s）

近年的研究證實[8-10]，應(yīng)用血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑（ACEI）或血管緊張素Ⅱ1型受體（AT1R）阻斷劑減少AngⅡ的生成或阻斷其受體信號通路，能明顯改善腦血流量和認(rèn)知功能。Rozzini等[11]研究證實，卡托普利可以改善缺血性腦梗死患者的生活質(zhì)量，提高其認(rèn)知功能。推測其機制可能與卡托普利通過抑制腦源性AngⅡ的生成，間接提高腦組織ACh的濃度，從而改善認(rèn)知功能有關(guān)。Moretti等[12]研究發(fā)現(xiàn)，腦室內(nèi)注入煙堿類膽堿能受體拮抗劑美加明可破壞雄性SD大鼠的空間學(xué)習(xí)能力，再注AngⅣ可使其受損的空間學(xué)習(xí)能力恢復(fù)正常。說明AngⅣ對學(xué)習(xí)記憶的修復(fù)作用與腦中的膽堿能系統(tǒng)相關(guān)。

在本實驗中，采用氯沙坦對血管性癡呆大鼠進(jìn)行治療，可明顯改善大鼠搜索平臺的潛伏期和跨越平臺的次數(shù)，改善大鼠學(xué)習(xí)記憶功能。在實驗中，VaD模型組大鼠CA1區(qū)Bax高表達(dá)，Bcl-2低表達(dá)，凋亡細(xì)胞增多，證實了長期低灌注可使海馬神經(jīng)元凋亡，影響認(rèn)知和記憶。氯沙坦低劑量組和高劑量組與模型組相比，均有Bcl-2的高表達(dá)，Bax的低表達(dá)，凋亡細(xì)胞也明顯減少。說明氯沙坦能抑制海馬神經(jīng)元細(xì)胞的凋亡，達(dá)到保護(hù)神經(jīng)元，改善VD大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的效果，其機制與調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)相關(guān)。同時，氯沙坦可以有效提高ChAT活性，明顯改善模型小鼠學(xué)習(xí)記憶能力，提示氯沙坦可促進(jìn)ACh的合成，增加ACh與M受體的結(jié)合，這可能也是氯沙坦增強模型小鼠學(xué)習(xí)記憶功能的機制之一。

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Influence of Losartan on cognitive function improvement and cholinergic neuron of rats with vascular dementia

CHEN Jiangying1YAN Zhenwen2ZHANG Suping1YIN Yichen1
1.Department of Neurology,Guangzhou Red Cross Hospital the Fourth Affiliated Hospital of Medical College,Ji'nan University,Guangdong Province,Guangzhou510220,China;2.Department of Neurology,the Second Hospital Affiliated to Sun Yat-sen University,Guangdong Province,Guangzhou510120,China

Objective To study improvement of cognitive function impairment of vascular dementia(VaD)rats induced by a permanent bilateral ligation of common carotid arteries(2VO)after administration of Losartan.Methods 40 male SD rats were randomly divided into 4 groups:sham-operation group,model group,low dose[2 mg/(kg·d)]of Losartan group,high dose[5 mg/(kg·d)]of Losartan group,the VaD rats models were established by 2VO.Pre-treatment VaD model was established by gavage of Losartan.Morris water test was performed to detect the improvement of cognitive function of VaD rats after treatment.Tunel staining was performed to detect the changes of cell apoptosis of hippocampus brain tissue in rats of all groups.Immunohistochemistry was performed to detect the expression of Bcl-2 protein and Bax protein,and the ChAT activity.Results Variance analysis showed that,the F value of incubation period and crossing times was 33.23 and 25.20 respectively.Compared with untreated VaD group,the incubation period of finding platform was shortened in treatment VaD group(P＜0.01),and crossing times increased(P＜0.01).Compared with low dose of Losartan group,the incubation period of finding platform was shortened in high dose of Losartan group, and crossing times increased(P＜0.01).Variance analysis showed that,the F value of apoptotic cell,Bcl-2 protein and Bax protein was 155.58,215.79 and 428.95 re-spectively.Compared with model group,in the Losartan treatment groups,the number of apoptotic cell of hippocampus brain tissue in rats reduced significantly,the expression of Bcl-2 protein increased significantly,the expression of Bax protein decreased significantly,the differences were statistically significant(P＜0.01).Compared with low dose of Losartan group,the expression of Bcl-2 protein increased and the expression of Bax protein was decreased in high dose of Losartan group,the differences were statistically significant(P＜0.01).Variance analysis showed that,the F value of ChAT activity in all groups was 13.61.The ChAT activities of Losartan treatment groups increased,the differences were statistically significant(P＜0.01).Compared with low dose of Losartan group,the ChAT activity of high dose of Losartan group increased,the difference was statistically significant(P＜0.01).Conclusion Cognitive function impairment can be improved by administration of Losartan in VaD rats,which may be mediated by modulating the expression of apoptosis-related protein and promoting acetylcholine synthesis.

Losartan;Vascular dementia;Cognitive function;Apoptosis;Choline acetyl transferase

R749.3

A

1673-7210（2014）01（a）-0010-04

2013-10-28本文編輯：張瑜杰）

廣東省醫(yī)學(xué)科研基金立項課題（編號A2013506）廣東省廣州市中醫(yī)藥、中西醫(yī)結(jié)合科研課題（編號2009A25）；廣東省中醫(yī)藥局建設(shè)中醫(yī)藥強省科研立項課題（編號2010020）；廣東省廣州市衛(wèi)生局醫(yī)藥衛(wèi)生科技一般引導(dǎo)項目（編號2013 1A011047）。