谷朊粉酶解條件優(yōu)化及其抗氧化活性

王章存 原 媛 王許東 趙學偉 安廣杰 王 穎

（鄭州輕工業(yè)學院 食品與生物工程學院1，鄭州 450000）

（鄭州新威營養(yǎng)技術有限公司2，鄭州 450000）

谷朊粉是小麥淀粉生產(chǎn)的副產(chǎn)物，其蛋白高達80%左右。但是其含有很多疏水性氨基酸，限制其在生產(chǎn)上的應用。目前提高植物蛋白功能及營養(yǎng)性質應用的主要方法是酶解法［1］。蛋白質被酶水解可導致分子鏈內(nèi)外功能結構的重排，一些原先包埋在分子鏈內(nèi)部的功能基團暴露出來，蛋白酶進一步剪切從而釋放出具有一定生物學功能的肽段［2］。生物活性肽通常由3～20個氨基酸組成，具有很多生物功能，如參與細胞免疫，降血壓，促進礦物質吸收以及抗血栓等。而且，生物活性肽的功能是和其氨基酸的組成及其序列密不可分的［3］。由于化學合成抗氧化劑對人體存在潛在的危害，目前越來越多的人開始關注天然的抗氧化劑，如大豆蛋白、酪蛋白、魚蛋白［4-6］等酶解物制備抗氧化活性肽的研究已有較多文獻報道。關于谷朊粉酶解物生物活性也有一些研究。Kong等［7］用胃蛋白酶水解谷朊粉，研究結果表明，分子質量＜3 000 u谷朊粉酶解物表現(xiàn)出了良好的抗氧化活性。Wang等［8］對谷朊粉木瓜酶水解物進行了研究，發(fā)現(xiàn)其也具有較好抗氧化活性。這些研究結果表明，谷朊粉酶解物具有一定的抗氧化活性，且不同酶種類和不同酶解條件制備的酶解物抗氧化活性也有較大的差異。

在前人研究的基礎上，采用單酶（堿性蛋白酶）和雙酶（堿性蛋白酶＋風味酶）2種方法對谷朊粉進行酶解，通過正交試驗優(yōu)化了酶解條件，并對比分析了2種水解物的抗氧化活性、分子質量及氨基酸組成的差異，從而為谷朊粉酶解物制備抗氧化活性肽提供一定的理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

谷朊粉（粗蛋白80.2%）：河南省蓮花味精有限公司。

堿性蛋白酶（Alcalase 2.4 L，酶活力2.4 AU／g）、風味酶（Flavourzyme 500 MG，酶活力500 LAPU／g）：丹麥諾維信酶制劑公司；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH·）：美國Sigma公司。其他化學試劑均為分析純。

TDA型電子恒溫水浴鍋：北京永光明醫(yī)療儀器廠；Sartorius普及型pH計（PB-10）：賽多利斯科學儀器有限公司；UV 8100 B紫外可見分光光度計：北京萊伯泰科儀器有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 谷朊粉酶解物的制備

準確稱取一定量的谷朊粉，使其均勻分散于500 mL蒸餾水中，配置成一定濃度的懸浮液，并加熱到所需溫度，用1.0 mol／L NaOH調(diào)節(jié)到所需的pH值。在攪拌條件下加入適量的酶（單酶：Alcalase 2.4 L；雙酶：Alcalase 2.4 L＋Flavourzyme 500 MG，雙酶按1∶1加入，總量和單酶相等），開始計時，反應過程中用1.0 mol／L的NaOH維持體系pH恒定。反應結束后，置于沸水浴滅酶5 min，之后取出冷卻至室溫，2 000 r／min離心10 min，上清液冷凍干燥得所需酶解物，并計量其質量。用凱氏定氮法測定酶解物的總氮量，其與初始酶解樣品中總氮量的比值（%）即為該酶解樣品的溶解性。

1.2.2 酶解條件的優(yōu)化

以溶解性為指標，分別考察底物濃度、加酶量、酶解時間3個因素對溶解性的影響，在單因素試驗的基礎上，進行正交優(yōu)化設計與分析。

1.2.3 酶解物溶解性的測定

酶解物用凱氏定氮法測定其含氮量，其與初始酶解樣品含氮量的比值（%）即為該酶解物的溶解性，也即產(chǎn)品得率。

1.2.3 抗氧化活性的測定

1.2.3.1 還原力測定［9］

將谷朊粉酶解物用pH 6.6磷酸鹽緩沖液稀釋成不同濃度，各取1 mL，分別加入2.5 mL pH 6.6的磷酸鹽緩沖液，2.5 mL 1%鐵氰化鉀，混合，50℃恒溫2 0 min。再加入2.5 mL 10%三氯乙酸，然后3 000 r／min離心10 min。取上層清液加蒸餾水2.5 mL和0.1%FeCl30.5 mL，常溫反應 5 min，700 nm處測定樣品吸光度值。用VC做對照。

