馬里蘭煙病毒病癥狀類型、毒源種類及病毒侵染構(gòu)型研究

許汝冰，李錫宏*，雎韡，文光紅，劉圣高，黎妍妍，侯明生

(1.湖北省煙草科研所，武漢 430030；2.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)植物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，武漢 430070；3.宜昌市煙草公司，湖北 宜昌 443000)

馬里蘭煙病毒病癥狀類型、毒源種類及病毒侵染構(gòu)型研究

許汝冰1，李錫宏1*，雎韡2，文光紅3，劉圣高3，黎妍妍1，侯明生2

(1.湖北省煙草科研所，武漢 430030；2.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)植物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，武漢 430070；3.宜昌市煙草公司，湖北 宜昌 443000)

湖北五峰縣是中國(guó)唯一的馬里蘭煙種植區(qū)。2011 年在湖北馬里蘭煙產(chǎn)區(qū)進(jìn)行病毒病發(fā)生情況大田調(diào)查，發(fā)現(xiàn)主要有花葉、畸形、脈壞死、蝕刻等 4種癥狀類型，幵采用指示植物法對(duì)主要癥狀類型所含病毒的種類進(jìn)行了鑒定；對(duì)采集的57 份病毒病樣本采用 DAS-ELISA 進(jìn)行病毒種類的鑒定。結(jié)果表明，發(fā)生在馬里蘭煙上的煙草病毒種類包括 TMV、CMV、PVX、PVY 和 TEV，TMV 檢出率最高，PVY 次之；以 2 種或 2 種以上病毒復(fù)合侵染方式為主，其中 TMV+PVY、TMV+CMV+PVY共存方式較為常見。

馬里蘭煙；煙草病毒?。话Y狀；病毒種類鑒定；病毒侵染構(gòu)型

馬里蘭煙是淡色晾煙，屬紅花煙草，因其填充力強(qiáng)，具有陰燃性好和中等芳香的特點(diǎn)，是低焦油混合型卷煙的重要原料，有廣闊的開發(fā)前景[1]。在中國(guó)，湖北五峰土家族自治縣是全國(guó)唯一的馬里蘭煙原料基地，在馬里蘭煙的種植、采收和晾曬等方面都享有相當(dāng)獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，一直為“中南海”等混合型卷煙品牌提供優(yōu)質(zhì)原料支撐。

在煙葉生產(chǎn)實(shí)際中，煙草病毒病的危害最為嚴(yán)重，造成的經(jīng)濟(jì)損失占所有煙草病害損失的一半以上，對(duì)馬里蘭煙的生產(chǎn)具有極大的威脅。因此，了解和掌握馬里蘭煙區(qū)煙草病毒病癥狀類型、病毒種類及病毒侵染方式，對(duì)于指導(dǎo)馬里蘭煙區(qū)煙草病毒病綜合防治具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料

煙草病毒種類鑒定的樣本于 2011 年采自宜昌五峰縣有典型煙草病毒病危害的田塊，采用5點(diǎn)隨機(jī)取樣法，品種為馬里蘭煙 MD609，共采集病毒樣本 57份。

指 示 植 物 普 通 煙 (Nicotiana tabacum cv. NC89)、心葉煙(N. glutinosa)、白肋煙(N. tabacum cv.)、黃瓜(Cucumis sativus)、洋酸漿(Physalis floridana)、 豇 豆 (Vigna sinensis)、 昆 諾 藜(Chenopodium quinoa)、 辣 椒 (Capsicum frutescens)、番茄(Lycopersicon esculentum)、甜瓜(Cucumis melo)。

抗血清 TMV、CMV、PVX、PVY、TEV購自安德珍生物技術(shù)(北京)有限公司，包被緩沖液、洗脫緩沖液(PBST)、常規(guī)提取緩沖液、酶標(biāo)緩沖液、底物緩沖液按照安德珍生物技術(shù)(北京)有限公司提供的配方配制。

1.2 方法

2 結(jié) 果

2.1 馬里蘭煙病毒病癥狀類型及毒源種類推測(cè)

對(duì)采集的 57 份病毒病樣品癥狀進(jìn)行歸類，主要分為花葉、畸形、脈壞死、蝕刻等4種類型，分別為花葉 47 份，畸形 29 份，脈壞死 8 份，蝕刻 11份，其他不常見的癥狀如明脈、閃電斑、皰斑等癥狀的樣本 11 份，分別占采集樣本總數(shù)的 82.46%、50.88%、14.04%、19.30%、19.30%，并以 2 種或 2種以上癥狀的復(fù)合表現(xiàn)為主。

