密蒙花黃色素性質(zhì)研究

楊勝遠(yuǎn)，李卓文，賴演蓮，方曉旋，陳曉屏，楊娜

（韓山師范學(xué)院生物學(xué)系，廣東潮州521041）

密蒙花黃色素性質(zhì)研究

楊勝遠(yuǎn)，李卓文，賴演蓮，方曉旋，陳曉屏，楊娜

（韓山師范學(xué)院生物學(xué)系，廣東潮州521041）

對密蒙花黃色素的性質(zhì)進(jìn)行了研究。結(jié)果表明，密蒙花黃色素易溶于水，難溶于石油醚，在不同溶劑中的溶解性為水＞無水乙醇＞丙酮＞石油醚。密蒙花黃色素在4、30℃、pH4.92～9.18范圍內(nèi)穩(wěn)定，但高溫、光和EDTA對其色價有一定影響。密蒙花黃色素具有較強(qiáng)DPPH自由基清除能力，每毫克密蒙花黃色素與10.01μg Trolox自由基清除能力相當(dāng)。在10 g/L的濃度下，密蒙花黃色素對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽胞桿菌、副溶血性弧菌、釀酒酵母、匍枝根霉、黑曲霉和桔青霉均沒有抗菌活性。

密蒙花；黃色素；性質(zhì)

食用色素主要用于改善食品色調(diào)和色澤，在提高食品感官品質(zhì)、增進(jìn)食欲等方面具有重要作用。合成色素具有品質(zhì)均一、色澤鮮艷、著色力強(qiáng)、穩(wěn)定性好、無臭無味、易于溶解和拼色的優(yōu)點(diǎn)，在食品加工業(yè)曾被廣泛采用，然而合成色素具有潛在危險性，一些國家相繼制定了一系列限制合成色素使用的法規(guī)，發(fā)達(dá)國家則禁止使用合成色素。因此，亟待開發(fā)安全性高的天然食用色素。

密蒙花（Buddleja officinalis Maxim）別名黃飯花、小錦花、蒙花、疙瘩皮樹花、雞骨頭花、羊耳朵等，為雙子葉植物藥馬錢科（Loganiaceae）醉魚草屬（Buddleja）植物密蒙花的花序，分布于福建、廣東、廣西、湖南、安徽、湖北、四川、貴州、云南、陜西、甘肅等地，含有豐富的黃酮類化合物和藏紅花甙，有清肝利尿、明目退熱、抗菌消炎、鎮(zhèn)靜止咳之功效[1-2]，在中國西南壯族、布依族、傣族及漢族地區(qū)常用它作食品染色劑，以其制作的黃色米飯色澤鮮亮、自然，具有密蒙花花朵的清香[3]。民間的長期食用實踐和現(xiàn)代毒理學(xué)研究[4]均表明密蒙花黃色素具有極高的安全性，是一種最有希望的天然植物黃色素。

本文旨在對密蒙花黃色素的性質(zhì)進(jìn)行探討，以期為密蒙花黃色素的應(yīng)用提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

密蒙花花序采自廣西田林縣潞城鎮(zhèn)，曬干后備用；大腸桿菌（Escherichia coli）、金黃色葡萄球菌（Staphyloccocus aureus）、枯草芽胞桿菌（Bacillus subtilis）、副溶血性弧菌（Vibrio Parahemolyticus）、釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）、匍枝根霉（Rhizopus stolonifer）、黑曲霉（Aspergillus niger）和桔青霉（Penicillium citrinum）均為韓山師范學(xué)院食品與發(fā)酵研究所保藏菌種；2，2–二苯基–1–苦肼基（2，2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl，DPPH），奎諾二甲基丙烯酸酯（（±）-6-Hydroxy-2，5，7，8-tetramethylchromane-2-carboxylic acid，Trolox），購自美國Sigma公司，編號分別為D9132和238813；其余化學(xué)藥品或試劑均為國產(chǎn)分析純試劑。

