篩選誘導煙草對煙草花葉病毒產(chǎn)生系統(tǒng)抗性的真菌

李娜，李錫宏，許汝冰，薛守聰，郭利，任加慶，霍瑞，王曉麗，杜修智，趙秀云*

(1.華中農(nóng)業(yè)大學農(nóng)業(yè)微生物國家重點實驗室，武漢 430070；2.湖北省煙草科研所，武漢 430030；3.湖北省襄陽市煙草公司，湖北 襄陽 441003)

篩選誘導煙草對煙草花葉病毒產(chǎn)生系統(tǒng)抗性的真菌

李娜1，李錫宏2，許汝冰2，薛守聰1，郭利3，任加慶1，霍瑞1，王曉麗3，杜修智3，趙秀云1*

(1.華中農(nóng)業(yè)大學農(nóng)業(yè)微生物國家重點實驗室，武漢 430070；2.湖北省煙草科研所，武漢 430030；3.湖北省襄陽市煙草公司，湖北 襄陽 441003)

真菌產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物可激活煙草體內(nèi)抗病防御相兲酶的表達，誘導煙草產(chǎn)生系統(tǒng)抗性，增強煙草對病毒的抗性。本研究對 38 種植物病原真菌及 45 種分離自（恩施、襄樊）土壤、煙葉中的真菌進行了過敏性反應實驗和系統(tǒng)抗性實驗。結(jié)果表明，篩選出了對煙草花葉病毒抗性較強的真菌。在煙草上產(chǎn)生過敏反應的菌株有 32個；系統(tǒng)抗性實驗中對煙草花葉病毒抑制率較高的菌株有 16 個，其中，油茶炭疽菌、棉花黃萎病菌、esf-13、esf-3、小麥赤霉、立枯絲核菌、E1、esf-6、xfpf-6等菌株的抗性較高，枯斑抑制率均大于 70%，最高可達 96.44%。抗性較高的真菌可開發(fā)為煙草病毒病誘抗劑。

煙草；花葉病毒；真菌；過敏性反應；系統(tǒng)抗性；枯斑抑制率

煙草病毒病是引起煙草產(chǎn)量損失的重要病害。煙草普通花葉病毒(Tobacco mosaic virus, TMV)是煙草上一種主要病毒，具有極為廣泛的宿主范圍(超過 350 種植物)，全世界每年由 TMV 造成的損失就達一億美元以上[1-2]。目前，主要施用化學藥劑控制煙草病毒病，但化學藥劑防治煙草病毒病的效果極其有限，而長期使用化學農(nóng)藥，使環(huán)境受到嚴重污染，農(nóng)藥殘留對人畜造成較大危害[3]。目前，尚無理想的抗病毒藥劑。生物防治具有無毒、無害、無污染、高效且不產(chǎn)生抗藥性等優(yōu)點，成為開發(fā)和研究的熱點[4]。從真菌代謝產(chǎn)物中尋找能誘導煙草對病毒病產(chǎn)生抗性的真菌激發(fā)子，提高煙草抗病毒病能力，是防治病毒病的新途徑。

自然界真菌資源豐富，本研究擬從長勢良好的健康煙草根際土壤中分離真菌、同時廣泛收集植物病原真菌，從這些真菌中篩選能誘導煙草對 TMV產(chǎn)生系統(tǒng)抗性的真菌。獲得能誘導煙草產(chǎn)生過敏性反應，同時可誘導煙草對 TMV 產(chǎn)生系統(tǒng)抗性，有抗病毒效果的菌株。開發(fā)病毒誘抗劑，用于煙草花葉病毒的控制，促進煙草生長和提高煙草品質(zhì)，為煙草生產(chǎn)提供一種新的抗病毒生物制劑。

1 材料與方法

1.1 材料

過敏性反應實驗采用心葉煙和云煙 87。系統(tǒng)抗性實驗采用心葉煙(中國農(nóng)科院煙草研究所提供)，普通煙種子由華中農(nóng)業(yè)大學植物科學技術(shù)學院提供。過敏性反應實驗和系統(tǒng)抗性實驗于 2013 年 4—9月在華中農(nóng)業(yè)大學溫室內(nèi)進行。

煙草普通花葉病毒(TMV)由中國農(nóng)業(yè)科學院煙草研究所提供，保存在云煙 87上。

石英砂(分析純 AR)、氯化鈉(分析純 AR)、氯化鉀(分析純 AR)、磷酸二氫鉀(分析純 AR)、磷酸氫二鉀(分析純 AR)、蔗糖(分析純 AR)、瓊脂粉、鏈霉素等。2013 年 3月煙田土壤采集信息如表1所示。

