白藜蘆醇二聚體與眼鏡蛇神經(jīng)毒素的作用機(jī)制*

葉勇 邢海婷 郭亞

(華南理工大學(xué)化學(xué)與化工學(xué)院，廣東廣州510640)

白藜蘆醇是存在于許多植物(如虎杖、葡萄)中的一種二苯乙烯化合物，具有抗腫瘤、抗艾滋病、抗炎鎮(zhèn)痛及雌激素樣作用等多種藥理活性［1-3］.它對(duì)光敏感，紫外光可誘發(fā)其聚合［4］.筆者所在課題組的前期研究也證實(shí)，波長(zhǎng)365nm的入射光照射導(dǎo)致了白藜蘆醇二聚體的形成［5］.白藜蘆醇二聚體在抗菌、抗病毒、抗氧化和抗腫瘤等方面的效果均優(yōu)于白藜蘆醇單體，因而成為人們關(guān)注的焦點(diǎn)［6-7］.眼鏡蛇神經(jīng)毒素(NT)是從眼鏡蛇毒中分離出的一種多肽，具有中樞鎮(zhèn)痛作用［8］;但由于NT相對(duì)分子質(zhì)量較大，難以進(jìn)入中樞，起效慢［9］.白藜蘆醇相對(duì)分子質(zhì)量小，可以進(jìn)入中樞，起效快，但作用時(shí)間短［10］.如果能將白藜蘆醇與NT聯(lián)合給藥，可以取長(zhǎng)補(bǔ)短，發(fā)揮更好的鎮(zhèn)痛作用.為了探討白藜蘆醇及其二聚體與NT的相互作用，文中通過(guò)分子模擬和光譜法分析了兩者的相互作用，并對(duì)其作用機(jī)制進(jìn)行了探討，以期為實(shí)現(xiàn)兩者的聯(lián)合用藥、提升臨床鎮(zhèn)痛效果提供技術(shù)和理論支撐.

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 主要試劑和儀器

白藜蘆醇(純度≥99%，批號(hào)20120821)，購(gòu)自廣州菲博生物科技有限公司;眼鏡蛇神經(jīng)毒素，由筆者所在實(shí)驗(yàn)室從眼鏡王蛇(Naja ophiophagus hannah)毒中分離獲得;其他試劑均為分析純?cè)噭?

F-4500型熒光分光光度計(jì)(日本日立公司生產(chǎn));UV-2450紫外可見光譜儀(日本島津公司生產(chǎn));5mW點(diǎn)狀激光器(東莞三鼎光電公司生產(chǎn)).

1.2 分子作用模擬

采用 Discovery Studio軟件進(jìn)行分子對(duì)接模擬［11］，具體模擬流程如下:從 Brookhaven蛋白庫(kù)(http:∥www.rcsb.org/pdb/home/home.do)中下載眼鏡蛇神經(jīng)毒素的pdb文件，打開后進(jìn)行預(yù)處理，除去水分子，整理并補(bǔ)充調(diào)整文件中蛋白的氨基酸殘基和補(bǔ)充氫，施加力場(chǎng);將眼鏡蛇神經(jīng)毒素定義為受體，定義結(jié)合位點(diǎn)、找到結(jié)合空穴，然后定義結(jié)合球，確定結(jié)合區(qū)域坐標(biāo);將白藜蘆醇及其二聚體結(jié)構(gòu)導(dǎo)入軟件繪圖窗，優(yōu)化化合物的幾何三維結(jié)構(gòu);接著施加力場(chǎng)并進(jìn)行能量?jī)?yōu)化，確保配基的鍵長(zhǎng)、鍵能、鍵角是正確的且處于能量穩(wěn)定狀態(tài)［12］.分子對(duì)接時(shí)，采用分子對(duì)接程序，將眼鏡蛇神經(jīng)毒素分子選為受體，白藜蘆醇及其二聚體選為配體，選擇結(jié)合區(qū)域坐標(biāo)，運(yùn)行程序.完成后在結(jié)果中可獲得結(jié)合能等多項(xiàng)參數(shù)，進(jìn)行比較.

1.3 紫外-可見光吸收曲線和熒光光譜測(cè)定

將NT用0.1 mol/L、pH=7.4的磷酸鹽緩沖液配制成濃度為1.0×10-5mol/L的緩沖溶液.取5mL NT緩沖溶液6份，分別加入0、0.5×10-4、1× 10-4、2×10-4、4×10-4、8×10-4mol/L的白藜蘆醇溶液1 mL，在室溫下采用波長(zhǎng)365 nm的激光照射10～50min.以緩沖液為空白掃描250～500 nm范圍內(nèi)的紫外-可見光吸收曲線;并以275nm為激發(fā)波長(zhǎng)，在狹縫5nm的條件下，掃描300～500nm范圍內(nèi)NT與白藜蘆醇的熒光光譜.