1.2 儀器

UV-2450紫外-可見分光光度計：日本Shimadzu公司生產(chǎn)。

1.3 培養(yǎng)基

細(xì)菌采用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基[5]；霉菌采用PDA培養(yǎng)基[5]；酵母采用YPD培養(yǎng)基[6]；副溶血性弧菌采用3％氯化鈉堿性蛋白胨水（APW）[7]。

1.4 方法

1.4.1 原料處理

將密蒙花花序的花于50℃熱風(fēng)烘干，粉碎后過60目篩密閉保存。

1.4.2 密蒙花黃色素的制備

稱取密蒙花10 g于圓底燒瓶中，加入70％乙醇200mL，在瓶口接上冷凝管，然后于60℃冷凝回流浸提15min，冷卻后減壓抽濾，濾液于55℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮后進(jìn)行冷凍干燥，置于變色硅膠干燥器恢復(fù)至常溫備用。

1.4.3 密蒙花黃色素色價測定

參照文獻(xiàn)[8]修改后進(jìn)行測定。稱取待測天然色素樣品0.1 g，用50％乙醇溶解并定容至100mL，然后以50％乙醇進(jìn)行適當(dāng)稀釋，再用1 cm比色皿，以50％乙醇溶液做參比，于435 nm測定稀釋液的吸光值A(chǔ)，然后按①式進(jìn)行計算色價：

式中：E1cm435 nm為密蒙花黃色素在435 nm處測定的色價，（U/g）；A為密蒙花黃色素稀釋液在435 nm處的吸收值；V為密蒙花黃色素溶液的體積，mL；f為密蒙花黃色素溶液的稀釋倍數(shù)；m為密蒙花黃色素的質(zhì)量，g。

1.4.4 密蒙花黃色素溶解性

稱取100mg黃色素于帶塞試管，分別加入1mL蒸餾水、無水乙醇、丙酮、石油醚，旋渦混勻2min，常溫放置30min，觀察溶解情況。

1.4.5 光線對密蒙花黃色素穩(wěn)定性的影響

將密蒙花黃色素溶于蒸餾水配制成1 g/L溶液，于4℃冰箱保存，間隔5天取樣，適當(dāng)稀釋后于435 nm測定吸收值A(chǔ)，并換算為色價。

1.4.6 溫度對密蒙花黃色素穩(wěn)定性的影響

將密蒙花黃色素溶于蒸餾水配制成濃度為1 g/L溶液，分別于4、30、80℃保溫，間隔2 h取樣，適當(dāng)稀釋后于435 nm測定吸收值A(chǔ)，并換算為色價。

1.4.7 pH對密蒙花黃色素穩(wěn)定性的影響

將密蒙花黃色素分別溶于蒸餾水、pH4.92和pH9.18磷酸鹽緩沖液（1/15mol/L）配制成濃度為1 g/L溶液，于80℃保溫，間隔2 h取樣，用相應(yīng)溶劑進(jìn)行適當(dāng)稀釋，然后以相應(yīng)溶劑作為參比于435 nm測定吸收值A(chǔ)，并換算為色價。

1.4.8 EDTA對密蒙花黃色素穩(wěn)定性的影響

將密蒙花黃色素溶于蒸餾水配制成濃度為1 g/L溶液，分別取40mL與10mL蒸餾水、10mLEDTA溶液（500mg/L）混勻，于4℃冰箱保存，間隔5 d取樣，適當(dāng)稀釋后于435 nm測定吸收值A(chǔ)，并換算為色價。

1.4.9 密蒙花黃色素清除DPPH自由基活性測定

DPPH自由基清除實驗加樣情況見表1。

表1 DPPH自由基清除實驗加樣表Table1 Sample table of radical DPPH·scavenging activity assay

參照文獻(xiàn)[9]略作修改后進(jìn)行測定。用蒸餾水配制1 g/L密蒙花黃色素溶液，用50％乙醇配制200μmol/L DPPH溶液和濃度分別為20、40、60、80、100μmol/L的Trolox溶液，然后按表1加樣，加入DPPH液之后，常溫反應(yīng)在20min，測定520 nm的吸光值A(chǔ)。

