S I P I-4 0樹(shù)脂富集分離大蒜綠變色素的研究

趙曉丹，曹雁平，張 祿

（1.北京工商大學(xué)北京市食品添加劑工程技術(shù)研究中心，北京100048；2.東北林業(yè)大學(xué)林學(xué)院，黑龍江哈爾濱150040）

大蒜綠變是一種常見(jiàn)的加工現(xiàn)象。長(zhǎng)期的生活實(shí)踐證明，大蒜綠變物質(zhì)對(duì)人體是安全的，但綠變物質(zhì)具體為何種物質(zhì)尚屬未知。近年來(lái)，一些學(xué)者對(duì)大蒜綠變機(jī)理及綠變物質(zhì)進(jìn)行了相關(guān)研究。一些研究對(duì)綠變產(chǎn)物的組成和性質(zhì)進(jìn)行了探索，目前認(rèn)為綠變色素由藍(lán)色素和黃色素兩種成分混合組成，故而呈現(xiàn)綠色，其紫外可見(jiàn)吸收峰在440nm和590nm[1]。有學(xué)者在部分純化的基礎(chǔ)上對(duì)色素的結(jié)構(gòu)進(jìn)行了推測(cè)，認(rèn)為大蒜綠色素可能是一種含氮類色素，性質(zhì)與花青素有許多相似之處，具有多個(gè)吡咯環(huán)，含有一個(gè)硫原子[2]，當(dāng)吡咯環(huán)的聚合度增加時(shí)，其顏色由紫紅向藍(lán)、綠、黃方向改變[3]。目前認(rèn)為大蒜綠變過(guò)程是大蒜中丙烯基半胱氨酸亞砜在酶類（蒜氨酸酶和γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶）作用下轉(zhuǎn)化為硫代磺酸酯[4-5]，而后與氨基酸[6-7]等物質(zhì)反應(yīng)形成了綠變產(chǎn)物，可見(jiàn)綠變產(chǎn)物可能是由含硫化合物轉(zhuǎn)化而來(lái)。還有的學(xué)者試圖對(duì)色素進(jìn)行人工合成[8]，以期從另一個(gè)角度揭示其結(jié)構(gòu)信息，同時(shí)也為綠變色素的開(kāi)發(fā)利用奠定基礎(chǔ)。在綠變物質(zhì)的研究過(guò)程中，常需要對(duì)色素進(jìn)行提取、濃縮及多次純化等處理來(lái)獲得高純度色素提取物，再對(duì)其深入研究，因此提高色素提取物的制備效率尤為必要。研究顯示SephadexLH-20[1-9]等進(jìn)口分離介質(zhì)對(duì)色素的分離效果較為理想但易被污染，從而影響分離效果，在其之前最好進(jìn)行初級(jí)分離除去雜質(zhì)，才能保證這類介質(zhì)的分離效率和使用壽命。大孔樹(shù)脂成本低，處理量大，操作條件溫和，本研究采用SIPI-40大孔樹(shù)脂直接對(duì)色素水提取液進(jìn)行吸附分離，通過(guò)實(shí)驗(yàn)優(yōu)化確定了分離操作條件，通過(guò)大孔樹(shù)脂的吸附富集作用，可以快速的將綠變物質(zhì)與大多數(shù)雜質(zhì)分離，減少了對(duì)后續(xù)分離的干擾；同時(shí)保持綠變產(chǎn)物的性質(zhì)，并達(dá)到濃縮的目的。是一種高效快速制備綠變色素提取物的方法。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

新鮮紫皮大蒜 購(gòu)于當(dāng)?shù)爻校淮罂讟?shù)脂AB-8、NKA-9及S-8 購(gòu)于南開(kāi)大學(xué)化工廠；SIPI-40 為上海華震公司產(chǎn)品；其他常規(guī)化學(xué)試劑 均為國(guó)產(chǎn)分析純。