1.4 同步熒光掃描

將激發(fā)波長(zhǎng)與發(fā)射波長(zhǎng)間保持固定的波長(zhǎng)間隔，來(lái)掃描和記錄激發(fā)波長(zhǎng)的變化.白藜蘆醇與NT的濃度與1.3節(jié)中相同，以波長(zhǎng)365nm的激光照射20min，分別掃描波長(zhǎng)間隔Δ為15、60 nm的同步熒光光譜.

2 結(jié)果與討論

2.1 白藜蘆醇二聚體和NT的分子結(jié)構(gòu)

表1所示為白藜蘆醇及其二聚體和NT的分子結(jié)構(gòu).白藜蘆醇分子結(jié)構(gòu)中含有酚羥基和一個(gè)雙鍵，分子間易發(fā)生羥基間縮合脫水或雙鍵加成，從而形成二聚體.表1中列舉的自然界存在的6種二聚體，其結(jié)合方式各不相同.NT的相對(duì)分子質(zhì)量為8000，含有73個(gè)氨基酸和5個(gè)S—S鍵［13］.

表1 白藜蘆醇及其二聚體和NT的分子結(jié)構(gòu)Table 1 Molecular structures of resveratrol，dimer and NT

2.2 白藜蘆醇二聚體與NT的相互作用

評(píng)價(jià)分子間相互作用通常以對(duì)接能和對(duì)接交互作用能為標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)接能的絕對(duì)值越大，證明受體與底物的對(duì)接親和力越強(qiáng)，同時(shí)也預(yù)測(cè)小分子與受體結(jié)合的活性越高;對(duì)接交互作用能越高說(shuō)明受體和配體的作用越強(qiáng)、形成的復(fù)合物越穩(wěn)定.通過(guò)軟件模擬分子對(duì)接后，白藜蘆醇二聚體除了(+)-白蘞素A只有4種態(tài)勢(shì)外，其他均以5種態(tài)勢(shì)成功與NT實(shí)現(xiàn)對(duì)接.其結(jié)合能見表2.

由表2可見，除了(+)-白蘞素A與NT對(duì)接能絕對(duì)值較小外，其他二聚體的對(duì)接能絕對(duì)值均大于單體對(duì)接能的絕對(duì)值，表明二聚體更易與NT結(jié)合，對(duì)NT的作用明顯增強(qiáng).白藜蘆醇及其二聚體與NT結(jié)合的模擬圖如圖1所示.由圖1可見，相比于白藜蘆醇單體，其二聚體與NT連接的基團(tuán)數(shù)明顯增多.

表2 白藜蘆醇及其二聚體與NT分子的結(jié)合能Table 2 Binding energy of resveratrol and dimer with NT

2.3 不同光照時(shí)間白藜蘆醇與NT作用的紫外-可見光光譜和熒光光譜

圖1 白藜蘆醇及其二聚體與NT的結(jié)合模擬圖Fig.1 Binding simulaton of resveratrol and dimer with NT

經(jīng)過(guò)不同時(shí)間光照的白藜蘆醇-NT體系的紫外可見光譜如圖2(a)所示.由圖2(a)可見:未經(jīng)光照時(shí)白藜蘆醇-NT體系的紫外-可見光譜在214和 305nm處有兩個(gè)峰，經(jīng)波長(zhǎng)365 nm的光照射后體系的紫外-可見光譜峰形發(fā)生了變化;隨著光照時(shí)間延長(zhǎng)，第一個(gè)峰逐漸紅移至238nm，第二個(gè)峰逐漸紅移至310nm，吸光度也逐漸增加.對(duì)比文獻(xiàn)［14］發(fā)現(xiàn)，310 nm對(duì)應(yīng)于白藜蘆醇二聚體的特征峰，而238nm對(duì)應(yīng)于白藜蘆醇二聚體與NT的交互作用峰，這表明365nm光照促進(jìn)了白藜蘆醇二聚體的形成及其與NT的交互作用.

以波長(zhǎng)365nm的光照射含一定濃度白藜蘆醇的NT溶液，體系的熒光光譜如圖2(b)所示.由圖2(b)可見，經(jīng)照射后，白藜蘆醇-NT體系的熒光發(fā)生了猝滅，且隨光照時(shí)間延長(zhǎng)，猝滅加劇，但最大發(fā)射波長(zhǎng)沒(méi)有明顯的改變.這說(shuō)明波長(zhǎng)365nm的光促進(jìn)了白藜蘆醇二聚體與NT的相互作用，分子聚合加速了能量轉(zhuǎn)移，但聚合物基本結(jié)構(gòu)沒(méi)有變化.