通過（2）式計算Trolox溶液和密蒙花黃色素樣品液的自由基清除率，以Trolox濃度為橫坐標(biāo)，自由基清除率為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。通過計算得到的密蒙花黃色素樣品液的自由基清除率，在標(biāo)準(zhǔn)曲線上找出其相對應(yīng)的Trolox濃度，可換算成Trolox當(dāng)量（μg/mg），表述為每毫克密蒙花黃色素（干基）相當(dāng)于Trolox的微克數(shù)。

1.4.10 密蒙花黃色素抗菌活性測定

將密蒙花黃色素配制成10 g/L水溶液，然后采用管碟法[10]測定其對靶菌的抑菌活性。用游標(biāo)卡尺測抑菌圈的直徑，以抑菌圈直徑表示抗菌活性。供試靶細(xì)菌、酵母及霉菌孢子密度均大于108CFU/mL，細(xì)菌于37℃培養(yǎng)24 h，酵母和霉菌于30℃培養(yǎng)60 h。

2 結(jié)果

2.1 密蒙花黃色素溶解性

經(jīng)對密蒙花黃色素在不同溶劑中的溶解性進(jìn)行考察，結(jié)果表明：100mg密蒙花黃色素在1mL不同溶劑中溶解程度為水＞無水乙醇＞丙酮＞石油醚，黃色素易溶于水，全部溶解，而在石油醚中幾乎不溶，石油醚無黃色。該結(jié)果與文獻(xiàn)[11]研究結(jié)果相符。

2.2 光線對密蒙花黃色素穩(wěn)定性的影響

光線對密蒙花黃色素穩(wěn)定性的影響見圖1。

圖1 光對密蒙花黃色素穩(wěn)定性的影響Fig.1 Effect of light on the stability of Buddleja officinalis yellow pigments

將密蒙花黃色素水溶液（pH為4.79）于自然光下貯存（4℃），結(jié)果密蒙花黃色素在前5天，色價有所下降，然后趨于穩(wěn)定（圖1）。

文獻(xiàn)[11]研究表明密蒙花黃色素在pH4～7時對自然光穩(wěn)定，而文獻(xiàn)[12]認(rèn)為密蒙花黃色素溶液在pH7.0和pH9.0時對日光具有較高的穩(wěn)定性，但在pH4.0時對日光的穩(wěn)定性較差。本文結(jié)果與文獻(xiàn)[11-12]略有差異，可能由于密蒙花黃色素中的不同成分對光的穩(wěn)定性不一致，因此出現(xiàn)色價先降后穩(wěn)定的現(xiàn)象。

2.3 溫度對密蒙花黃色素穩(wěn)定性的影響

溫度對密蒙花黃色素穩(wěn)定性的影響見圖2。

圖2溫度對密蒙花黃色素穩(wěn)定性的影響Fig.2 Effect of temperature on the stability of Buddleja officinalis yellow pigments

圖2 顯示，4℃和30℃保藏的密蒙花黃色素的色價基本不變，但80℃處理的黃色素隨著保溫時間延長，色價逐漸降低，說明高溫對密蒙花黃色素的穩(wěn)定性有一定影響。

文獻(xiàn)[12]表明密蒙花黃色素在80℃以下時穩(wěn)定，100℃處理對黃色素穩(wěn)定性有一定影響，但色素殘存率仍有95.5％，與圖2結(jié)果不符，這是由于文獻(xiàn)[12]只保溫2h，處理時間較短所造成。文獻(xiàn)[11]考察了不同溫度對密蒙花黃色素的穩(wěn)定性，認(rèn)為在測試溫度下溫度對色素性能的影響甚微，色素對溫度變化有一定的耐受力，其結(jié)論也與本研究結(jié)果有差異。從文獻(xiàn)[11]的結(jié)果可見隨著在40℃～80℃保溫時間延長，黃色素的吸收值也逐步下降，但由于文獻(xiàn)[11]也只在不同溫度下處理3 h，因此吸光度的變異系數(shù)不大。