實驗室共保存植物病原真菌菌株 38 種，其中24 種已知病菌真菌見表 2。E1、E2、E3、E4、E5、E6、E7、E8、t2、E9、E10、F4、E11 為未鑒定的植物病原真菌。C1為恩施土壤中分離未鑒定菌株。

表1 土壤采集信息Table 1 The collection message of soil

表2 植物病原真菌Table 2 The plant pathogen fungi

1.2方法

將真菌進行液體發(fā)酵，用接種環(huán)挑取少量真菌菌絲于馬鈴薯蔗糖液體培養(yǎng)基中，在 25 ℃，轉(zhuǎn)速為 200 r/min 的搖床中恒溫振蕩培養(yǎng) 1 周。收集真菌發(fā)酵液，用 4 層紗布進行過濾，過濾液于 4 ℃，3000 r/min 離心 10 min，去除沉淀，收集上清液，進行過敏性反應和系統(tǒng)抗性實驗。

取感染 TMV 的云煙 87 病葉，按照 1:40(W/V)的比例加入 0.01 mol/L 的 PBS 磷酸鹽緩沖液(pH 7.2)，在研缽中加入少量石英砂進行研磨，研磨后用4層紗布過濾，收集濾液，獲得煙草花葉病毒汁液。

按照如下公式計算枯斑抑制率:

枯斑面積抑制率=(對照組枯斑面積占葉片總面積百分比-實驗組枯斑面積占葉片總面積百分比)/對照組枯斑面積占葉片總面積百分比×100%

枯斑數(shù)量抑制率=(對照組平均每片葉子枯斑總數(shù)量-實驗組平均每片葉子枯斑總數(shù)量)/對照組平均每片葉子枯斑總數(shù)量×100%

2 結(jié) 果

2.1 土壤真菌和煙葉真菌的分離

按照上述方法對恩施土樣、襄樊平原土壤、襄樊山地土壤和煙葉中的真菌進行稀釋涂布分離。恩施土壤中分離的真菌編號為 esf-1～esf-13、襄樊平原土壤中分離的真菌編號為 xfpf-1～xfpf-12、襄樊山地土壤中分離的真菌編號為 xfsf-1～xfsf-17，煙葉中分離的真菌編號為 xfyf-1～xfyf-5。共分離到了 45 株真菌。部分真菌培養(yǎng)形態(tài)如圖1所示。

圖1 部分分離的真菌形態(tài)Fig. 1 Morphology of some isolated fungi

2.2 過敏性反應

產(chǎn)生明顯過敏性反應的真菌共有 32 個菌株，包括:C1、E1、T2、E2、辣椒灰霉病菌、辣椒炭疽病菌、立枯絲核菌、小麥赤霉病菌、棉花黃萎病菌、esf-1、esf-3、esf-6、esf-13、E11、棉花枯萎病菌、蘋果輪紋病菌、F4、E4、赤星病菌、xfsf-8、xfsf-10、xfsf-11、xfsf-12、xfsf-16、xfsf-17、xfyf-3、xfyf-6、xfyf-8、xfpf-4、xfpf-6、xfpf-8 和 xfpf-10。典型過敏性反應產(chǎn)生的過敏斑如圖2所示。

在上述能誘導煙草產(chǎn)生明顯過敏性反應的真菌中，C1、E1、E2、辣椒灰霉病菌、立枯絲核菌、小麥赤霉病菌、棉花黃萎病菌、esf-1、esf-3、esf-5、esf-13 在第 1 天就可出現(xiàn)過敏斑。T2、xfpf-6、xfpf-10、xfsf-1、xfsf-2、xfsf-5、xfsf-8、xfsf-16 在注射部位產(chǎn)生的過敏斑為黃色，E2、esf-3、F4、xfpf-4、xfpf-8、xfsf-12、xfsf-17、xfsf-6 在注射部位形成的過敏斑略小于其他真菌。

2.3 系統(tǒng)抗性

對上述能誘導煙草產(chǎn)生過敏性反應的真菌進行系統(tǒng)抗性實驗。共有 28 種真菌對煙草花葉病毒產(chǎn)生系統(tǒng)誘導抗性，結(jié)果如表 3 所示，其中 esf-3菌株的枯斑面積抑制率最高，為 96.44%。esf-6 菌株的抑制率次之，為 79.04%。這些真菌對病毒的抑制率多集中在 50%～80%。