用指示植物法對(duì)花葉、畸形、脈壞死、蝕刻等主要4種癥狀進(jìn)行病毒種類鑒定，花葉型和畸形在指示植物上的癥狀表現(xiàn)基本相同，脈壞死型和蝕刻型在煙草上癥狀表現(xiàn)差異較大，在其他寄主植物上的癥狀表現(xiàn)相似(表 1)。根據(jù)結(jié)果，參照文獻(xiàn)[4-5]，推斷可能含有的病毒種類有 TMV、CMV、PVY、TEV。

表1 不同類型煙草病毒病樣本在鑒別寄主上的癥狀Table 1 The symptoms of different kinds of tobacco virus diseases on the identification hosts

2.2 病毒種類 DAS-ELISA 鑒定

采用雙抗體夾心法(DAS-ELISA)對(duì)五峰馬里蘭煙煙草病毒病樣本進(jìn)行病毒種類鑒定(表 2)。結(jié)果表明，在采集的五峰馬里蘭煙病毒病樣本中，檢出的病毒種類包含TMV、CMV、PVX、PVY和 TEV，其檢出率分別為 100%、29.8%、36.8%、94.7%、21.1%，TMV 為優(yōu)勢(shì)毒源，PVY 為次優(yōu)勢(shì)毒源。

2.3 病毒侵染構(gòu)型分析

根據(jù)病毒種類鑒定結(jié)果，對(duì)病毒侵染構(gòu)型進(jìn)行統(tǒng)計(jì)(表 3)。在病毒侵染構(gòu)型上，具有單一侵染和復(fù)合侵染2種方式，在采集的病毒病樣本中，單一病毒侵染的樣本比例很小，僅1例，占總樣本數(shù)的1.75%，復(fù)合侵染的樣本有 56 份，占總樣本數(shù)的98.25%；在病毒復(fù)合侵染方式上，分為 TMV+PVY、TMV+PVX、TMV+CMV+PVY、TMV+PVX+ PVY、TMV+PVY+TEV、TMV+CMV+PVX+ PVY、TMV+PVX+PVY+TEV，共 7 種，占總檢測(cè)樣本數(shù)的比例分別為 29.82%、3.51%、21.05%、14.04%、10.53%、8.77%、10.53%。

表2 馬里蘭煙病毒病毒源種類的 DAS-ELISA 結(jié)果Table 2 The identification results of DAS-ELISA of kinds of tobacco virus diseases of Maryland tobacco

表3 馬里蘭煙病毒病侵染構(gòu)型Table 3 The types of infection of virus diseases of Maryland tobacco

3 討 論

我國(guó)自 80 年代初引進(jìn)馬里蘭煙，曾在吉林、河南、安徽、湖北等省試種，湖北省五峰縣試種成功，并常年種植 500 hm2左右[1]。目前，五峰縣是我國(guó)唯一的馬里蘭煙生產(chǎn)基地，積極開發(fā)馬里蘭煙的生產(chǎn)，對(duì)煙草病害，尤其是煙草病毒病的普查尤為重要。2011 年對(duì)五峰縣馬里蘭煙區(qū)大田調(diào)查，發(fā)現(xiàn)煙草病毒病癥狀典型，表現(xiàn)多樣，以花葉、畸形癥狀最為常見，且多伴隨脈壞死、蝕刻、明脈、皰斑等病狀，隨后采用指示植物法對(duì)出現(xiàn)最多的花葉型、畸形、脈壞死型和蝕刻型可能所含的病毒種類進(jìn)行了鑒定，推斷可能含有的病毒種類為 TMV、CMV、PVY 和 TEV；在室內(nèi)對(duì)采集的 57 份病毒病樣本進(jìn)行了血清學(xué)檢測(cè)(選用 DAS-ELISA)，檢測(cè)出的病毒種類有 TMV、CMV、PVX、PVY 和 TEV 5 種，TMV 檢出率最高，復(fù)合侵染檢出率達(dá) 98.25%，共有7種復(fù)合侵染類型。