UV 762紫外/可見(jiàn)分光光度計(jì) 為上海精密科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品；FD-1E-50冷凍干燥機(jī) 為北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司產(chǎn)品。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 大蒜綠變色素粗提液的制備 將大蒜用5%醋酸室溫浸泡約一周，待大蒜變成藍(lán)綠色取出做實(shí)驗(yàn)原料。將綠變大蒜打碎，用80%乙醇提取∶料液比（1∶5），提取溫度25℃，提取時(shí)間5h；提取兩次，合并提取液。將提取液真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，濃縮液用乙酸乙酯萃取兩次，靜置分層后棄去上層，留取下層色素濃縮液備用[1]。用蒸餾水稀釋色素濃縮液，調(diào)節(jié)其吸光值A(chǔ)590在0.5～0.6之間，即得樹(shù)脂純化實(shí)驗(yàn)中的色素粗提液試樣；以A590作為粗提液中綠變色素濃度的衡量指標(biāo)。

1.2.2 大孔樹(shù)脂的篩選 每種樹(shù)脂準(zhǔn)確稱取5g，加入制備好的色素提取液50mL，于100mL三角瓶中，置于搖床振蕩24h（25℃，100r/min），過(guò)濾，測(cè)定濾過(guò)液吸光值A(chǔ)5901；吸附前色素粗提液吸光值記為A5900；用蒸餾水洗滌樹(shù)脂表面，再各用50mL 90%乙醇溶液于相同條件下解吸，過(guò)濾，測(cè)定解吸液吸光值記為A5902。吸附率及解析率計(jì)算公式如下[10]：

1.2.3 大孔樹(shù)脂純化綠變色素的條件優(yōu)化 將預(yù)處理后的SIPI-40樹(shù)脂裝入1cm×30cm的柱中，樹(shù)脂柱床體積（BV）20mL，待柱平衡后，取一定量按前述方法制備的色素粗提液，在不同條件下通過(guò)樹(shù)脂柱，以確定最佳的上樣體積、上樣流速、洗脫劑濃度和洗脫劑體積。

1.2.3.1 最佳上樣體積 將色素提取液以1mL/min流速通入樹(shù)脂柱，同時(shí)收集透過(guò)液，每5mL為一管，測(cè)定每管透過(guò)液的A590，以其為縱坐標(biāo)，以透過(guò)液體積為橫坐標(biāo)，繪制吸附曲線[11]，根據(jù)曲線確定最佳上樣量。

1.2.3.2 最佳上樣流速 取五份體積為2BV的色素提取液，分別以0.5、1、1.5、2及2.5mL/min的流速通入樹(shù)脂柱，收集透過(guò)液并測(cè)定其A590，計(jì)算不同流速下的吸附率，確定上樣流速。

1.2.3.3 洗脫劑濃度 各取2BV的色素提取液上柱，吸附1h，然后用3BV的蒸餾水洗脫，再分別用20%、40%、60%、80%、90%乙醇溶液及含0.1%HCl的90%乙醇溶液乙醇洗脫4BV，收集洗脫液，濃縮至2BV，測(cè)定洗脫液A590，計(jì)算解吸率。

1.2.3.4 洗脫曲線繪制 取2BV的色素提取液溶液上柱，流速1ml/min，先用3BV的蒸餾水洗脫，再用酸化的90%乙醇進(jìn)行洗脫，每5mL收集一管，并測(cè)定各管洗脫液A590，以洗脫液體積為橫坐標(biāo)，各收集管中洗脫液A590為縱坐標(biāo)，繪制洗脫曲線，收集色素富集區(qū)域的洗脫液，即為色素純化物；將這部分色素純化物濃縮凍干，得干燥的色素粉末，-20℃保存。

1.2.4 色素提取物純度的評(píng)價(jià) 由于大蒜綠變色素的結(jié)構(gòu)尚未明晰，無(wú)法通過(guò)與標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)照來(lái)準(zhǔn)確定量，其提取物的純度通常以色價(jià)來(lái)衡量。色價(jià)的測(cè)定過(guò)程及計(jì)算方法依據(jù)參考文獻(xiàn)進(jìn)行[10]。具體如下：稱取純化前色素粗提物及純化物固態(tài)樣品各0.05g，用pH3.0的HCl溶液溶解，定容至100mL。取1cm比色皿，以HCl溶液為空白，在波長(zhǎng)590nm下測(cè)定吸光度A。

色價(jià)的計(jì)算公式如下：

式中：A，樣品的吸光度；r，稀釋倍數(shù)；m，樣品的質(zhì)量（g）；E，色價(jià)。

2 結(jié)果與討論

2.1 大孔樹(shù)脂的篩選結(jié)果

表1 不同大孔樹(shù)脂對(duì)綠變色素的吸附及解吸效果Table 1 Absorption and desorption capabilities of different macroporous resin to garlic greening compounds

