食品中氯霉素殘留快速檢測技術研究進展

張威，趙曉娟，陳海光

（仲愷農業(yè)工程學院輕工食品學院，廣東廣州510225）

食品中氯霉素殘留快速檢測技術研究進展

張威，趙曉娟*，陳海光

（仲愷農業(yè)工程學院輕工食品學院，廣東廣州510225）

氯霉素類抗生素殘留引起的食品安全問題已引起人們的普遍關注。簡述動物源性食品中氯霉素類抗生素殘留狀況，綜述2004年以來氯霉素類抗生素殘留常用檢測技術的開發(fā)應用情況，重點介紹免疫速測、傳感器等快速檢測技術的最新研究進展及應用，最后對氯霉素類抗生素殘留檢測技術的發(fā)展趨勢進行討論。

食品安全；氯霉素；殘留；快速檢測

氯霉素類抗生素（Chloramphenicols，CAPs），是一類包括氯霉素（Chloramphenicol，CAP）以及一系列氯霉素衍生物的廣譜高效抗菌性藥物。1947年，Ehrlich等[1]首次從委內瑞拉鏈霉菌（Streptomyces venezuela）中分離得到CAP。1948年，CAP的結構被確定并成為第一種完全由人工合成的抗生素[2]。目前，我國常見的藥用氯霉素類抗生素有氯霉素、甲砜霉素（Thiamphenicol）和氟甲砜霉素（Florfenicol）等。該類抗生素主要通過轉換抗生素自身和改變微生物代謝機制[3]對多種病原菌起到較強抑制作用，因而廣泛用于動物各種細菌性傳染疾病的治療，對各類家禽、家畜、水產品及蜂蜜制品各種傳染性疾病的控制和治療起重要作用[4]。

醫(yī)學研究表明，肉、蛋和奶等動物源性食品中的CAPs殘留對人體有嚴重的副作用，長期微量攝入會使一些致病菌產生耐藥性，并且引起機體正常菌群失調，使人們容易感染各種疾病。此外，CAPs對人的骨髓細胞、肝細胞具有毒性作用，尤其是會引起與計量和療程無關的不可逆再生障礙性貧血[5]。因此，許多國家已出臺了關于氯霉素類藥物禁用的相關法律法規(guī)和政策。例如，歐美僅允許氯霉素用于非食用動物；我國農業(yè)部2002年發(fā)布《食品動物禁用的獸藥及其他化合物清單》，規(guī)定禁止在所有動物源性食品中使用氯霉素。但由于CAPs價格低廉、抑菌效果好，目前仍被少數廠家違規(guī)使用，既對人類的健康造成極大威脅，也大大挫傷了人們對食品安全的信心。食品安全事件的頻發(fā)和保障食品安全涉及到很多層面，但是無疑分析檢測技術是保障食品安全的重要技術支撐，從監(jiān)督層面對保證食品質量安全、保障人民身體健康等方面起到積極的促進作用。氯霉素類抗生素殘留的檢測技術主要有微生物檢測技術、色譜檢測技術、光譜分析技術和免疫速測法等快速檢測技術。

1 微生物檢測技術

微生物法的測定方式可分為兩種：一種是基于抗生素對微生物生長的抑制作用[6]；另一種是由于發(fā)光微生物對氯霉素敏感而引起生化特性的變化，如氯霉素對鰒發(fā)光桿菌具有抑光作用，通過檢測鰒發(fā)光桿菌發(fā)光強度的變化可以檢測氯霉素的含量[7-8]。微生物法經濟簡便、容易操作，可用于多種抗生素類藥物的測定。但其敏感性和特異性低，不適合大批量樣品的快速檢測，而且由于其結果會出現(xiàn)假陽性，容易引起誤判。