1.2.3.2 DPPH自由基清除率測定［10］

將谷朊粉酶解物稀釋成不同濃度，各取2 mL于試管中，再加入2 mL 0.04 mg／mL的DPPH·溶液，混合均勻，反應20 min。然后3 500 r／min離心10 min。取上清液在517 nm處測其吸光值為A1；另各取2 mL上述濃度的酶解物于試管中，分別加入無水乙醇2 mL，反應20min。然后3 500 r／min離心10min，取上清液在517 nm處測其吸光值為A2。測2 mL 0.04 mg／mL DPPH·和2 mL無水乙醇混合液的吸光值，記為A0。用VC做對照。DPPH·清除率計算公式：

1.2.3.3 超氧陰離子清除率測定［11］

將谷朊粉酶解物稀釋成不同濃度，各取0.5 mL于試管中，然后每支試管加入3 mL Tris-HCl緩沖液（pH 8.2），水浴 20 min。再加入0.3 mL 7 mmol／L鄰苯三酚，反應4 min，然后各加入100μL，10 mol／L鹽酸終止反應，420 nm測吸光值。

超氧陰離子自由基抑制率 ＝［1-（A2-A1）／A0］×100%

式中：A1為對照組的吸光度；A2為加樣品組的吸光度；A0為加樣品組在t＝0時刻的吸光度。

1.2.3.4 羥自由基清除率測定［12］

將谷朊粉酶解物稀釋成不同濃度，各取2 mL于試管中，依次加入 2 mL 6 mmol／L的 FeSO4、2 mL 6 mmol／L的 H2O2，混勻后靜置10 min。再加入2 mL 6 mmol／L水楊酸，混勻，靜置30 min。在510 nm處測其吸光值記為Ai。用重蒸水代替水楊酸測得的吸光值記為Aj?？瞻讓φ战M以蒸餾水代替谷朊粉水解物測得的吸光值記為A空白。VC做對照。羥自由基清除率計算如下：

1.2.4 分子質量分布

采用高效液相色譜（HPLC）法測定。分析條件：色譜柱為 TSKgel G2000SWXL（7.8 mm×300 mm）；流動相為乙腈∶水∶三氟乙酸（TFA）＝45∶55∶0.1；檢測波長215 nm；上樣量10μL；流速1mL／min；柱溫30℃。細胞色素 C（12 500）、抑肽酶（6 500）、桿菌肽（1 450）、乙胺酰氨-乙胺酰氨-精氨酸（451）、乙胺酰氨-乙胺酰氨-乙氨酸（189）為標準品做標準曲線，根據(jù)保留時間和分子質量的回歸方程計算酶解物的分子質量。

1.2.5 氨基酸分析

采用反相高效液相色譜（RP-HPLC）法分析。DNFB試劑柱前衍生，檢測波長360 nm，上樣量15μL。

1.2.6 數(shù)據(jù)處理

應用SPSS軟件對數(shù)據(jù)進行處理。

2 結果和討論

2.1 酶解條件的單因素試驗

2.1.1 底物濃度對溶解性的影響

當加酶量0.4%，酶解時間90 min，酶解溫度45℃，pH 8.0時，不同底物濃度對酶解物溶解性的影響如圖1所示。隨著底物濃度的增加，單酶和雙酶水解物的溶解性都呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢。這可能是由于隨著濃度的增加，酶和底物可以充分接觸，從而加速反應的進行，而當?shù)孜餄舛冗^高時，底物不能被酶充分水解，反而降低了酶解效率，使得其溶解性下降。當?shù)孜餄舛葹?%時，單酶和雙酶水解物的溶解性最高，分別達到了57.34%和79.46%。因此，確定酶解的底物濃度為8%。