近年來隨著煙草連作障礙的影響，煙草病毒病發(fā)病情況愈發(fā)復(fù)雜，病毒病的危害逐漸加重，癥狀表現(xiàn)復(fù)雜化[6]。要針對(duì)性制定馬里蘭煙區(qū)病毒病綜合防治策略，除了增加檢測(cè)樣本的數(shù)量，將指示植物法、血清學(xué)檢測(cè)、電子顯微技術(shù)、分子生物學(xué)等病毒檢測(cè)手段有機(jī)結(jié)合，保證檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確和高效[7]，還需要從病毒侵染循環(huán)、介體傳播方式等方面進(jìn)行深入研究。

4 結(jié) 論

對(duì)湖北五峰馬里蘭煙區(qū)煙草病毒病的發(fā)生情況進(jìn)行大田調(diào)查，初步明確馬里蘭煙區(qū)煙草病毒病的癥狀類型、病毒種類及病毒侵染方式，并在馬里蘭煙上首次檢測(cè)出了省級(jí)檢疫病毒——煙草蝕紋病毒，為今后馬里蘭煙區(qū)煙草病毒病綜合防治措施的制定提供更多的理論依據(jù)。

[1]蔣予恩，戴培剛，趙傳良，等．開發(fā)馬里蘭煙，促進(jìn)低焦油卷煙發(fā)展[J]. 中國(guó)煙草科學(xué)，2000，21(2): 47-48.

[2]熊克娟，李天憲，陳繩亮，等．常見植物病毒冷凍干燥方法的改進(jìn)與效果觀察[J]. 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，1999，18(2):151-153.

[3]鄭世玲．貴州 3 種馬鈴薯病毒的 DAS-ELISA 檢測(cè)及分子鑒定[D]. 貴陽:貴州大學(xué)，2007.

[4]田波，裴美云．植物病毒研究方法[M]. 北京:科學(xué)出版社，1987:4-9.

[5]王勁波，王鳳龍，錢玉梅，等．山東煙區(qū)主要病毒的株系鑒定[J]. 中國(guó)煙草學(xué)報(bào)，1998(4):24-32.

[6]劉聯(lián)仁．煙草病蟲害防治[M]. 北京:科學(xué)出版社，1998.

[7]翟玉俊，劉紅海，李星亮，等．煙草病毒檢測(cè)技術(shù)研究進(jìn)展[J]. 農(nóng)產(chǎn)品加工學(xué)刊，2009(4):83-88.

Classification of Virus Disease Symptoms, Kinds of Virus Species and Types of Infection of Virus on Maryland Tobacco

XU Rubing1, LI Xihong1*, JU Wei2, WEN Guanghong3, LIU Shenggao3, LI Yanyan1, HOU Mingsheng2
(1. Tobacco Research Institute of Hubei Province, Wuhan 430030, China; 2. Huazhong Agricultural University, Wuhan 430070, China; 3. Yichang Tobacco Company of Hubei Province, Yichang, Hubei 443000, China)

Wufeng county in Hubei province is the only Maryland tobacco planting area in China. Maryland tobacco virus diseases were investigated there in 2011. The symptom types of virus diseases could be divided into 4 main kinds, including mosaic, distortion, vein necrosis, etching, which were identified through indication plants for virus species. DAS-ELISA was applied to identify the virus species to the collected 57 samples. It demonstrated that the virus species which infected Maryland tobacco included TMV, CMV, PVX, PVY and TEV. The detection rate of TMV was maximal among all the tested samples, and PVY took the second place. Meanwhile it commonly occurred that two and more kinds of virus co-existed, and TMV+PVY, TMV+CMV+PVY were the main patterns.

Maryland tobacco; tobacco virus disease; symptom; identification of virus species; types of infection of virus

S572.08

1007-5119（2014）04-0085-03 DOI：10.13496/j.issn.1007-5119.2014.04.016

國(guó)家煙草專賣局項(xiàng)目“全國(guó)煙草有害生物調(diào)查研究”(110200902065)；湖北省煙草專賣局重大攻關(guān)項(xiàng)目“湖北煙草有害生物調(diào)查及綜防預(yù)警網(wǎng)絡(luò)平臺(tái)體系建設(shè)(027Y2010-32)

許汝冰，男，農(nóng)藝師，主要從事煙草植物保護(hù)。E-mail:kubingbing@163.com。*通信作者，E-mail:lxh885@126.com

2013-07-15

2013-12-03