圖2 真菌發(fā)酵液產(chǎn)生的過敏性反應Fig. 2 Allergic reaction produced by fermentation broth of fungi

由表3可知，通過過敏性反應實驗篩選的真菌絕大多數(shù)都對煙草花葉病毒有一定的抗性，但 E5和棉花枯萎病菌，不僅對煙草花葉病毒沒有抗性，反而促進了病毒對植物的入侵，其原因還有待于進一步的分析。

在檢測的病原真菌和土壤真菌中，對煙草花葉病毒的枯斑數(shù)抑制率超過 50%的僅有立枯絲核菌和 esf-6，但多個真菌對病毒產(chǎn)生的枯斑面積抑制率超過了 50%，包括:E11、esf-1、辣椒灰霉病菌、C1、辣椒炭疽病菌、油茶炭疽病菌、棉花黃萎病菌、esf-13、esf-3、小麥赤霉病菌、立枯絲核菌、E1、esf-6、蘋果輪紋病菌、xfpf-4、xfpf-6、xfsf-8 和 xfpf-8。

對煙草花葉病毒枯斑面積抑制率高的真菌，其枯斑數(shù)抑制率也較高，如 esf-6、立枯絲核菌、E1，推測這些菌株既能抑制病毒的侵染，也能抑制病毒的復制。E1系統(tǒng)抗性實驗效果如圖 3所示，A圖為接病毒 24 h 后用真菌發(fā)酵液處理的葉片，B 圖為清水對照?？梢钥吹?，處理組的枯斑數(shù)量明顯減少，枯斑面積也較對照組顯著減少。

表3 各真菌對煙草花葉病毒的抑制率 %Table 3 Inhibition rate to TMV of each fungi

圖3 E1 誘導煙草對 TMV 的系統(tǒng)抗性Fig. 3 The systemic resistance of tobacco against TMV induced by E1

3 討 論

目前，已經(jīng)有很多關(guān)于不同種類的真菌、細菌、放線菌以及它們產(chǎn)生的次級代謝產(chǎn)物能夠抑制病毒活性的報道，有些微生物及其代謝產(chǎn)物(如嘧肽霉素、寧南霉素)已經(jīng)進入大規(guī)模應用階段[5]。19世紀 50 年代前人報道稱，從一些真菌中分離出高分子化合物和抗生素，可對煙草普通花葉病毒(TMV)起到一定的抑制和鈍化作用，這些真菌包括黑根霉、藍綠邊青霉、亮白曲霉、哈茨木霉、立枯絲核、果生核盤菌等。19 世紀 90 年代，有報道香菇的培養(yǎng)水浸液和抽提物都能對煙草花葉病毒起到一定的抑制作用[6]，抗病毒活性成分為葡萄糖、甘露糖、半乳糖、吡喃糖和 15種氨基酸組成的復合物[7]。從杏鮑菇中分離得到的多個蛋白組分對煙草花葉病毒都有拮抗作用，抑制率均高于 70%，最高可達到 99%[8]。

這些具有抗病毒效果的物質(zhì)能夠引發(fā)植物一系列的生理生化反應，誘發(fā)植物的抗性和防御反應，稱為激發(fā)子(elicitor)[9-11]。 激發(fā)子作為植物誘抗因子用于植物病害的生物防治日益受到重視。激發(fā)子來源廣泛，不同種類的細菌、真菌、植物與病原菌互作后均能產(chǎn)生不同類型的激發(fā)子[12]。從多種病原真菌如稻瘟菌(Magnaporthe grisea)、交鏈孢菌(Alternaria sp.)、黃曲霉菌(Aspergillus sp.)、葡萄孢菌(Botrytis sp.)等分離到一系列的蛋白激發(fā)子[13-14]。病原真菌產(chǎn)生的激發(fā)子可誘導植物產(chǎn)生過敏性反應，引起感染部位的植物組織快速壞死，把病菌限制在其中，導致病菌死亡，病害不能發(fā)展。過敏反應不僅是一種抗病反應，同時也誘導植物產(chǎn)生系統(tǒng)抗性。激發(fā)子誘導植物產(chǎn)生系統(tǒng)抗性后，植物體內(nèi)抗性相關(guān)的酶活性增強，木質(zhì)素含量提高，抗性基因上調(diào)表達[15-18]。真菌激發(fā)子誘導植物產(chǎn)生系統(tǒng)抗性后，表現(xiàn)出抗病毒的作用。我們首先篩選能誘導煙草產(chǎn)生過敏性反應的抗性真菌，進一步通過系統(tǒng)抗性實驗，篩選出對煙草花葉病毒有良好抗性的 9種真菌，枯斑抑制率均在 70%以上。該方法可快速有效地篩選出對煙草病毒抗性效果好的真菌，且實驗結(jié)果明顯易觀察，是一種篩選抗病毒制劑的有效方法。