2.4 不同濃度白藜蘆醇與NT作用后的紫外-可見光譜和熒光光譜

圖2 波長(zhǎng)365nm的光照射后白藜蘆醇-NT體系的紫外-可見光譜和熒光光譜Fig.2 UV-Vis spectra and fluorescence spectra of resveratrol-NT system illuminated by laser at 365nm

以波長(zhǎng)365 nm的光照射20 min，考察白藜蘆醇濃度對(duì)白藜蘆醇-NT體系的影響，結(jié)果如圖3所示.由紫外-可見光譜可見:沒(méi)有白藜蘆醇存在時(shí)NT的紫外-可見光譜在211和275nm處有兩個(gè)峰，加入白藜蘆醇后，體系的紫外-可見光譜峰形發(fā)生了變化;隨著白藜蘆醇濃度增大，第2個(gè)峰一直保持在310nm，而第1個(gè)峰由227nm逐漸紅移至233nm，吸收強(qiáng)度也逐漸增加.這表明第2個(gè)峰是白藜蘆醇二聚體的特征峰，而第1個(gè)峰為NT與白藜蘆醇二聚體結(jié)合物的吸收峰.當(dāng)增大白藜蘆醇濃度時(shí)，白藜蘆醇二聚體增多，與NT的作用增強(qiáng).

NT的最大激發(fā)光波長(zhǎng)為275nm，以此波長(zhǎng)的光激發(fā)，具有最大發(fā)射波長(zhǎng)356nm.由圖3(b)可見，隨著白藜蘆醇濃度的增加，NT在356 nm處的熒光強(qiáng)度逐漸降低，表明白藜蘆醇對(duì)NT具有熒光猝滅聚合作用.熒光光譜中440 nm處出現(xiàn)一峰，且白藜蘆醇濃度為1×10-4mol/L時(shí)熒光強(qiáng)度最大，表明該峰是NT與白藜蘆醇二聚體結(jié)合物的熒光發(fā)射峰，此濃度為兩者的最佳聚合濃度.

圖3 白藜蘆醇濃度不同時(shí)白藜蘆醇-NT體系的紫外-可見光譜和熒光光譜Fig.3 UV-Vis spectra and fluorescence spectra of resveratrol-NT system at different concentrations of resveratrol

2.5 結(jié)合參數(shù)

采用經(jīng)典的Stern-Volmer方程［15］進(jìn)行擬合:

式中:F0和F分別為猝滅劑不存在或存在時(shí)的熒光強(qiáng)度;cq為猝滅劑的濃度，mol/L;Kq為猝滅速率常數(shù);0為生物大分子內(nèi)源性熒光壽命，對(duì)于生物大分子其值為10-8s［16］.F0/F與cq呈線性關(guān)系.應(yīng)用式(1)計(jì)算的Kq為5.62×1012L/(mol·s)，其值大大超過(guò)生物大分子的最大動(dòng)態(tài)猝滅常數(shù)2×1010L/(mol·s)［17］，可以認(rèn)定其為靜態(tài)猝滅.修正后的方程適合于靜態(tài)猝滅，故采用如下修正的Stern-Volmer方程［14］來(lái)處理數(shù)據(jù):

式中，n為熒光猝滅劑結(jié)合位點(diǎn)數(shù)，Ka為結(jié)合常數(shù). lg(F0-F)/F與lgCq呈線性關(guān)系.通過(guò)計(jì)算，獲得其結(jié)合常數(shù)Ka為5.12×105L/mol，結(jié)合位點(diǎn)數(shù)為1.

根據(jù)F?rster能量轉(zhuǎn)移理論［18］，能量轉(zhuǎn)移效率E與供體受體間距離R以及臨界能量轉(zhuǎn)移距離R0之間的關(guān)系為

式中，R0為E=50%時(shí)供-受體間的距離，K2為偶極空間取向因子，N為介質(zhì)的折射指數(shù)，φ為供體(NT)的量子效率，J為供體(NT)熒光發(fā)射光譜與受體(白藜蘆醇)吸收光譜的重疊積分.