圖1 底物濃度對溶解性的影響

2.1.2 加酶量對溶解性的影響

當?shù)孜镔|量濃度為8 mg／mL，酶解時間90 min，酶解溫度45℃，pH 8.0時，加酶量對酶解物溶解性的影響如圖2。隨著加酶量的增加，酶解物溶解性均有明顯的增加，當加酶量達到0.6%時，單酶和雙酶水解物的溶解性分別達到了58.36%和80.15%，之后隨著加酶量的增加，其溶解性增加幅度很小。這可能是由于當加酶量達到了一定水平之后，大部分大分子蛋白已經(jīng)水解為了小分子肽，之后再增加酶量，其與蛋白發(fā)生作用的幾率較小，因此溶解性基本保持不變。SPSS軟件分析結果表明，加酶量0.2%～1.0%范圍內(nèi)，單酶和雙酶水解物的溶解性均具有顯著差異（P＜0.05）。當加酶量為1.0%時，單酶和雙酶水解物的溶解性分別為61.27%和81.92%，和加酶量0.6%相比，溶解性增加幅度較小，因此，從產(chǎn)品的經(jīng)濟適用性角度考慮，確定加酶量為0.6%。

圖2 加酶量對溶解性的影響

2.1.3 酶解時間對溶解性的影響

當?shù)孜镔|量濃度為8 mg／mL，加酶量0.6%，酶解溫度45℃，pH 8.0時，酶解時間對溶解性的影響如圖3。由圖3可知，隨著酶解時間的延長，單酶和雙酶水解物的溶解性都呈現(xiàn)不斷上升的趨勢。當酶解時間達到120 min，單酶和雙酶水解物的溶解性分別達到了59.08%和81.47%，之后隨著時間的延長溶解性變化較小。SPSS軟件分析結果表明，酶解時間60～180 min內(nèi)，單雙酶水解物的溶解性均表現(xiàn)出顯著差異（P＜0.05）。當酶解時間增加到180 min時，單雙酶水解物的溶解性分別達到61.95%和83.02%，和酶解120 min的結果相比，溶解性增加不明顯，因此，選取酶解時間為120 min。

圖3 酶解時間對溶解性的影響

2.2 酶解條件的正交優(yōu)化試驗

根據(jù)單因素試驗結果，以溶解性為指標，選取底物質量濃度、加酶量、酶解時間3個因素，各取3個水平，進行正交試驗，結果見表1。

表1 正交試驗條件及結果

根據(jù)正交分析結果，影響單酶水解物溶解性的因素主次順序依次為：加酶量＞酶解時間＞底物質量濃度，最佳組合為：A3B2C2。影響雙酶水解物溶解性的因素主次順序為：酶解時間＞底物質量濃度＞加酶量，最佳組合為A3B2C3。即單酶水解的最佳條件為底物質量濃度10 mg／mL，加酶量0.6%，酶解時間120 min；雙酶水解的最佳條件為底物質量濃度10 mg／mL，加酶量0.6%，酶解時間150 min。將最佳酶解條件得到的酶解物進行溶解性測定，其單酶和雙酶水解物的溶解性分別達到了61.38%和82.21%，可見雙酶水解物的溶解性明顯高于單酶水解物。與正交表中的結果相比，溶解性達到了最高。

2.3 抗氧化活性

2.3.1 還原力

在700 nm處吸光值越大，還原力越好。圖4可以看出，谷朊粉酶解物具有一定的還原力，且隨著樣品濃度的增加而增大。單酶水解物和雙酶水解物在樣品濃度達到3 mg／mL時，700 nm處的吸光值分別達到了0.81和1.01?？梢钥闯觯瑯悠窛舛葘γ附馕锏倪€原力有很大的影響，雙酶水解物的還原力優(yōu)于單酶水解物，SPSS分析結果也顯示，二者具有顯著差異（P＜0.05）。但在樣品質量濃度0.5～3.0 mg／mL范圍內(nèi)，谷朊粉酶解物的還原力均低于抗壞血酸。

圖4 不同酶解物的還原力

2.3.2 DPPH自由基清除率

DPPH自由基是少數(shù)在室溫下能保持穩(wěn)定的自由基，在517 nm處有最大吸收，其含有單一電子，當它遇到供給質子的物質如抗氧化劑時，該自由基將被清除，因此DPPH自由基常被作為基質來評估抗氧化劑的活性。圖5為谷朊粉酶解物在不同濃度下DPPH自由基的清除能力。從圖5可以看出，DPPH自由基的清除能力隨著樣品濃度的增加而增加。也就是說，酶解物的DPPH自由基清除活性與樣品濃度呈現(xiàn)正相關。在酶解物質量濃度達到3 mg／mL時，單酶水解物和雙酶水解物的DPPH自由基清除率分別達到了71.82%和85.33%，二者差異顯著（P＜0.05），且雙酶水解物的清除活性較單酶水解物更好一些。