文獻報道從棉花黃萎病菌(V. dahliae)中分離出了一種蛋白激發(fā)子[19]。赤霉菌(G. subinetti)、立枯絲核菌(R. solani)的代謝物質(zhì)有抑制或鈍化 TMV的能力[2]，但相關(guān)抗性物質(zhì)尚未分離和鑒定，其作用機理也不清楚。我們對棉花黃萎病菌、赤霉菌和立枯絲核菌以及土壤真菌的發(fā)酵液誘導煙草的系統(tǒng)抗性進行了初步的研究，并將進一步鑒定土壤真菌的種屬地位、分析激發(fā)子的結(jié)構(gòu)和化學組成。

4 結(jié) 論

本研究通過過敏性實驗和系統(tǒng)抗性實驗，篩選了多株對煙草普通花葉病毒有較好誘導抗性的真菌:E4、辣椒灰霉、C1、油茶炭疽、棉花黃萎、esf-13、esf-3、小麥赤霉、立枯絲核、E1、esf-6、蘋果輪紋菌、xfpf-6?？蛇M一步從其代謝產(chǎn)物中分離激發(fā)子或誘導物，通過測定抗病防御相關(guān)酶活性的變化、抗病標志基因表達量的變化以及 SA 等信號分子含量的變化來研究激發(fā)子誘導植物抗病防衛(wèi)反應產(chǎn)生的分子機理和信號途徑，從而尋找和挖掘新的抗植物病毒物質(zhì)。將有利于擴大植物病毒抑制物的篩選譜，獲得新的抗植物病毒抑制物，為研制具有自主知識產(chǎn)權(quán)的新型多功能藥物打下良好的基礎(chǔ)，促進我國生物農(nóng)藥的研究開發(fā)。參考文獻

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Selecting Fungi Which Can Induce Tobacco Creating Systemic Resistance against Tobacco Mosaic Virus

LI Na1, LI Xihong2, XU Rubing2, XUE Shoucong1, Guo Li3, REN Jiaqing1, Huo Rui1, WANG Xiaoli3, DU Xiuzhi3, ZHAO Xiuyun1*
(1. State Key Laboratory of Agricultural Microbiology, Huazhong Agricultural University,Wuhan 430070 China; 2. Tobacco Research Institute of Hubei Province, Wuhan 430030, China; 3. Xiangyang Tobacco Company of Hubei Province, Xiangyang, Hubei 441003, China)

Fungi could produce a large number of metabolites, which can activate the expression of relevant enzymes in tobacco, which will induce tobacco creating systemic resistance and help against tobacco virus.We have selected 38 kinds of pathogenic fungi and 45 kinds of fungi separated from the tobacco leaf and the soil of enshi, xiangfan through the experiments of allergic reaction and systemic resistance. There are 32 fungi which can produce hypersensitive response, and 16 of them can inhibit against tobacco mosaic virus. Among these fungi, the highest ability of resistance to tobacco mosaic virus are Colletotrichum camelliae, Verticillium dahliae, esf-13, esf-3, Fusarium graminearum, Rhizoctonia solani, E1, esf-6 and xfpf-6. The percentage of lesion inhibition are greater than 70%,with a highest inhibition rate at 96.44%. These fungi with high activity will be used as resistance inducer against tobacco virus.

tobacco; TMV; fungi; hypersensitive response; induced systemic resistance; percentage of lesion inhibition

S572.08

1007-5119（2014）04-0079-06 DOI：10.13496/j.issn.1007-5119.2014.04.015

湖北省煙草公司科技項目“煙草主要病毒病快速檢測及防控新技術(shù)研究集成與示范”(027Y2013-006)

李 娜，女，碩士，研究方向為生物防治。E-mail:13476268782@163.com。*通信作者，E-mail:xiuyunzh@mail.hzau.edu.cn

2013-10-10

2014-03-07