樹(shù)脂對(duì)色素的吸附效率的不同與樹(shù)脂本身的性質(zhì)有關(guān)。S-8屬于強(qiáng)極性樹(shù)脂，NKA-9、SIPI-40樹(shù)脂屬于中等極性樹(shù)脂，AB-8屬于弱極性樹(shù)脂。前期研究表明，綠變色素屬中等極性物質(zhì)，因此選擇上述幾種已得到廣泛應(yīng)用的極性樹(shù)脂來(lái)對(duì)綠變物質(zhì)進(jìn)行分離純化。由表1中數(shù)據(jù)可知，在靜態(tài)吸附和解吸實(shí)驗(yàn)中，幾種極性樹(shù)脂對(duì)于大蒜綠變物質(zhì)均具有一定的吸附效果，其中以SIPI-40的吸附率最高，達(dá)到91.9%；解吸率為84.7%。因此選擇SIPI-40樹(shù)脂作為介質(zhì)進(jìn)一步優(yōu)化其分離條件。SIPI-40在其他中等或弱極性物質(zhì)的分離中也得到了較好應(yīng)用，彭益強(qiáng)等曾利用SIPI-40樹(shù)脂從酶解液中吸附分離了1，3-丙二醇[12]。

2.2 SIPI-40樹(shù)脂純化綠變物質(zhì)的條件優(yōu)化

在樹(shù)脂分離條件優(yōu)化實(shí)驗(yàn)中，以綠變色素的粗提液為試液，測(cè)定其吸附前后的吸光值A(chǔ)590的變化，并按前述方法計(jì)算吸附率及解吸率。繪制動(dòng)態(tài)吸附及解吸曲線時(shí)，以A590為考察指標(biāo)。

2.2.1 最佳上樣量的確定 當(dāng)樹(shù)脂吸附飽和后，繼續(xù)增加上樣量會(huì)產(chǎn)生目標(biāo)吸附物質(zhì)的泄露現(xiàn)象。SIPI-40對(duì)大蒜綠變色素的吸附曲線如圖1所示，以透過(guò)液的吸光值A(chǔ)590為指標(biāo)考察透過(guò)液中色素物質(zhì)的濃度。由圖1中數(shù)據(jù)可知，當(dāng)上樣體積達(dá)到2BV后，隨著進(jìn)樣量的增加，透過(guò)液的A590逐漸增加；當(dāng)進(jìn)樣超過(guò)4BV，透過(guò)液中色素含量顯著增加，泄露現(xiàn)象明顯?？梢?jiàn)進(jìn)入樹(shù)脂床的提取液體積超過(guò)2BV時(shí)，樹(shù)脂對(duì)綠變物質(zhì)的吸附開(kāi)始趨于飽和，因此上樣量定為2BV。

圖1 SIPI-40樹(shù)脂對(duì)綠變色素的動(dòng)態(tài)吸附曲線Fig.1 Dynamic adsorption curve of Garlic greening compounds on SIPI-40 resin

2.2.2 最佳上樣流速的確定 樹(shù)脂對(duì)色素的動(dòng)態(tài)吸附效果與其接觸時(shí)間有關(guān)，因此上樣時(shí)樣液的流速?zèng)Q定了吸附率的高低。圖2所示為不同的進(jìn)樣流速下，樹(shù)脂對(duì)色素的吸附率?？梢?jiàn)，隨著流速的增加，樹(shù)脂對(duì)色素的吸附率逐漸下降，當(dāng)流速為0.5mL/min和1mL/min時(shí)，吸附率分別為94.3%和92.8%，考慮到實(shí)際操作效率，選擇上樣流速為1mL/min。

圖2 上樣流速對(duì)樹(shù)脂吸附效果的影響Fig.2 Effect of injecting velocity on adsorption rate of garlic greening compounds

圖3 不同洗脫溶劑對(duì)色素的解吸效果Fig.3 Desorption rate of garlic greening compounds by Macroporous Resin different eluent

