玉米皮多糖硫酸酯化工藝優(yōu)化及抗氧化活性研究

李馥邑 王文俠 徐偉麗 張慧君 張顯斌

（齊齊哈爾大學(xué)食品與生物工程學(xué)院黑龍江省普通高校農(nóng)產(chǎn)品加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室1，齊齊哈爾 161006）

（哈爾濱工業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院2，哈爾濱 150090）

多糖是一類具有豐富結(jié)構(gòu)多樣性的特殊生物大分子，可通過生物途徑普遍在有機(jī)體內(nèi)合成，并參與細(xì)胞的各種生命活動(dòng)，具有抗衰老、抗氧化、抗癌、抗誘變等生物活性。硫酸多糖是一類在糖鏈上帶有硫酸基團(tuán)的多糖，通過對(duì)天然硫酸多糖研究已證實(shí)其具有突出的抗病毒活性，而這與硫酸根的存在息息相關(guān)［1］。近年來，多糖硫酸化結(jié)構(gòu)修飾在賦予或增強(qiáng)天然多糖的活性，降低某些藥物的毒副作用等方面已取得一定的進(jìn)展，包括抗病毒、抗凝血、抗腫瘤、調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)等功效［2］。

玉米作為我國主要的農(nóng)作物之一，2012年其年產(chǎn)量高達(dá)2.08億t，位居世界第二。玉米皮是玉米深加工的副產(chǎn)物，占玉米籽粒的15%，其主要成分為半纖維素、纖維素及木質(zhì)素等，是良好的食用、藥用植物活性多糖來源。但由于缺乏相應(yīng)的基礎(chǔ)理論研究，絕大多數(shù)用于飼料生產(chǎn)或廢棄，并未得到充分利用，造成食物資源浪費(fèi)。國內(nèi)外已有研究表明玉米皮活性多糖有良好的物性及生物活性［3-5］，但目前未見有關(guān)玉米皮活性多糖結(jié)構(gòu)修飾方面的研究報(bào)道。

本試驗(yàn)以堿性過氧化氫法提取的玉米皮多糖（APCP）為原料，對(duì)氯磺酸-吡啶法制備硫酸酯化玉米皮多糖（SAPCP）的工藝條件進(jìn)行了優(yōu)化，并研究了硫酸酯化玉米皮多糖清除羥基自由基的能力，以期了解多糖硫酸化修飾對(duì)玉米皮多糖抗氧化活性的影響，為玉米皮多糖及其衍生物的開發(fā)利用提供相關(guān)的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

玉米皮多糖（APCP），以脫脂玉米皮為原料，經(jīng)除淀粉、蛋白質(zhì)及水溶性多糖后采用堿性過氧化氫法提取，醇沉后冷凍干燥制得［6］。

1.2 儀器與設(shè)備

UV757CRT紫外分光光度計(jì)：上海精密科學(xué)儀器有限公司；RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海亞榮生化儀器廠；TDL-5-A型低速臺(tái)式離心機(jī)：北京醫(yī)用離心機(jī)廠；102041真空冷凍干燥機(jī)：CHRIST；HH-S1電熱恒溫水浴鍋：上海躍進(jìn)醫(yī)療儀器廠；DF-Ⅱ集熱式磁力加熱攪拌器：金壇市醫(yī)療儀器廠。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 硫酸酯化玉米皮多糖的制備

將帶有冷凝管和攪拌裝置的三頸瓶置于冰鹽浴中冷卻，加入預(yù)冷的無水吡啶，在劇烈攪拌狀態(tài)下按照一定比例緩慢滴加氯磺酸，反應(yīng)溫度控制在室溫以下，反應(yīng)在30 min內(nèi)完成，結(jié)束后得到淡黃色的酯化試劑。精確稱取一定量玉米皮多糖，將其溶解于一定體積的 N，N-二甲基甲酰胺中，加入到配置好的酯化試劑中，在一定溫度下攪拌反應(yīng)一定時(shí)間，反應(yīng)結(jié)束后，于冰浴中冷卻，用 4 mol／L NaOH調(diào)pH至7，加入4倍體積無水乙醇后靜置過夜，收集醇析后沉淀并將其用蒸餾水復(fù)溶，流水透析72 h，蒸餾水透析12 h，透析液真空濃縮后冷凍干燥，得SAPCP。

1.3.2 酯化試劑比例對(duì)SAPCP取代度的影響

按照1.3.1的方法，調(diào)節(jié) V氯磺酸：V吡啶的比例為1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5，在酯化試劑與多糖溶液的體積比4∶3，反應(yīng)溫度70℃，反應(yīng)時(shí)間2 h的條件下完成反應(yīng)，測定不同酯化試劑比例下SAPCP的取代度。