圖5 不同酶解物DPPH自由基清除率

2.3.3 超氧陰離子清除率

超氧陰離子通過歧化以及其他反應途徑可以產(chǎn)生過氧化氫和羥基。超氧陰離子及其衍生物能引起DNA和細胞損傷。而且，超氧陰離子在脂質過氧化中也起到了很大作用。因此，超氧陰離子的清除能力也是檢查抗氧化活性的重要指標。圖6表明，谷朊粉酶解物的超氧陰離子清除能力和濃度成正比。在蛋白酶解物質量濃度達到3.0 mg／m L時，單酶水解物和雙酶水解物的清除率分別達到了56.83%和74.84%，SPSS分析結果表明二者具有顯著差異（P＜0.05）。該結果表明，谷朊粉酶解物具有一定的超氧陰離子清除活性，且雙酶水解物的清除活性更高。

圖6 不同酶解物超氧陰離子清除率

2.3.4 羥自由基清除活性

與其他自由基相比，羥自由基是最不穩(wěn)定的自由基，它幾乎可以和體內(nèi)所有的物質發(fā)生反應，引起細胞損傷和疾病，如衰老、癌癥等［13］，因此，清除羥自由基可能是防止氧化的有效方法。圖7為谷朊粉酶解物和抗壞血酸清除羥基的對照試驗結果。結果顯示，抗壞血酸在低濃度（0.5 mg／mL）下就表現(xiàn)出了很強的清除能力，清除率達到95.83%，之后隨著抗壞血酸濃度的增加，清除率基本保持不變。而谷朊粉酶解物羥基的清除能力和濃度呈現(xiàn)相關性。單酶水解物和雙酶水解物在樣品質量濃度達到3 mg／mL時羥基清除率分別達到了70.82%和84.33%，SPSS結果顯示，二者具有顯著差異（P＜0.05），該結果表明雙酶水解物的羥自由基清除活性更好。

圖7 不同酶解物羥自由基清除率

圖8 不同酶解物的分子質量分布

2.4 分子質量分布

酶解物的分子質量圖譜通過高效液相色譜法測定。圖8a和圖8b分別表示單酶和雙酶水解物的分子質量圖譜。從圖8可以看出，雙酶水解物中小分子質量肽的含量明顯高于單酶水解物，其中分子質量＜1 500 u的小分子肽（圖8中 B部分）占61.63%，而該組分在單酶水解物中所占比例僅為39.76%。分子質量是反映蛋白質酶解的一個重要參數(shù)，且和酶解物的生物活性密切相關。本試驗的結果表明，分子質量較小的酶解物比分子質量大的酶解物表現(xiàn)出更高的抗氧化活性，即抗氧化肽的功能性質很大程度受酶解物分子質量的影響。Xie等［14］從苜蓿葉蛋白酶解物中分離出了3個高抗氧化活性的肽，其分子質量平均＜1 000 u。本研究結果和上述的研究結論基本一致。

2.5 氨基酸組成

氨基酸分析旨在研究氨基酸組成對酶解物抗氧化活性高低的影響。表2給出了2種酶解物的氨基酸組成?？梢钥闯觯瑔蚊杆馕锖碗p酶水解物都富含谷氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸、組氨酸、纈氨酸和丙氨酸，且雙酶水解物含有的疏水性氨基酸含量較高，其中脯氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸、異亮氨酸和纈氨酸等疏水性氨基酸質量分數(shù)達到了33.74%。因此，谷朊粉酶解物中的這些疏水性氨基可能發(fā)揮了較重要的抗氧化活性。已有文獻報道，組氨酸、酪氨酸、蛋氨酸和胱氨酸對酶解物抗氧化活性的發(fā)揮起到了一定的作用［8］。本試驗酶解物的抗氧化活性研究結果，雙酶水解物表現(xiàn)出較高的抗氧化活性，這可能和這些疏水性氨基酸含量較多有關。

表2 不同酶解物的氨基酸組成／g／100 g蛋白

3 結論

通過不同酶解方法得到的谷朊粉酶解物溶解性試驗結果表明，雙酶能更有效的水解谷朊粉，其酶解物溶解性高于單酶水解物。最優(yōu)酶解條件得到的單酶和雙酶水解物的抗氧化活性也有一定的差異，雙酶水解后的谷朊粉酶解物的還原力、DPPH自由基、超氧陰離子以及羥自由基清除率性都比單酶水解物高。雙酶水解物含有更多的小分子肽和疏水性氨基酸，這些可能是雙酶水解物具備較高溶解性和抗氧化活性的重要原因。結果表明，雙酶水解谷朊粉更有利于制備抗氧化活性肽。

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