2.2.3 最佳洗脫溶劑的確定 不同洗脫劑對(duì)綠變色素的解吸效果如圖3所示，隨著乙醇濃度的提高，洗脫劑對(duì)色素的洗脫能力逐漸增強(qiáng)，在乙醇濃度達(dá)到90%時(shí)，解析率為87.4%。為提高解吸效果，在此采用了向洗脫劑中加入助劑的方式提高解吸效果，經(jīng)過(guò)實(shí)驗(yàn)證實(shí)，加入低濃度的鹽酸（0.1%）可以顯著提高解析率。前期研究表明，色素在酸性條件下比較穩(wěn)定，因此加入鹽酸不會(huì)影響色素的性質(zhì)。最終選擇含有0.1%HCl的90%乙醇溶液為洗脫劑。

2.2.4 洗脫曲線及洗脫液體積的確定 色素粗提液在SIPI-40樹(shù)脂柱床上按上述確定的操作條件進(jìn)行上樣，吸附和水洗，然后在1mL/min的洗脫流速下采用酸化的90%乙醇溶液對(duì)色素進(jìn)行解吸。洗脫過(guò)程中，每5ml洗脫液收集為1管，洗脫液所用體積為4BV（80mL），共計(jì)16管。測(cè)定每管吸光值A(chǔ)590，以其為縱坐標(biāo)，以洗脫液體積（以BV計(jì)）為橫坐標(biāo)繪制洗脫曲線。洗脫曲線如圖4所示，由圖4可見(jiàn)，隨著洗脫的進(jìn)行，收集管中洗脫液的A590開(kāi)始逐漸增加，色素逐漸被解吸下來(lái)，洗脫液為1.5BV時(shí)，A590達(dá)到0.143，色素開(kāi)始被大量解吸。整個(gè)洗脫曲線呈峰形，說(shuō)明目標(biāo)分離物在尖峰處得到了富集。當(dāng)洗脫液體積達(dá)到3BV時(shí)，A590已下降為0.140左右，濃度較低；繼續(xù)洗脫，洗脫液吸光值繼續(xù)下降，因此設(shè)定整個(gè)洗脫體積為4BV，解吸可基本完成。根據(jù)曲線收集1.5BV到3BV這一階段的洗脫液，該部分為綠變色素經(jīng)過(guò)樹(shù)脂富集純化后得到的濃縮區(qū)帶，適用于后續(xù)研究。

綜合以上研究結(jié)果，SIPI-40樹(shù)脂富集分離大蒜綠變物質(zhì)的最佳操作條件為：首先控制進(jìn)樣的色素粗提液濃度使其A590為0.55左右，最大進(jìn)樣量為2BV，進(jìn)樣流速1mL/min，洗脫劑為含0.1%HCl的90%乙醇溶液，洗脫劑用量為4BV，洗脫液體積為1.5～3BV部分得到的洗脫液為色素富集帶，收集這部分洗脫液，濃縮凍干得到色素純化物粉末。

表2 SIPI-40樹(shù)脂純化前后的大蒜綠變色素提取物的色價(jià)Table 2 Color value of the garlic greening compound extracts before and after the separation

2.2.5 色素純化物純度評(píng)價(jià) 表2中的結(jié)果顯示，未經(jīng)樹(shù)脂柱純化的色素粗提液的凍干粉末的色價(jià)為10.4，主要是其中含有較高比例的雜質(zhì)，如糖類等。經(jīng)過(guò)樹(shù)脂柱的吸附純化后，大多數(shù)雜質(zhì)與色素組分得到了很好的分離，純化產(chǎn)物的色價(jià)為47.6，色素純度大大提高。

3 結(jié)論

本研究采用SIPI-40樹(shù)脂對(duì)大蒜綠變色素進(jìn)行了初步的富集分離，確定了樹(shù)脂分離的最佳條件：以0.5mg/mL的色素提取物水溶液進(jìn)樣，最大進(jìn)樣體積為2BV（柱床體積），進(jìn)樣流速1mL/min，洗脫劑為含0.1%HCl的90%乙醇溶液，洗脫體積為4BV，在此操作條件下測(cè)得的洗脫曲線峰形理想；純化后的色素提取物的色價(jià)提高到47.6，可見(jiàn)大孔樹(shù)脂SIPI-40可以實(shí)現(xiàn)對(duì)大蒜綠變色素的富集純化。色素組分經(jīng)樹(shù)脂法富集分離后，可進(jìn)一步選用適宜的分離手段完成對(duì)其的高度純化，進(jìn)而研究其結(jié)構(gòu)信息及相關(guān)性質(zhì)。

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