2 色譜檢測技術

近年來，各種儀器聯(lián)用等分析新方法的不斷涌現(xiàn)，賦予色譜檢測技術更加優(yōu)良的分離分析能力。色譜檢測技術已廣泛用于各類食品中CAPs殘留的測定。我國現(xiàn)行標準GB/T 22338-2008規(guī)定了動物源性食品中氯霉素類殘留量的氣相色譜-質譜（GC-MS）[9]和液相色譜-質譜/質譜（LC-MS-MS）[10]測定方法，適用于水產品、畜禽產品和畜禽副產品中氯霉素、氟甲砜霉素和甲霉素殘留的定性確證和定量測定[11]。此外，其他色譜檢測技術，如超高效液相色譜-串聯(lián)質譜（UPLC-MS-MS）用于禽畜肉[12]、蜂蜜[13]、牛奶[14]、奶粉[15]和多種動物源性食品[16]中氯霉素的分析檢測；高效液相色譜-電噴霧離子阱質譜法（HPLC-ESI-TRAP-MS）用于乳品中氯霉素類藥物殘留的測定[17]；氣相色譜電子捕獲法（GC-ECD）檢測肌肉組織中的氯霉素殘留[18]等。色譜檢測技術具有靈敏度高、準確可靠等特點，但是樣品前處理操作復雜、專業(yè)性強、成本較高，不適合進行大批量樣品的快速篩選檢測。

3 光譜分析技術

光譜分析技術是利用物質的特征光譜進行定性、定量和結構分析的技術。研究者分別使用可見光譜[19]、紫外光譜[20]及近紅外光譜[21]對動物源性食品中的氯霉素殘留進行了檢測，結果表明，光譜分析技術具有成本低、操作簡便的優(yōu)點。但該法的選擇性較低，而且近紅外光譜法需要結合化學計量學技術進行數據解析，專業(yè)性強。

4 快速檢測技術

快速檢測技術通常具有靈敏快速、簡便經濟、適用于大批量樣品快速篩選檢測的特點，可以及時、快速地監(jiān)控食品的安全狀況，在食品和藥物分析、臨床診斷、環(huán)境保護等領域有著廣泛的應用前景[22-23]。

4.1 免疫速測分析技術

免疫速測分析技術是基于抗原抗體特異性反應建立起來的快速檢測技術[24]。其中，酶聯(lián)免疫吸附法是目前應用最為廣泛的免疫分析方法之一。近年來，毛細管電泳免疫等新免疫分析技術的加入為免疫快速檢測提供了更廣闊的發(fā)展空間。

4.1.1 酶聯(lián)免疫吸附法

酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）是一種以酶作為標記物的免疫分析方法。ELISA主要有夾心法、間接法和競爭法等測定方法。其中，夾心法和間接法主要用于測定抗體和大分子抗原，適用于臨床診斷；競爭法主要用于測定小分子抗原，尤其適用于食品安全分析。程冰[25]選用競爭性酶聯(lián)免疫吸附法分析了家禽可食組織器官中氯霉素的殘留分布情況。郝俊虎等[26]用ELISA方法測定雞組織中氯霉素的檢出限為0.02 ng/mL，樣品中不同濃度的氯霉素標準品回收率均達84.8％以上。Tajik等[27]采用ELISA和HPLC等方法測定雞肝、雞腎和肌肉組織內的氯霉素殘留，結果表明ELISA法的檢測結果與HPLC的檢測結果基本一致。楊艷艷等[28]在建立氯霉素單克隆抗體（CAPmAb）雜交瘤細胞株和阻斷ELISA方法的基礎上，研制出CAP殘留快速檢測試劑盒（CAP-kit），并對其性能進行了測定。此外，目前市場上已出現(xiàn)一些商品化的試劑盒產品[29-30]，可以直接用于生產實踐，適用于大規(guī)模氯霉素的殘留篩選檢測。