1.3.3 酯化試劑與多糖溶液的體積比對(duì)SAPCP取代度的影響

按照 1.3.1的方法，調(diào)節(jié) V酯化試劑：V多糖溶液的比例為 4∶1、4∶2、4∶3、4∶4、4∶5，在酯化試劑比 1∶3，反應(yīng)溫度70℃，反應(yīng)時(shí)間2 h的條件下完成反應(yīng)，測定不同酯化試劑與多糖溶液體積比例下SAPCP的取代度。

1.3.4 不同反應(yīng)溫度對(duì)SAPCP取代度的影響

按照1.3.1的方法，調(diào)節(jié)反應(yīng)溫度分別為40、50、60、70、80℃，在酯化試劑比1∶3，酯化試劑與多糖溶液的體積比4∶3，反應(yīng)時(shí)間2 h的條件下完成反應(yīng)，測定不同反應(yīng)溫度下SAPCP的取代度。

1.3.5 不同反應(yīng)時(shí)間對(duì)SAPCP取代度的影響

按照1.3.1的方法，調(diào)節(jié)反應(yīng)時(shí)間分別為1、2、3、4 h，將 V氯磺酸：V吡啶的比例，在酯化試劑比 1∶3，酯化試劑與多糖溶液的體積比4∶3，反應(yīng)溫度70℃的條件下完成反應(yīng)，測定不同反應(yīng)時(shí)間下SAPCP的取代度。

1.4 玉米皮多糖硫酸酯化工藝條件優(yōu)化

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用正交試驗(yàn)法確定APCP硫酸酯化的最佳工藝條件。按照酯化試劑比例、酯化試劑與多糖溶液的體積比、反應(yīng)溫度及反應(yīng)時(shí)間做四因素三水平正交試驗(yàn)。

1.5 硫酸基含量的測定及取代度計(jì)算

硫酸基含量的測定采用氯化鋇-明膠濁度法［7］。

樣品預(yù)處理：精確稱取SAPCP 250 mg，溶于250 mL鹽酸（1 mol／L）中，沸水浴4 h使其完全水解。采用氯化鋇-明膠濁度法對(duì)硫酸基含量進(jìn)行測定，進(jìn)而計(jì)算樣品中的硫的百分含量。

取代度計(jì)算公式［8］為：

DS＝（1.62×S）／（32-1.02×S）

式中：S為硫酸酯化多糖中硫的質(zhì)量分?jǐn)?shù)／%。

1.6 SAPCP抗氧化活性的測定

采用鄰二氮菲-Fe2＋氧化法［9］測定離體試驗(yàn)體系中羥自由基的氧化作用。分別按表1加入試劑及多糖樣品，搖勻后放入37℃水浴中保溫1 h，測定其在536 nm處的吸光度值，清除率計(jì)算公式：

表1 鄰二氮菲-H2 O2／Fe2＋體系加樣表／mL

1.7 數(shù)據(jù)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1 不同酯化試劑比例對(duì)SAPCP取代度的影響酯化試劑（氯磺酸∶吡啶）比例對(duì)SAPCP的取代度的影響如圖1所示。

圖1 酯化試劑比例對(duì)SAPCP取代度的影響

如圖1所示，SAPCP的取代度隨著氯磺酸∶吡啶的比例增大而增大；但比例超過1∶3時(shí)，多糖的取代度卻有所下降。由于氯磺酸是一種含硫酸基的強(qiáng)酸，當(dāng)氯磺酸含量過高時(shí)，會(huì)導(dǎo)致多糖部分降解，影響硫酸化效果；而其含量過低時(shí)，酯化不完全，取代度降低。因此氯磺酸與吡啶的比例太大或太小都會(huì)影響硫酸化效果，故選擇氯磺酸與吡啶的比例為1∶3。經(jīng)單因素方差分析，酯化試劑比例對(duì)SAPCP取代度影響顯著（P＜0.01）。

2.1.2 酯化試劑與多糖溶液的體積比對(duì)SAPCP取代度的影響

酯化試劑與多糖溶液的體積比對(duì)SAPCP取代度的影響，如圖2所示。

圖2 酯化試劑與多糖溶液的體積比對(duì)SAPCP取代度的影響

如圖2所示，隨著酯化試劑與多糖溶液的體積比增大，SAPCP的取代度也隨著增大；但超過一定的比例時(shí)，取代度卻在緩慢的降低。圖2中酯化試劑與多糖溶液的體積比為4∶4時(shí)取代度最大，當(dāng)酯化試劑與多糖溶液的體積比過低時(shí)，會(huì)出現(xiàn)碳化現(xiàn)象；過高時(shí)，多糖不能完全被酯化，影響酯化效果。因此選擇酯化試劑與多糖溶液的體積比為4∶4。經(jīng)單因素方差分析，酯化試劑與多糖溶液的體積比對(duì)SAPCP取代度影響顯著（P＜0.01）。