2.4 pH對密蒙花黃色素穩(wěn)定性的影響

pH對密蒙花黃色素穩(wěn)定性的影響見圖3。

圖3 pH對密蒙花黃色素穩(wěn)定性的影響Fig.3 Effect of pH on the stability of Buddleja officinalis yellow pigments

結(jié)果表明，經(jīng)80℃處理，不同pH的密蒙花黃色素的色價都隨著處理時間增加而下降，而且下降的速度基本一致，說明色價下降是由溫度造成，而pH對密蒙花黃色素的穩(wěn)定性基本沒有影響。

2.5 EDTA對密蒙花黃色素穩(wěn)定性的影響

EDTA對密蒙花黃色素穩(wěn)定性的影響見圖4。

圖4 EDTA對密蒙花黃色素穩(wěn)定性的影響Fig.4 Effect of EDTA on the stability of Buddleja officinalis yellow pigments

結(jié)果表明，隨著保藏時間增加，添加EDTA的黃色素溶液的色價逐漸下降，而無EDTA存在的黃色素溶液的色價在45 d內(nèi)基本不變，說明EDTA對密蒙花黃色素色價有一定影響。

文獻(xiàn)[11]表明CuSO4對密蒙花黃色素有一定協(xié)同作用，AlCl3可降低黃色素的吸收值，但變異系數(shù)不大；文獻(xiàn)[12]表明NaCl和AlCl3對密蒙花黃色素的色澤影響不大，但FeCl3影響較大。EDTA能絡(luò)合金屬離子，常用于防止金屬離子對色素的影響，但圖4結(jié)果表明EDTA對密蒙花黃色素的穩(wěn)定性有一定影響，因此不適宜在密蒙花黃色素中使用。為了預(yù)防Fe3+對密蒙花黃色素的影響，應(yīng)從Fe3+介入途徑加以控制較為適宜。

2.6 密蒙花黃色素清除DPPH自由基活性

密蒙花中存在多種黃酮類化合物，如刺槐素、芹菜素、木犀草素、密蒙花新甙、蒙花甙、木犀草素-7-O-葡萄糖甙和秋英甙[13]，黃酮類化合物具有較好的抗氧化活性。文獻(xiàn)[14]對密蒙花總黃酮進(jìn)行了研究，表明密蒙花對DPPH自由基清除作用比VC強(qiáng)，文獻(xiàn)[15]也表明密蒙花總黃酮具有羥自由基的清除作用和對羥自由基誘發(fā)卵磷脂脂質(zhì)過氧化具有抑制作用。

經(jīng)對密蒙花黃色素清除DPPH自由基活性進(jìn)行測定，結(jié)果密蒙花黃色素溶液（1 g/L）對DPPH自由基具有一定清除能力，自由基清除率為81.11％，每mg密蒙花黃色素與10.01μg Trolox的DPPH自由基清除能力相當(dāng)。研究結(jié)果表明密蒙花黃色素具有較強(qiáng)的自由基清除能力，與文獻(xiàn)[13-15]相符，說明在黃色素提取過程中，密蒙花大部分總黃酮已被提取出來，因此密蒙花黃色素的使用以粗提物較好，無需純化。

2.7 密蒙花黃色素抗菌活性測定

文獻(xiàn)[16]表明密蒙花總黃酮和總苯乙醇甙在細(xì)胞水平上有明顯的抗菌（金黃色葡萄球菌和溶血性鏈球菌）活性，其活性成分為密蒙花甙和洋丁香甙，文獻(xiàn)[17]以拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅳ為靶點(diǎn)，對中藥密蒙花的化學(xué)成分（包括單體化合物和提取分離有效部位和流分）進(jìn)行抗菌活性篩選，結(jié)果顯示石油醚部位、醋酸乙酯部位、大孔樹脂40％乙醇洗脫部位和單體成分芹菜素、異洋丁香甙、密蒙花甙、洋丁香甙以及songaroside A對拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅳ有較強(qiáng)的抑制作用。