4.1.2 膠體金免疫層析法

膠體金免疫層析法（GICA）是基于免疫層析技術和膠體金標記技術建立起來的免疫分析方法。以膠體金作為著色物，應用于抗原抗體特異性免疫反應。免疫膠體金試紙法將特異的抗體交聯(lián)到試紙條上，試紙條上有控制線和顯示結果的測試線，樣品中抗原與抗體結合后，膠體金可使該區(qū)域顯示一定的顏色，通過與控制線顏色的對比實現(xiàn)快速檢測。楊挺等[31]應用雜交瘤技術制備了抗氯霉素單克隆抗體，并根據競爭式膠體金免疫層析試驗原理，研制了氯霉素檢測免疫試紙條。研究結果表明，該單克隆抗體對氯霉素的親合性好、特異性高；該金標試紙條適用于動物源性食品中氯霉素殘留的快速檢測，對蝦肉、蜂蜜樣品的最低檢出限為1.5μg/kg；對鮮奶的最低檢出限為3μg/kg，檢測時間只需5min～8min。王瑋[32]利用膠體金標記快速檢測技術對氯霉素獸藥殘留快速檢測方法進行了系統(tǒng)的研究。通過優(yōu)化各項實驗指標，建立了滲濾式（Flow-through）和層析式（Lateralflow）兩種金標記免疫競爭快速篩選方法。以氯霉素與固相膜上的氯霉素-卵清蛋白（CAP-OVA）偶聯(lián)物（即包被抗原）競爭結合金標記抗氯霉素多克隆抗體的方法，通過膠體金顯色達到快速檢測樣品中氯霉素殘留的目的。

4.1.3 化學發(fā)光免疫分析法

化學發(fā)光免疫分析法（CLISA）是一種有效的微量和痕量分析法，檢測時間較ELISA短、靈敏度高、檢出限低。高彬文等[33]采用CLISA法檢測魚和蝦肌肉中的氯霉素殘留，檢出限為5.8×10-4μg/kg，比傳統(tǒng)的ELISA方法更加靈敏快速、方便經濟、不需要復雜的樣品前處理過程。馬玲等[34]采用一步式CLISA檢測氯霉素殘留，與常規(guī)兩步式CLISA的檢測效果相近，且耗時短，更符合快速檢測的要求。

4.1.4 熒光免疫檢測法

免疫熒光檢測法（TRFIA）是將不影響抗原抗體活性的熒光色素標記在抗體（或抗原）上，與其相應的抗原（或抗體）結合后，在熒光顯微鏡下呈現(xiàn)一種特異性熒光反應。ZHANG等[35]首次使用TRFIA法測定豬組織中CAP殘留的含量水平。此方法簡便易行、靈敏度高，相比ELISA和氣相色譜分析法明顯縮短了測定時間。郭艷宏等[36]利用反相微乳技術合成了稀土銪-SiO2納米顆粒，用其與氯霉素單克隆抗體結合制備氯霉素類殘留物免疫檢測探針，并制備熒光免疫層析試紙條，用于牛奶中氯霉素和氯霉素琥珀酸鹽的同步檢測。方法簡便快速，具有較強的特異性。

4.1.5 毛細管電泳免疫分析法

毛細管電泳技術的發(fā)展及其在免疫分析上的逐步應用，使其發(fā)展成為一種新型的免疫分析技術，即毛細管電泳免疫分析法（CEIA）。張燦等[37]建立一種快速靈敏的氯霉素毛細管電泳免疫分析方法，對氯霉素檢測的線性范圍和最低檢測限分別為0.008μg/L～5μg/L和0.001 6μg/L，與相應的固相ELISA相比，對氯霉素的檢測靈敏度提高了約20倍，且縮短了分析時間。用該法對動物源性食物（牛奶、雞肉和魚肉）進行分析，得到氯霉素在實際樣品中的檢出限為0.035μg/kg。