2.1.3 反應(yīng)溫度對(duì)SAPCP取代度的影響

反應(yīng)溫度對(duì)與SAPCP取代度的影響如圖3所示。

圖3 反應(yīng)溫度對(duì)SAPCP取代度的影響

如圖3所示，隨著反應(yīng)溫度的增加SAPCP的取代度先增后減。當(dāng)溫度高于70℃時(shí)，取代度降低可能是因?yàn)橛衩灼ざ嗵窃邗セ^程中出現(xiàn)碳化現(xiàn)象，影響酯化效果，因此選擇反應(yīng)溫度為70℃。經(jīng)單因素方差分析，反應(yīng)溫度對(duì)SAPCP取代度影響顯著（P＜0.01）。

2.1.4 反應(yīng)時(shí)間對(duì)SAPCP取代度的影響

圖4 反應(yīng)時(shí)間對(duì)SAPCP取代度的影響

不同反應(yīng)時(shí)間對(duì)SAPCP取代度的影響見圖4。如圖4所示，隨著反應(yīng)時(shí)間的增加，SAPCP的取代度呈上升趨勢，但隨著反應(yīng)時(shí)間的延長，多糖的酯化程度降低?？赡芤?yàn)樵诟咚嵝缘臈l件下，酯化時(shí)間過長，造成多糖的部分降解所致，因此選擇時(shí)間為3 h。經(jīng)單因素方差分析，反應(yīng)時(shí)間對(duì)SAPCP取代度影響顯著（P＜0.01）。

2.2 玉米皮多糖硫酸酯化的最佳工藝條件的確定

在單因素的基礎(chǔ)上，采用酯化試劑比例、酯化試劑與多糖溶液的體積比、反應(yīng)溫度和反應(yīng)時(shí)間四因素進(jìn)行L9（34）正交試驗(yàn)，以確定玉米皮多糖硫酸酯化的最佳工藝條件。選用因素及水平見表2，正交試驗(yàn)結(jié)果見表3，方差分析見表4。

表2 因素水平表

表3 正交試驗(yàn)結(jié)果

表4 方差分析

由正交試驗(yàn)結(jié)果可以看出，各因素作用主次順序排序如下：B＞A＞D＞C，與極差分析結(jié)果一致，即酯化試劑與多糖溶液的體積比影響最大，其次依次是酯化試劑比例、反應(yīng)溫度和反應(yīng)時(shí)間。由k值可知最佳組合為A2B2C2D2。方差分析結(jié)果表明各因素對(duì)該酯化反應(yīng)均極顯著。經(jīng)重復(fù)試驗(yàn)驗(yàn)證該最佳條件下多糖的取代度最高，達(dá)2.85。因此確定最佳的硫酸酯化工藝為：酯化試劑比例為1∶3，酯化試劑與多糖溶液體積比為4∶4，反應(yīng)溫度為70℃，反應(yīng)時(shí)間為3h。

2.3 SAPCP的抗氧化活性

分別配置濃度為 2、4、6、8、10mg／mL的 SAPCP和APCP溶液，這2種多糖對(duì)羥自由基的清除作用如圖5所示。

圖5 不同濃度的多糖溶液對(duì)羥自由基的清除率

從圖5中可以看出2種多糖溶液對(duì)羥自由基都有清除作用，而且隨著溶液濃度的增大，清除作用也在增強(qiáng)。在給定濃度范圍內(nèi)，多糖經(jīng)硫酸化后對(duì)羥自由基清除能力大幅提升，在多糖濃度為10mg／mL時(shí)清除率約為原多糖的6倍，高達(dá)72%。而SAPCP在低濃度下也表現(xiàn)出較高清除能力，并明顯高于高濃度下APCP。方差分析結(jié)果表明，多糖濃度對(duì)羥自由基清除作用效果顯著（P＜0.01）。

由此可見APCP經(jīng)硫酸酯化后，抗氧化活性明顯提高，可能是由于多糖單位的羥基被硫酸基取代后，糖環(huán)構(gòu)象可能扭曲或轉(zhuǎn)變并利于形成非共價(jià)鍵，這些陰離子基團(tuán)間的排斥作用使糖鏈鏈段伸長［10］，而且部分硫酸基可能會(huì)和糖環(huán)上的羥基形成氫鍵，因而在糖鏈局部可能形成螺旋結(jié)構(gòu)，糖鏈較為伸展，有序性明顯增加，從而使其黏度降低，與自由基的結(jié)合能力增強(qiáng)［11］。

3 結(jié)論

3.1 玉米皮多糖硫酸酯化的最佳工藝條件為：氯磺酸與吡啶的體積比為1∶3，酯化試劑與多糖溶液的體積比為4∶4，反應(yīng)溫度為70℃，反應(yīng)時(shí)間為3h。在此條件下，硫酸化玉米皮多糖取代度達(dá)到2.85。

3.2 硫酸化玉米皮多糖對(duì)羥基自由基有較高的清除作用，并呈明顯的量效關(guān)系。

3.3 氯磺酸-吡啶法制備硫酸化玉米皮多糖的工藝可行。

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