能量轉(zhuǎn)移效率E由下式求出:

K2取各項(xiàng)隨機(jī)分布的平均值，即K2=2/3;N取水和有機(jī)物的平均值1.336;φ取色氨酸殘基的熒光量子效率0.118［19］;J可按下式計(jì)算:

式中，F(xiàn)()為供體在波長(zhǎng) 處的熒光強(qiáng)度，ε()為受體在波長(zhǎng) 處的摩爾消光系數(shù).

研究中分別測(cè)定了NT和白藜蘆醇在濃度為1× 10-4mol/L時(shí)的熒光發(fā)射光譜和紫外-可見光光譜，然后根據(jù)式(5)計(jì)算兩曲線重疊部分的積分，得J= 5.79×10-15cm3·L/mol.將各值代入式(4)可得R0= 2.24nm，通過(guò)式(3)可算得R=3.40nm.蛋白的熒光主要來(lái)自色氨酸殘基［20］，所求得的R值為結(jié)合部位與該殘基之間的距離.結(jié)果表明，白藜蘆醇與該色氨酸距離較近，容易發(fā)生非輻射能量轉(zhuǎn)移.

2.6 同步熒光光譜

同步熒光光譜中不同的固定波長(zhǎng)間隔反映了不同熒光基團(tuán)的特征，因此可借助同步熒光光譜判斷藥物分子對(duì)熒光蛋白質(zhì)構(gòu)象的影響.Δ =15 nm時(shí)的同步熒光光譜顯示了酪氨酸殘基的光譜特征，而Δ =60nm的同步熒光光譜顯示了色氨酸殘基的光譜特征［21］.因氨基酸殘基的最大發(fā)射波長(zhǎng)與其所處環(huán)境的極性有關(guān)，所以通過(guò)最大發(fā)射波長(zhǎng)的改變，可判斷蛋白質(zhì)構(gòu)象的變化.

固定NT濃度為1.0×10-5mol/L，逐漸增大白藜蘆醇濃度，記錄掃描波長(zhǎng)間隔為15:60nm的同步熒光光譜，結(jié)果如圖4所示.

由圖4可見，隨著白藜蘆醇濃度的增大，350 nm以下熒光強(qiáng)度逐漸降低;當(dāng)白藜蘆醇濃度不大于1.0×10-4mol/L時(shí)，隨濃度增大，最大激發(fā)波長(zhǎng)出現(xiàn)紅移(圖4(a)中由300nm紅移至383nm，圖4(b)中由300 nm紅移至370 nm);再繼續(xù)增大白藜蘆醇的濃度，最大激發(fā)波長(zhǎng)維持不變.

上述結(jié)果顯示:NT與白藜蘆醇二聚體結(jié)合后構(gòu)象變化明顯，其中酪氨酸和色氨酸殘基的親水性有所增加，這是白藜蘆醇二聚體中羥基氫鍵作用的結(jié)果;白藜蘆醇濃度為1.0×10-4mol/L時(shí)，NT與白藜蘆醇二聚體已形成較為穩(wěn)定的結(jié)合物.Δ =60nm的同步熒光強(qiáng)度變化較Δ =15 nm的更為明顯，說(shuō)明白藜蘆醇二聚體對(duì)色氨酸殘基的作用較酪氨酸殘基更強(qiáng)，是主要的作用位點(diǎn).

3 結(jié)論

文中采用分子對(duì)接方法考察了白藜蘆醇二聚體與NT的相互作用，并對(duì)不同白藜蘆醇濃度和不同光照時(shí)間下白藜蘆醇-NT體系的紫外-可見光譜和熒光光譜進(jìn)行分析，得出以下主要結(jié)論:

(1)白藜蘆醇二聚體與NT的結(jié)合能大于白藜蘆醇單體與NT的結(jié)合能，白藜蘆醇二聚體與NT的相互作用更強(qiáng);

(2)延長(zhǎng)光照時(shí)間和提高白藜蘆醇濃度，均可使白藜蘆醇二聚體與NT的相互作用增強(qiáng)，但最大熒光峰波長(zhǎng)沒(méi)有明顯變化，表明聚合物分子基本結(jié)構(gòu)沒(méi)有受到影響;

(3)白藜蘆醇二聚體與NT的結(jié)合常數(shù)較大，有1個(gè)結(jié)合位點(diǎn)，與結(jié)合點(diǎn)的距離較小，易發(fā)生非輻射能量轉(zhuǎn)移，導(dǎo)致熒光靜態(tài)猝滅;

(4)白藜蘆醇二聚體與NT通過(guò)羥基氫鍵作用，導(dǎo)致酪氨酸和色氨酸殘基親水性增強(qiáng)和分子構(gòu)象改變，色氨酸殘基是其作用的主要位點(diǎn).

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