4.1.6 微珠芯片免疫法

張東等[38]采用微珠芯片免疫分析法快速定量檢測食品中的氯霉素殘留。玻璃微珠經過表面化學修飾后形成氨基化表面，在碳二亞胺（EDC）催化作用下固定琥珀酸氯霉素，隨后加入氯霉素單克隆抗體和氯霉素標準品或待測樣品的混合物，待抗體抗原完全反應后加入熒光標記二抗示蹤。繪制氯霉素濃度與熒光信號強度的標準曲線，然后根據標準曲線對待測樣品中氯霉素進行定量分析。該方法具有良好的靈敏度、準確度和精密度，符合快速、高通量檢測氯霉素殘留的要求，并為實現(xiàn)介觀流控免疫分析提供了基礎。

4.2 傳感器檢測技術

傳感器是能感受規(guī)定的被測量并按照一定規(guī)律轉換成可用信號的器件或裝置，通常由敏感元件、轉換元件及測量電路組成。根據傳感器的工作原理，可將其分為物理傳感器、化學傳感器和生物傳感器三大類。在氯霉素類抗生素殘留快速檢測領域應用較多的是生物傳感器和化學傳感器。

4.2.1 生物傳感器

生物傳感器是利用生物活性物質的選擇性識別作用進行測定的傳感器，因具有靈敏度高和特異性強等優(yōu)點而成為近年來的研究熱點[39-42]。根據生物識別元件的不同，生物傳感器可分為酶傳感器、免疫傳感器、微生物傳感器等。其中，免疫傳感器備受研究者的關注。宋巍巍等[43-45]在間接競爭ELISA的基礎上，建立了以堿性磷酸酶（ALP）-對硝基苯磷酸（pNPP）為反應體系的檢測CAP殘留的伏安免疫方法，并對此法的電化學條件進行了詳細的探討。結果表明，用電化學免疫傳感法測試CAP的靈敏度高于傳統(tǒng)的間接競爭ELISA法，傳感器體積小、便于攜帶、操作簡單，可實現(xiàn)牛乳樣品中CAP殘留的現(xiàn)場檢測。武會娟等[46]將pH敏感的熒光物質F1300標記到色素體的內表面，然后將β亞基抗體-生物素-鏈親和素-生物素-氯霉素抗體系統(tǒng)連接到色素體上F0F1-ATPase的β亞基上，該檢測體系能與氯霉素相連接。采用微弱發(fā)光檢測儀檢測熒光值，根據熒光值確定氯霉素濃度，檢出限為0.01ng/L，檢測操作僅需35min，能快速、靈敏地檢測氯霉素，具有很好的應用前景。

此外，將適配體作為生物識別元件的適配體生物傳感器近期已被用于氯霉素的快速檢測。Pilehvar等[47]基于非標記適配體的折疊/去折疊作用開發(fā)了一種新型的適配體傳感器。將人工核酸配體寡核苷酸適配體（ssDNA或RNA）自組裝到金電極表面，這種寡核苷酸適配體能夠準確識別CAP。在CAP存在下，去折疊的ssDNA在電極表面折疊成為一種發(fā)夾結構，使目標分子接近電極表面而發(fā)生電子轉移。該傳感器具有良好的選擇性，氯霉素結構類似物甲砜霉素和氟甲砜霉素不影響CAP的測定，檢出限達1.6 nmol/L。

4.2.2 化學傳感器

化學傳感器是利用電化學反應原理，把各種化學物質的濃度轉換為電信號進行檢測的傳感器。Pilehvar等[48]在甲砜霉素和氟甲砜霉素存在的情況下，以金電極作為工作電極，通過選擇檢測電位，實現(xiàn)了氯霉素的高選擇性檢測，檢出限為1.0μmol/L。康金國等[49]用聚乙烯亞胺-納米金修飾玻碳電極，建立了檢測牛乳樣品中氯霉素殘留量的電化學方法，檢測氯霉素的回收率達96.8％，準確率達99％以上，平均每份樣品的檢測時間為4min。