經(jīng)對10 g/L密蒙花黃色素水溶液對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽胞桿菌、副溶血性弧菌、釀酒酵母、匍枝根霉、黑曲霉和桔青霉的抗菌活性進(jìn)行測定，結(jié)果表明密蒙花黃色素水溶液對測試菌株均沒有抗菌活性。

3 討論

密蒙花是我國西南各省民間用來制作黃色米飯的傳統(tǒng)藥食兩用植物，長期實踐及現(xiàn)代毒理學(xué)研究均表明，密蒙花具有極高的安全性，著色力強(qiáng)，染色效果好，色澤穩(wěn)定，在食品工業(yè)具有極高的應(yīng)用價值[18]。文獻(xiàn)[19]認(rèn)為密蒙花含有多種氨基酸、微量元素、A-藏花素，4＇，5，7–三羥基黃酮，甘露糖醇及醉魚草甙等成分，對人體有營養(yǎng)和保健作用，色素提取物可不經(jīng)純化而直接使用。本文研究也表明密蒙花黃色素粗提物中含有清除DPPH自由基的活性成分，如果對密蒙花黃色素進(jìn)行純化，必然會造成這些活性成分的丟失，因此作者贊成文獻(xiàn)[19]觀點(diǎn)。

圖1及圖2關(guān)于光和溫度對密蒙花黃色素的研究結(jié)果與文獻(xiàn)[11-12]結(jié)果略有差異，主要由于研究中測定時間差異所造成，這也表明對于物質(zhì)穩(wěn)定性研究，應(yīng)該盡量長時間進(jìn)行監(jiān)測，才能獲得更客觀的數(shù)據(jù)。

文獻(xiàn)[16-17]研究表明密蒙花成分具有抗菌作用，然而本文對密蒙花黃色素提取物對多種微生物的抗菌作用進(jìn)行了檢測，均未見密蒙花黃色素提取物具有抗菌活性。文獻(xiàn)[17]研究表明，密蒙花的抗菌成分主要存在于石油醚、醋酸乙酯等有機(jī)相溶劑部分，而本文中提取的密蒙花黃色素為水溶性色素，難溶于丙酮和石油醚，這可能是本文研究結(jié)果與文獻(xiàn)[16-17]不同的主要原因之一，同時密蒙花提取物的濃度差異也會造成抗菌活性測定結(jié)果不同。從本文研究結(jié)果可見，即使密蒙花黃色素具有抗菌活性，其活性也十分微弱，在實際應(yīng)用可以忽略。

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Studies on the Properties of Yellow Pigment from Buddleja officinalis Maxim

YANG Sheng-yuan，LI Zhuo-wen，LAI Yan-lian，F(xiàn)ANG Xiao-xuan，CHEN Xiao-ping，YANG Na
（Department of Biology，Hanshan Normal University，Chaozhou 521041，Guangdong，China）

The properties of yellow pigment from Buddleja officinalis Maxim were investigated.The results indicated the yellow pigment from B.officinalis Maxim was easily dissolved in water and poorly soluble in petroleum ether，and the solubility of the yellow pigment in different solvents was water＞absolute ethyl alcohol＞acetone＞petroleum ether.The yellow pigment was stable at4，30℃and pH 4.92-9.18，but its stability was effect by high temperature，light and EDTA.The yellow pigment shows strong DPPH radical scavenging activity which was equal to10.01μg Trolox/mg，and shows no antimicrobial activities to Escherichia coli，Staphyloccocus aureus，Bacillus subtilis，Vibrio Parahemolyticus，Saccharomyces cerevisiae，Rhizopus stolonifer，Aspergillus niger and Penicillium citrinum at10 g/L.

Buddleja officinalis Maxim；yellow pigment；property

10.3969/j.issn.1005-6521.2014.04.005

2013-07-24

國家星火計劃項目（2011GA780022）；潮州市科技引導(dǎo)計劃項目（2011N01）；韓山師范學(xué)院教授科研啟動項目（QD20110304）

楊勝遠(yuǎn)（1972—），男（漢），教授，博士，研究方向：食品微生物及功能性食品。