享有“塑料抗體”美譽的分子印跡聚合物可以作為識別元件研制分子印跡仿生傳感器。張挪威等[50]采用光聚合法在一次性絲網印刷電極上制備琥珀酸氯霉素分子印跡膜，然后將電極通過電極插口與電化學分析裝置相連接，組裝成檢測琥珀酸氯霉素殘留的電化學傳感儀，并測試了實際牛奶樣品中的氯霉素含量。該法具有很高的靈敏度和特異性，檢出限為2 nmol/L，基于牛奶樣品的檢測回收率介于93.5％～95.5％之間。

4.3 生物芯片

生物芯片是根據生物分子間特異相互作用的原理，將生化分析過程集成于芯片表面，從而實現(xiàn)對細胞、蛋白質以及其他生物活性成分的高通量快速檢測。根據固定在載體上的物質成分，生物芯片可分為基因芯片、蛋白質芯片、細胞芯片、組織芯片等。左鵬等[51]使用蛋白芯片法快速定量檢測食品中的氯霉素和磺胺二甲嘧啶殘留。將氯霉素和磺胺二甲嘧啶人工抗原固定在芯片上，在芯片反應區(qū)內加入氯霉素和磺胺二甲嘧啶單克隆抗體和其標準品或待測樣品混合物，待抗原抗體完全反應后加入熒光標記二抗示蹤。通過檢測熒光強度進行定量分析。方法簡單快速、靈敏度高、重復性較好，適用于大規(guī)模氯霉素和磺胺二甲嘧啶的殘留篩選檢測。

懸浮芯片技術是一種新型的生物芯片技術，利用懸浮在液相中的熒光微球作為檢測載體，具有高通量、靈敏快速、特異性強等特點。劉楠等[52]建立一種檢測氯霉素和克倫特羅獸藥殘留的新型高通量懸浮芯片技術。2種獸藥懸浮芯片的檢測特異性好，與其他藥物無明顯交叉反應，檢出限分別為40 ng/L和50 ng/L，為多種獸藥殘留的快速檢測提供了新方法。

5 結語

隨著科學技術的發(fā)展，分析檢測水平不斷獲得提高，氯霉素類抗生素殘留的檢測新技術正在不斷涌現(xiàn)，其主要發(fā)展趨勢可以概括為：1）建立高靈敏度、高選擇性的復雜儀器體系。如超高效液相色譜-串聯(lián)質譜（UPLC-MS-MS）、高效液相色譜-電噴霧離子阱質譜法（HPLC-ESI-TRAP-MS）等；2）開發(fā)靈敏快速、自動智能的現(xiàn)場快速檢測技術。如生物傳感、生物芯片、酶聯(lián)免疫法和膠體金免疫層析法等。其中，快速檢測技術因具有成本低、簡便經濟、適用于大批量樣品快速篩選檢測等優(yōu)點而備受研究關注，在氯霉素類藥物殘留分析、環(huán)境保護、臨床診斷等領域有著廣泛的應用前景。

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Research Progress in Fast Detection Techniques of Chloramphenicol Residues in Food

ZHANG Wei，ZHAO Xiao-juan*，CHEN Hai-guang
（College of Light Industry and Food Sciences，Zhongkai University of Agriculture and Engineering，Guangzhou 510225，Guangdong，China）

Food safety issues caused by the chloramphenicol（CAPs）residues have brought about increasing concern.In this paper，the conditions of CAPs residues of animal derived food are introduced.The development and application of detection techniques of CAPs residues was summarized since 2004.In particular，the fast detection techniques，such as immunity analysis methods and sensors，are focused.Finally，the development trend of detection techniques of CAPs residues is discussed.

food safety；chloramphenicol；residues；fast detection

10.3969/j.issn.1005-6521.2014.04.030

2012-11-30

國家自然科學基金項目（21005091）；廣東省教育廳科技創(chuàng)新項目（2012KJCX0068）；廣州市食品安全檢測技術重點實驗室（[2011]233-44）

張威（1986—），男（漢），碩士研究生，研究方向：食品安全。

*通信作者：趙曉娟（1980—），女，副教授，博士。